RICERCA ITALIANA     

Sviluppo di un Lab-on-a-chip basato su tecnologia microelettronica e sua validazione biotecnologica

Università degli Studi di Bologna

Abstract

Il presente progetto di ricerca prevede la concezione, modellistica, progettazione, realizzazione, collaudo e validazione su importanti protocolli biologici di un Lab-on-a-chip in grado di controllare e spostare molteplicita' di oggetti biologici immersi in una soluzione fisiologica.
Gli obiettivi innovativi ed unici di questo progetto sono legati al fatto che la soluzione proposta dara' la capacita' di effettuare operazioni di controllo e movimentazione, spiegate in dettaglio nella descrizione dello Stato dell'arte, su moltitudini di SINGOLI oggetti biologici immersi in soluzione fisiologica, preservandone quindi la individualita' della risposta a differenti protocolli biologici. Questo aspetto è di particolare rilievo in quanto permettera' di eseguire esperimenti chiave per lo studio di nuovi farmaci e nuove procedure diagnostiche che sino ad oggi sono stati di fatto impossibili da realizzare a causa della eccessiva complessita e/o costo, oltre che, in alcuni casi, per la impossibilita' teorica con la strumentazione esistente. Il progetto sfrutterà l'esperienza pregressa delle unita' proponenti: nell'area dei biochip, sia in termini di concezione e progetto che in termini di applicazione a problemi biologici e medici, e della preparazione di sistemi nano- e microparticellari idonei al trasporto di precise quantita' di molecole ad attività biologica (es. farmaci, acidi nucleici), e si focalizzera' sulla incognita introdotta dalla presenza di soluzioni fisiologiche che sono per loro natura ricche di sali e quindi conduttive. Questo scenario verra' affrontato a piu' livelli strettamente interagenti tra di loro. La concezione e modellistica del lab-on-a-chip, responsabilita' di un gruppo di ricerca di origine ingegneristica, verra' portato avanti producendo e fornendo ai biologi strumenti di visualizzazione e simulazione che consentano di ottenere un rapido feedback sulle scelte progettuali che verranno fatte. La ricerca sulle potenziali applicazioni del biochip prodotto sarà focalizzata su argomenti di diagnostica molecolare basata su acidi nucleici e anticorpi monoclonali e su argomenti di veicolazione di farmaci biotecnologici. Successivamente, la validazione biologica del biochip vedra' i progettisti elettronici coinvolti nella interpretazione sperimentale dei dati in modo da capire i limiti delle scelte fatte e procedere con nuove iterazioni progettuali.

I risultati previsti di questa ricerca sono quindi riassumibili nei seguenti punti:

1) modellistica, progetto e collaudo elettrico di un lab-on-a-chip in grado di controllare individualmente ed in parallelo popolazioni di oggetti biologici, quali ad esempio cellule, batteri, microsfere e liposomi, in numeri superiori al migliaio;

2) produzione di prototipi in grado di dimostrare in condizioni sperimentali ben determinate il funzionamento del biochip secondo le specifiche date;

3) validazione su importanti protocolli biologici del lab-on-a-chip nel settore della diagnostica molecolare e della caratterizzazione di cellule normali e patologiche;

4) validazione su importanti protocolli biologici del lab-on-a-chip nel settore della progettazione e della veicolazione di farmaci ad attività nota;

5) dimostrazione di almeno due protocolli fortemente innovativi nel settore biotecnologico (uno di diagnostica basata su acidi nucleici, l'altro di diagnostica basata sull'utilizzo di anticorpi monoclonali)resi possibili grazie alle scoperte nel settore dei biochip prodotte da questa attivita' di ricerca. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

ROBERTO GUERRIERI, Universita' degli Studi di BOLOGNA

Obiettivo del Finanziamento

Lo sviluppo di metodologie avanzate analitiche e di bioseparazione basate su micro/macroarrays e su biosensori è uno degli obiettivi strategici della cosiddetta post-genomica, ma interessa settori applicativi strategici, quali l'oncologia predittiva, la diagnostica nel settore biomedico e alimentare, la ricerca farmaceutica.
Nonostante i continui progressi tecnologici, le strumentazioni attualmente presenti sul mercato soffrono di importanti limiti sia commerciali (alto costo di acquisto, manutenzione e utilizzo) che teorico-pratici (in molti casi l'analisi non è in tempo reale; in altri casi i metodi analitici non possono essere utilizzati nella bioseparazione).
In considerazione di quanto esposto, è di grande interesse lo sviluppo di un approccio mirante a sviluppare interi laboratori su di un substrato unico, i cosiddetti "Lab-on-a-chip". Questi oggetti hanno la potenzialità di ridurre le limitazioni precedentemente citate della tecnologia corrente grazie all'integrazione di molteplici passi di un esperimento su di un solo substrato che può essere di quarzo, per la sua stabilità meccanica e termica, o plastico, per la sua economicità. La principale limitazione degli approcci oggi disponibili è legata alla rigidità delle procedure che possono essere realizzate su di un substrato. Infatti l'uso di un substrato passivo del tipo di quelli oggi comunemente in uso richiede che si proceda ad una modifica del chip ogniqualvolta si debba cambiare l'esperimento.
Al fine di eliminare questi vincoli, i substrati attivi basati su tecnologia microelettronica permettono di integrare nel substrato del biochip circuiti che sono in grado di svolgere sia funzioni di attuazione che di tipo sensoristico.
Questo Progetto di ricerca prende spunto dallo sviluppo di un metodo di bioseparazione basato su microchip fabbricati su di un substrato attivo, prodotto con tecnologie microelettroniche compatibili con il flusso di fabbricazione dei circuiti integrati CMOS. Questa classe di microsistemi, studiata dal gruppo dell'Universita' di Bologna in cooperazione con aziende esterne, ha alcune caratteristiche innovative. In particolare, grazie all'uso di tecniche di progettazione basate sulla tecnologia dei circuiti integrati, essa permette di generare campi dielettroforetici che immobilizzano e consentono di manipolare singoli oggetti biologici, quali ad esempio cellule, liposomi o microsfere immersi in un liquido sovrastante il chip stesso e con esso in contatto. Un'importante caratteristica del lavoro svolto è la possibilità di controllare il funzionamento di questo "micro-manipolatore" tramite software compilato su di un computer, che funge da controllore. Questa peculiarità dell'approccio consente di progettare differenti esperimenti biologici, cambiando il software di controllo eseguito sul PC con importanti vantaggi in termini di flessibilità e costo.
La comprensione degli obiettivi di questo programma di ricerca puo' essere aiutata da un esame di alcune figure. La prima di queste spiega il principio generale ispiratore di questa architettura di biochip.

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In essa e' evidenziato un substrato realizzato tipicamente in silicio, anche se nei prototipi si possono utilizzare materiali tipici per la fabbricazione di schede per ridurre costi e tempi di realizzazione del prototipo. Su questo substrato viene creata una schiera regolare di elettrodi costruiti tramite una opportuna progettazione dei metalli di livello superiore. Questa superficie cosi' definita e' poi circondata da una barriera di materiale impermeabile che permette di coprire il substrato con del liquido opportuno, come ad esempio una soluzione fisiologica, contenente i microorganismi e/o cellule e le strutture veicolanti, realizzate ad esempio con microsfere. Agli elettrodi possono venire applicati dei potenziali opportuni che inducono campi elettrici variabili nel liquido. Questi campi elettrici possono formare dei campi dielettroforetici che agiscono sulle particelle immerse nel fluido, grazie al fatto che si creano forze associate principalmente alla presenza di gradienti di permittivita' dielettrica dei vari materiali presenti. Un aspetto essenziale mostrato in figura e' che questi campi formano configurazioni a gabbia chiusa, in grado di intrappolare in modo stabile particelle che in esse si vengano a collocare. Queste gabbie si vengono a formare quando gli opportuni potenziali sono applicati ai metalli presenti sulla schiera. Questi potenziali sono quindi controllabili via software, grazie alla possibilita' di integrare logica di controllo nel substrato di silicio. Il controllo dei potenziali permette di variare nel tempo la locazione delle gabbie chiuse come mostrato nelle figure successive.
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La prima immagine mostra il campo dielettroforetico risultante dalle simulazioni numeriche ed in particolare e' evidente una struttura di minimo, coincidente con la presenza di una gabbia dielettroforetica. Cambiando i potenziali sugli elettrodi, si puo' spostare la gabbia mantenendola chiusa e senza quindi perdere il controllo della particella in essa eventualmente racchiusa. L'immagine successiva evidenzia questo fatto e la possibilita' di spostare la particella sotto controllo software. Quanto qui descritto e' stato dimostrato sperimentalmente tramite prototipi basati sulla tecnologia delle schede stampate ed utilizzando come liquido acqua distillata nella quale sono state immerse delle microsfere aventi dimensione pari a 50 micron.

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Le precedenti immagini sono state acquisite tramite microscopio e mostrano lo stato iniziale di una particella che via software viene spostata dal centro verso sinistra. Tenendo ora conto del fatto che possono aversi molteplici gabbie e che queste possono essere portate in contatto tra di loro, e' possibile immaginare come sia possibile mettere in contatto, ad esempio, microsfere funzionalizzate con materiali opportuni e microorganismi e/o cellule di cui si vuole valutare la reazione al composto in esame.

Riassumendo quindi, le basi scientifiche che hanno permesso di concepire questa famiglia di microsistemi sono state oggetto di un lavoro pregresso condotto dal gruppo dell'Università di Bologna che ha portato al raggiungimento dei seguenti obiettivi:

1. Derivazione di un approccio dielettroforetico in grado di generare gabbie chiuse di campo compatibile con le tecnologie odierne di fabbricazione dei circuiti integrati CMOS submicrometrici; questo fatto è di particolare rilievo in quanto questa tecnologia deve essere compatibile sia con le esigenze di planarità del processo di fabbricazione (nessun passo tecnologico aggiuntivo è richiesto rispetto ad un processo standard fornito da una fonderia del silicio) che con i valori di tensione ammissibili, che sono limitati a quelli gestibili da un processo standard (2~3 V).

2. Fabbricazione di un dimostratore basato su tecnologia dei circuiti stampati a pitch fine, che dimostra la realizzabilità del modello sviluppato su scala multimicrometrica (~100 micron di dimensione caratteristica).

3. Estensione di questo approccio alla tecnologia dei circuiti integrati CMOS tramite il progetto di un primo dimostratore che sarà fabbricato nei prossimi sei mesi.

Esistono pertanto valide ragioni per proporre nuove applicazioni di questa strategia in settori biotecnologici che presentano un elevato interesse applicativo nel settore della diagnostica, nel settore dell'oncologia predittiva e nel settore della farmacogenomica. Questa estensione risulta essere però ostacolata da un fenomeno ben noto in letteratura legato alla necessità di manipolare oggetti biologici in soluzione fisiologica salina. La soluzione correntemente disponibile non è in grado di gestire liquidi con significative presenze ioniche e quindi è limitata a gestire lieviti ed altri micro-organismi particolarmente "robusti" dal punto di vista della resistenza alla carenza di sali. I problemi però introdotti dal liquido conduttivo sono molteplici e tutti di difficile soluzione. Emergono tra gli altri i problemi di tipo elettrolitico, indotti dal passaggio di correnti in un fluido ricco di ioni, i riscaldamenti localizzati del liquido indotti dal passaggio delle stesse correnti ed in fine la generazione di gas agli elettrodi. Questo genere di problemi è di natura fondamentale e richiede un ripensamento delle tecniche con cui i circuiti sono stati progettati. Lo sviluppo di nuovi microsistemi in grado di gestire adeguatamente ambienti salini richiede uno studio a più livelli dello scenario complessivo: è necessario infatti avere una adeguata comprensione dei modelli fisici in grado di descrivere il microsistema, per poi passare ad una realizzazione dello stesso tramite nuove tecniche architetturali e circuitali e, finalmente, ad una valutazione delle scelte fatte applicando il microsistema ad un insieme di problemi e metodologie di rilievo nel settore medico e biologico, scelte opportunamente per la loro rappresentatività.

A titolo di esempio, sarà necessario dimostrare che il biochip così progettato da un lato consenta analisi di tipo diagnostico (ibridazioni molecolare, fenotipizzazione di cellule etc.), dall'altro permetta esperimenti di bioseparazione associati ad un mantenimento delle proprietà biologiche delle cellule separate, ed infine sia utilizzabile dall'industria farmaceutica per la validazione dell'effetto di quantità note di biomolecole ad attività farmacologica su cellule bersaglio.
Per raggiungere questi obiettivi è indispensabile realizzare un gruppo di ricerca che presenti competenze di eccellenza e documentata attività pregressa nei settori dell'ingegneria elettronica, della biologia e genetica molecolare, dell'immunologia e oncologia, della tecnologia dei biomateriali.

In questo settore l'Unità di Ricerca afferente al Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare e al Centro di Biotecnologie dell'Università di Ferrara ha raggiunto i seguenti obiettivi:

1. Messa a punto di strategie diagnostiche in biomedicina basate sull'utilizzo del biosensore BIAcore-1000 (Pharmacia Biosenors) per identificare infezione da HIV-1 in soggetti a rischio di AIDS (Bianchi et al., Clin. Diagn.Virol. 8: 199-208);

2. Messa a punto di strategie diagnostiche in biomedicina basate sull'utilizzo del biosensore BIAcore-1000 (Pharmacia Biosenors) e applicate all'identificazione delle mutazioni DF508 e W1282X del gene CFTR, base molecolare di alcune forme di CF (fibrosi cistica) (Feriotto et al., Human Mutation 18: 70-81; Feriotto et al., Human Mutation 13, 390-400);

3. Identificazione di molecole a DNA in grado di modificare l'espressione genica (molecole decoy) interferendo con l'interazione tra fattori di trascrizione (ad esempio NF-kB, Sp1, RF-X) e promotori di geni bersaglio (ad esempio quelli codificanti il recettore degli estrogeni, la proteina HLA-DRA, la globina gamma)(Mischiati et al., J. Biol. Chem., 274, 33114-33122, 1999; Mischiati et al., J.Virol. 74: 8989-9001, 2000)(va sollolineato che queste ricerche permettono di eseguire gli esperimenti di delivery di biomolecole ad azione farmacologica utilizzando il biochip con modelli sperimentali già evalidati);

4. Caratterizzazione di nuovi induttori del differenziamento eritroide delle cellule K562, con particolare riferimento a molecole in grado di legare il DNA (Osti et al., Haematologica, 1997; 82(4):395-401; Bianchi et al., Biochem. Pharmacol., 60: 31-40, 2000; Bianchi et al., Br.J.Haematol., 104: 258-265, 1999; Bianchi et al., Br.J.Haematol., 113: 951-961, 2001)(queste ricerche permettono di avere sistemi altamente investigati allo scopo di una validazione delle applicazioni del biochip nel delivery di farmaci);

5. Messa a punto di metodologie basate sul BIAcore per lo sviluppo di farmaci antitumorali (Bianchi et al., Biochem J. 1997; 326,919-27; Rutigliano et al., Int J Oncol, 1998; 12(2):337-43; Gambari, Am. J. Pharmacogenomics 1: 119-135, 2001; Gambari et al., J. Pharmacol. Exp. Therapy, 294, 370-382, 2000);

6. Identificazione molecolare di OGM (ad esempio la soia transgenica RoundUp-Ready) utilizzando biosensori e amplificazione PCR.

Infine, l'Unità di Ricerca dell'Università di Perugia ha da tempo sviluppato tecnologie atte a (a) veicolare oligonucleotidi ed altre biomolecole con microsfere (b) veicolare oligonucleotidi ed altre biomolecole con liposomi (Nastruzzi et al., J Control Release, 2000; 68(2):237-49).

In relazione alla capacità tecnologica maturata negli anni, l' U.O. Perugia prevede di ottenere i seguenti risultati:

(1) Selezione di sistemi microparticellari che presentino prestaziono ottimali per essere usate in applicazione su ?Lab-on-a-chip? per validazioni biofarmaceutiche. Inoltre saranno sviluppate liposfere da utilizzare in esperimenti di validazione del Lab-on-a-chip con sistema di riscaldamento controllato. In questo modo sarà possibile avvicinare la liposfere a cellule per poi provocarne la fusione in modo controllato a basse temperature per facilitare il rilascio delle sostanze incapsulate.

(2) Produzione di liposomi semplici con caratteristiche dimensionali diverse per validare le possibilità di utilizzare un Lab-on-a-chipcome sistema per classificazione dimensionale, di liposomi contenenti modificatori della risposta biologica come acidi nucleici da usare in esperimenti di trasfezione cellulare controllata su Lab-on-a-chip. Infine saranno prodotti liposomi e niosomi funzionalizati con liganti specifici per vari recettori cellulari. Questi ultimi prodotti saranno impiegati in esperimenti di validazione del Lab-on-a-chip come sistema per studi di ibridazione molecolare e cellulare.

(3) Sviluppo di sistemi microparticellari a base di alginato sterili per applicazioni su Lab-on-a-chip con cellule in coltura senza
causarne la contaminazione.

Va sottolineato che questi due filoni sperimentali permettono di possedere già un numero consistente di formulazioni liposomali e microsfere, indispensabili per valutare il biochip in applicazioni di bioseparazione, di diagnostica molecolare e di farmacologia applicata, garantendo molteplici modalita' di veicolazione.

Questo Progetto, pertanto, è basato sulla collaborazione e sinergia di tre gruppi di ricerca, appartenenti a settori scientifico-disciplinari differenti (ingegneria elettronica, biomedicina, tecnica farmaceutica) in grado di garantire il raggiungimento degli obiettivi proposti.
Nei rispettivi settori, i ricercatori impegnati nel Progetto hanno dimostrato ampiamente il raggiungimento di un elevato standard scientifico, basato su pubblicazioni in riviste prestigiose nei rispettivi settori e nello sviluppo e deposito di brevetti.

Riassumendo gli obiettivi che si intende raggiungere con questo progetto sono i seguenti:

1) comprensione dei fenomeni relativi alla movimentazione di oggetti di rilievo biologico in soluzioni fisiologiche, conseguito dal Workpackage 1

2) progetto di un dimostratore che evidenzi come sia possibile affrontare e risolvere i problemi generati dalle esigenze precedentemente descritte;

3) collaudo elettrico dello stesso per dimostrarne la funzionalita' in presenza di liquido fisiologico ed microsfere;

4) validazione del microsistema tramite la sua applicazione ad impegnativi protocolli di biologia molecolare e diagnostica.<<<

Durata

36 mesi