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SCHEDA FIRB
italiano - english
Unità di Ricerca
- Universita' degli Studi di ROMA "La Sapienza"
Dip. BIOTECNOLOGIE CELLULARI ED EMATOLOGIA , ROMA (RM) - Universita' degli Studi di ROMA "La Sapienza"
Dip. BIOTECNOLOGIE CELLULARI ED EMATOLOGIA , ROMA (RM) - Consiglio nazionale delle ricerche (CNR)
Istituto Tecnologie Biomediche , ROMA (RM) - Universita' degli Studi di NAPOLI "Federico II"
Dip. BIOLOGIA E PATOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE , NAPOLI (NA) - FONDAZIONE ANDREA CESALPINO
Laboratorio di Espressione Genica , ROMA (RM)
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Classificazione scientifico-disciplinare
- Area scientifico disciplinare: Scienze biologiche
Classificazione brevettuale
- CHEMISTRY; METALLURGY
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- MICRO-ORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF (biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, containing micro-organisms, viruses, microbial fungi, enzymes, fermentates or substances produced by or extracted from micro-organisms or animal material A01N63/00; food compositions A21, A23; medicinal preparations A61K; chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings, absorbent pads or surgical articles A61L; fertilisers C05); PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICRO-ORGANISMS (preservation of living parts of humans or animals A01N1/02); MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA (micro-biological testing media C12Q)
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
Classificazione geografica
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Parole Chiave
CROMATINA; METILAZIONE DEL DNA; POLI(ADP-RIBOSILAZIONE); ACETILAZIONE; FOSFORILAZIONE; MATRICE NUCLEAREEpigenetica e cromatina
Università degli Studi di Roma "La Sapienza"Abstract
La scelta del titolo "epigenetica e cromatina" (EpiChrom) per il progetto che qui di seguito presentiamo, deriva dalle caratteristiche proprie delle modificazioni dell'espressione genica che intendiamo studiare. Infatti, il termine "epigenetica" secondo una delle interpretazioni possibili, racchiude quei processi che non possono essere compresi nella definizione di gene e di genetica, includendo anche i meccanismi che regolano l'espressione del gene. Nella parola epigenetica "epi" indica tutto ciò che "circonda" la genetica intendendo per circondare tutto ciò che accade oltre ed intorno alla stretta informazione genetica. Questo termine si riferisce quindi a tutti i processi che giocano un ruolo chiave nella trasformazione dal genotipo al fenotipo. La scelta di concentrare la nostra attenzione sulla cromatina è dovuta alla necessità di limitare il campo dell' epigenetica a quei fenomeni che più strettamente riguardano le modificazioni strutturali e biochimiche del materiale genetico e che sono coinvolti nella modulazione dell'espressione genica. Sono state descritte varie modificazioni che possono intervenire sia direttamente sul DNA che su diverse proteine della cromatina. Inoltre, a dimostrazione di quanto siano complesse le regolazioni della struttura della cromatina è noto che la stessa proteina cromatinica può subire più di una sola modificazione. Per questa ragione ogni unità di ricerca di questo progetto si concentrerà sullo studio di alcuni aspetti del problema con l'intento di posizionare correttamente almeno qualcuna delle numerosissime tessere dell'enorme mosaico che può rappresentare la cromatina. Lo studio delle modificazioni epigenetiche non è semplice, infatti in alcuni meccanismi molecolari per sortire un effetto regolativo esse possono avvenire contemporaneamente ed è estremamente complesso definirne la sequenza temporale. Il fenomeno della condenzazione cromatinica, che induce silenziamento genico, puo essere considerato il fenomeno generale che connette le quattro modificazioni epigenetiche che saranno oggetto dello studio di questo progetto: metilazione, acetilazione, ADP-ribosilazione e fosforilazione. Dati in letteratura dimostrano che la proteina MeCP2, funziona come un sistema di trasporto che avvicina l'enzima "histone deacetylase" al DNA in modo che l'attività enzimatica possa esplicarsi de-acetilando il "core histones". Questo meccanismo prevede però che il DNA sia metilato, infatti MeCP2 lega il DNA solo in presenza di metili. E' a questo punto importante ricordare che i passi che portano alla metilazione del DNA sono correlati alla " poly(ADPribosyl)ation", infatti questa modificazione è coinvolta nel controllo del corretto pattern di metilazione del DNA, incluso lo stato non- metilato delle isole CpG. Le tre modificazioni epigenetiche appena riportate sono facilmente correlabili tra loro, meno ovvio è il ruolo della fosforilazione in questo scenario. E' comunque noto che l'enzima PARP1 responsabile dell' ADP-ribosilazione è presente nelle cellule sia in forma fosforilata che non-fosforilata. Grande attenzione sarà comunque concentrata nello studio del ruolo delle modificazioni epigenetiche nella modulazione dell'espressione genica. La metilazione del DNA e la ADP-ribosilazione saranno indagate come modificazioni enzimatiche correlate tra loro nella regolazione dell'epressione dei geni " housekeeping". Infatti, in questo progetto studieremo come i polimeri di ADP-ribosio siano coinvolti, come fattori non proteici, nel mantenimento dello stato non metilato del DNA delle isole CpG, condizione questa necessaria per garantire l'espressione dei geni connessi alle isole. La metilazione del DNA e la ADP-ribosilazione saranno studiate anche in relazione ad altri importanti processi quali: apoptosi, maturazione del virus Polioma, interazione alla matrice nucleare di virus Polioma e del virus di Epstein Barr (EBV). Particolare attenzione sarà concentrata nell'indagare la possibilità che un blocco dell'ADP-ribosilazione possa essere responsabile della iper-metilazione di geni con funzioni onco-soppressorie durante la carcinogenesi; sarà inoltre verificato se il rapporto metilazione/de-metilazione ha un ruolo nella regolazione dell'espressione di "cdk inhibitors" durante il differenziamento muscolare. Il controllo fine della regolazione della trascrizione è anche frutto delle modificazioni post-trascrizionali come fosforilazione e acetilazione. Nel contesto del progetto EpiChrom, diverse attività di ricerca contribuiranno allo studio dell' implicazione di modificazioni post-traduzionali di fattori trascrizionali nella regolazione della loro affinità e specificità di legame ai diversi promotori da regolare. Queste tasks saranno affrontate con la combinazione di approcci biochimici e genetici (studio di interazioni proteina-proteina, modificazioni post-traduzionali di fattori trascrizionali, co-attivatori e co-repressori, produzione di mutanti). Inoltre, saranno utilizzati saggi funzionali per studiare la regolazione della trascrizione attraverso la tecnica della immuno-precipitazione della cromatina (ChIp) che permette di studiare l'impatto delle varie modificazioni direttamente sulla regolazione della trascrizione guidata da promotori prescelti. Un saggio modificato di ChIp, permetterà di studiare fattori trascrizionali, co-attivatori e co-repressori in maniera dinamica. In particolare, saranno studiati a fondo come sistemi modello: 1) i membri della famiglia di fattori trascrizionali p53, coinvolti nell'arresto della crescita e nell'apoptosi; 2) il fattore trascrizionale E2F1 essenziale sia per la progressione del ciclo che nella apoptosi. E' importante specificare che questo progetto è orientato alla ricerca di base, ma ciò nonostnte, esso potrebbe fornire importanti conoscenze per l' identificazione e lo sviluppo di molecole con potenzialità terapeutiche. In aggiunta, esso contiene uno specifico "work-package" che verte sullo sviluppo di nuove tecnologie per approcciare lo studio della cromatina in maniera dinamica e funzionale. Le nuove tecnologie che saranno proposte includono: a) la microscopia a forza atomica (AMF) per lo studio dinamico delle variazioni delle fibre cromatiniche a livello nucleosomico; b) analisi dei profili di espressione attraverso l'uso dei "micro-arrays" e l'uso dell' immuno-precipitazione della cromatina per lo studio in vivo dell'effetto dell' acetilazione degli istoni sulla regolazione della trascrizione di uno specifico promotore; c) un saggio modificato di ChIp, che permetterà di studiare fattori trascrizionali, co-attivatori e co-repressori in maniera dinamica. Un importante novità sara rappresentata dall'uso accoppiato delle tecniche di ChIp e di AMF per indagare modificazioni epigenetiche di fattori trascrizionali, co-repressori e co-attivatori con il rimodellamento della cromatina; d) la progettazione e la realizzazione/selezione di fattori trascrizionali sintetici su base zinc finger, capaci di modificare la trascrizione di specifici geni bersaglio. I fattori trascrizionali sintetici possono rappresentare un ottimo sistema modello per lo studio fine dei meccanismi che regolano la attività e la selezione di specifici fattori trascrizionali essenziali per la determinazione del destino cellulare (proliferazione/arresto della crescita, proliferazione/apoptosi). La comprensione del meccanismo funzionale della loro attivazione si spera possa condurre all' identificazione di nuovi target per l'approccio terapeutico in pazienti con tumori e altre malattie croniche. <<<Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
PAOLO AMATI, Universita' degli Studi di ROMA "La Sapienza"Obiettivo del Finanziamento
All'interno dei nuclei il DNA è organizzato nella cromatina. Nell'era della post-genomica lo sforzo maggiore è teso alla comprensione di come la cromatina, lo stampo fisiologico di tutte le informazioni genetiche degli eucarioti, è soggetta a diverse modificazioni post-sintetiche. Queste modificazioni coinvolgono primariamente sia gli istoni del "core" che quelli del DNA internucleosomiale, ma giocano un ruolo molto importante nella modulazione dei fattori di trascrizione, dei co-attivatori e dei co-repressori. Stanno inoltre crescendo le evidenze che indicano come le modificazioni post-traduzionali possono dirigere alcuni fattori di trascrizione su uno o un sottogruppo di geni allo scopo di associare a differenti stimoli specifici, adeguate risposte cellulari.Il processo di rimodellamento cromatinico è in parte dovuto a proteine chiamate "fattori di rimodellamento". Consideriamo in particolare CAF-1 che inserisce particelle "core" sul DNA appena replicato. CAF-1- che è un complesso trimerico - svolge questa funzione attraverso la sua subunità più grande che è in grado di legare selettivamente PCNA, una proteina coinvolta nella replicazione. E' interessante notare che HD1 (istone deacetilasi1) è anche associato con CAF-1 attraverso il legame con la sua subunità più piccola. E' sempre più evidente che la struttura e le funzioni della cromatina dipendono da meccanismi epigenetici. In questo specifico caso HD1 potrebbe intervenire nella deacetilazione degli istoni del core quando essi sono situati in regioni di DNA che devono assumere una struttura condensata e silente.
Vari processi ed enzimi partecipano al " rimodellamento cromatinico". La metilazione del DNA è l'unica modificazione del DNA eucariotico, mentre numerose modificazioni epigenetiche coinvolgono le proteine cromatiniche. In questa ricerca i nostri studi saranno incentrati sulla metilazione del DNA, l'acetilazione, la poli(ADP-ribosil)azione e la fosforilazione.
Iin questo progetto la correlazione tra metilazione del DNA ed espressione genica verrà affrontato ponendo l'attenzione sulle "isole CpG", che hanno una lunghezza compresa tra 500-2000 bp e sono state trovate frequentemente nella regione promotrice 5' dei geni costitutivi e si sovrappongono per una estensione variabile al gene stesso. Diversi dati evidenziano che la trascrizione del gene, correlata con le "isole CpG", è inibita quando queste regioni sono metilate. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che le "isole CpG" non sono di per sé non metilabili. Sono state fatte un gran numero di ricerche allo scopo di chiarire perché le "isole CpG" rimangono protette dall'azione della DNA metil-transferasi a dispetto della loro localizzazione sulla regione promotrice dei geni costitutivi che si trovano nella cromatina decondensata permanentemente accessibile ai fattori di trascrizione. Una questione che deve ancora essere risolta concerne l'identificazione di differenti segnali "cis-acting" e fattori proteici "trans-acting" che possono svolgere un ruolo chiave nella definizione del quadro bimodale di metilazione coinvolto nel differenziamento cellulare e nell'espressione genica. Inoltre nulla si sa a proposito del meccanismo/i attraverso cui le "isole CpG" - che rimangono protette dalla metilazione nelle cellule normali - diventano suscettibili alla metilazione nelle cellule neoplastiche.
Poiché numerose strategie sperimentali in vivo hanno fornito dati che permettono di concludere che il processo di poli(ADP-ribosil)azione è coinvolto nella protezione dello stato non metilato del DNA genomico e in particolare delle "isole CpG, uno degli obiettivi del programma sarà di verificare se i polimeri di ADP-ribosio rappresentano un fattore trans-acting non proteico capace di proteggere le isole CpG dalla metilazione nella cromatina.
La metilazione del DNA e la poli(ADP-ribosilazione) saranno anche studiate rispetto ad un altro processo cellulare molto importante quale è l'apoptosi. Verrà poi considerato il coinvolgimento di queste due modificazioni epigenetiche nella maturazione del virus Polioma e nel regolare specifiche interazioni funzionali dei virus Polioma ed EBV la matrice nucleare. Una particolare attenzione verrà rivolta alla possibilità che l'inibizione della poli(ADP-ribosil)azione sia responsabile dell'ipermetilazione degli oncosoppressori durante la carcinogenesi e si cercherà di verificare se il processo di metilazione/demetilazione del DNA giocano un ruolo nel regolare l'espressione di p57 durante il differenziamento muscolare.
L'acetilazione e la fosforilazione saranno principalmente considerate rispetto al ruolo che svolgno nel modulare fattori di trascrizione, co-attivatori e corepressori e la loro scelta tra diversi promotori bersaglio. Si cercherà di stabilire l'impatto di modificazioni post-traduzionali a carico di co-attivatori e co-repressori in risposta all'attivazione di specifiche vie di segnalazione nel determinare la formazione di complessi trascrizionali attivi o repressi. Particolare attenzione verrà rivolta alla identificazione di modificazioni post-traduzionali di p300 e pCAF che ne modulano l'attività acetiltransferasica e la capacità di interagire funzionalmente con i fattori basali della trascrizione. Particolare attenzione sarà rivolta all'importanza di modificazioni epigenetiche di p73 e p63 nel modulare le interazioni proteina-proteina e il legame al DNA che dirigono la trascrizione o inducono l'apoptosi.
Sarà studiato il ruolo della proteine HMGA nel differenziamento in senso adipocitario ed ematopoietico delle cellule ES. In particolare si pensa di poter definire il significato dell'acetilazione delle proteine HMGA in processi quali espressione genica e differenziamento.
Parte della ricerca sarà rivolta all'identificazione e caratterizzazione dei geni regolati da HMGA mediante analisi dei profili di espressione. Comparando il profilo di espressione genica di cellule ES hmga1-/-, di cellule hmga1-/- trasfettate con HMGA1 wild type e HMGA1 K65K71, sarà possibile valutare l'importanza dell'acetilazione delle proteine HMGA sull'espressione genica durante il differenziamento adipocitario ed ematopoietico.
Il progetto propone quindi di utilizzare un vasto approccio post-genomico per raggiungere una completa valutazione della necessità dei cambiamenti epigenetici, come le modificazioni post-traduzionali dei fattori di trascrizione, dei co-attivatori, dei co-repressori della trascrizione, nel dirigere la scelta tra differenti bersagli allo scopo di attivare coordinati e complessi programmi di trascrizione che alla fine risultano in definite risposte fisiopatologiche. I classici approcci biochimici e genetici verranno affiancati dalle moderne tecniche di immuniprecipitazione della cromatina. Inoltre, il progetto include un "work-package" incentrato sullo sviluppo di nuove tecnologie per affrontare lo studio funzionale della cromatina in maniera dinamica.
Le nuove tecnologie che verranno utilizzate si occuperanno:
a) dello studio di una tecnica innovativa basata sulla immunoprecipitazione della cromatina per l'identificazione in vivo di nuovi geni bersaglio per specifici fattori trascrizionali;
b) dell' uso di "screening" per doppio ibrido e la tecnica nota come "fishing for partners", per l'dentificazione di nuovi interattori delle proteine HMGA1 e HMGA2;
c) della sintesi e dell'espressione regolata in cellule di domini proteici mutanti in grado di interferire col network di fattori trascrizionali bHLHZip Myc/Max/Mad, un modulo funzionale che integra segnali esterni per determinare specifici programmi di espressione genica;
d) della progettazione e nella sintesi di fattori trascrizionali artificiali basati su modificazioni del dominio di legame al DNA "zinc finger";
e) di accoppiare l'uso di metodi immunologici di coimmunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con analisi di microscopia a forza atomica (AFM) allo scopo di studiare particolari regioni della cromatina associate con proteine - o con le loro isoforme modificate - coinvolte in specifici ruoli funzionali e/o strutturali della cromatina.
Numerosi meccanismi entrano in gioco e interagiscono tra loro allo scopo di ottenere un accesso regolato al DNA che produrrebbe contemporaneamente la replicazione del DNA e la regolazione della trascrizione.<<<
