RICERCA ITALIANA     

Basi ereditarie della suscettibilità allo sviluppo dei tumori

Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro - Genova

Abstract

Il rischio genetico di cancro varia notevolmente tra popolazioni diverse ed individui diversi. Da un punto di vista formale, i geni responsabili del rischio di cancro possono essere classificati in geni ad alta e geni a bassa penetranza. I primi sono stati identificati per mezzo di analisi di linkage nelle famiglie, mentre abbiamo finora poche informazioni sui geni a bassa penetranza che tuttavia, sulla base delle frequenze geniche, possono avere un peso notevole nel contribuire al rischio di cancro nella popolazione. I geni di suscettibilità al cancro possono avere un'ampia o una ristretta specificità nei riguardi degli organi bersaglio; essi possono influenzare il rischio di cancro perché implicati in una specifica via biochimica nella cellula, perché alterano il tasso di mutazione (mutation rate) globale, perché influenzano l'apoptosi, o attraverso altri meccanismi. Questa proposta è interamente focalizzata sul rischio di cancro ereditario. Data la complessità del problema, abbiamo deciso di affrontarlo da varie angolazioni, ed abbiamo quindi strutturato il progetto in due distinti sottoprogetti (worlpackages).
1. Meccanismo d'azione di geni di suscettibilità al cancro già noti. La comprensione dei meccanismi è cruciale per comprendere il cancro; al tempo stesso, ciascuna mutazione che sia in grado di aumentare il rischio di cancro di uno o più ordini di grandezza costituisce un elemento interessante per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici. Nello specifico, mutazioni p53, responsabili della sindrome di Li-Fraumeni, verranno analizzate mediante saggi di trascrizione in cellule di lievito ed umane, allo scopo di classificare le proteine mutanti in termini di alterazioni del legame al DNA, spettro di transattivazione, stabilità in vivo e dominanza. Per quanto riguarda i geni BRCA1 e BRCA2, specifiche mutazioni identificate nei pazienti saranno correlate all'età di comparsa del tumore, al suo tipo e localizzazione (seno o ovaio) ed al decorso clinico. Per quanto riguarda il gene CDKN2A, implicato nel melanoma familiare, concentreremo la nostra attenzione particolarmente sulla mutazione G101W, poiché il corrispondente gene è stato identificato come fondatore nella popolazione ligure con melanoma familiare. Gli eterozigoti per questa mutazione presentano un'anomala localizzazione subcellulare della proteina, il che è indice di aplo-insufficienza. Studieremo ulteriormente questo fenomeno, perché una localizzazione anomala può essere la manifestazione visibile di alterazioni nelle interazioni proteina-proteina. In tutti questi casi, i geni ad alta penetranza implicati sono probabilmenteo direttamente coinvolti nella via che porta al cancro, o nel causare apoptosi ("gatekeepers"). Un'altra categoria di geni ad alta penetranza ("caretakers") comprende geni implicati in processi che alterano il tasso di mutazione. Per quanto riguarda le mutazioni nei geni implicati nel MMR e responsabili dell'HNPCC, controlleremo sistematicamente quali tipi di microsatelliti siano specificamente influenzati e correleremo le mutazioni dei geni bersaglio più frequentemente interessati con il decorso clinico. Inoltre, poiché i geni che contengono microsatelliti nelle regioni codificanti sono potenziali bersagli, useremo un approccio "in silico" per la ricerca sistematica di tali geni, verificheremo se essi siano effettivamente mutati nei tumori HNPCC e stabiliremo il loro ruolo nella via che conduce al carcinoma. Per quanto riguarda l'atassia telangiectasia (AT), è noto che pazienti AT presentano un alto rischio di leucemia delle cellule T, caratterizzata da traslocazioni cromosomiche: intendiamo investigare se queste possano derivare dalla presenza di attività RAG in cellule linfoidi mature nelle quali il prodotto del gene ATM sia difettivo. Ciò implicherebbe che il processo di leukemogenesi nei pazienti AT possa essere la conseguenza di un "misfiring" della funzione normale del complesso RAG nella revisione del recettore, come se il processo maligno fosse capace di parassitizzare un peculiare meccanismo molecolare richiesto per la fisiologia della cellula linfoide.
2. Identificazione di nuovi geni di suscettibilità al cancro. Nell'uomo, la ricerca di tali geni si deve basare sulla disponibilità di famiglie adatte: useremo questo approccio in famiglie con un eccesso di cancro del colon-retto nelle quali sia stato escluso il ruolo di APC o dei geni dell'HNPCC. Abbiamo già a disposizione materiale da molte famiglie adatte a questo approccio. In alternativa, è possibile usare un approccio di genetica classica in altri animali. Intendiamo sfruttare le notevoli differenze nella predisposizione genetica al cancro del fegato in due ceppi di ratto, BN e F344, allo scopo di mappare i loci implicati. E' interessante notare che gli ibridi F1, come i parentali BN, hanno una bassissima incidenza di epatoma, il che indica che in questo sistema una bassa incidenza di cancro è dominante sull'alta incidenza, come se i ratti BN avessero un gene che li protegge dal cancro del fegato. L'identificazione di questo gene e del suo omologo umano sarà di grande interesse. Venendo ai geni a bassa penetranza, è evidente che questi devono essere identificati prima che possano essere investigati. Una notevole difficoltà da questo punto di vista deriva dal fatto che l'analisi di linkage nelle famiglie umane o anche le differenze tra ceppi in altri mammiferi può difficilmente essere usata per questo scopo, poiché la probabilità di errori di classificazione fenotipica sarebbe troppo alta. Pertanto occorre esplorare altri approcci. Innanzitutto intendiamo investigare la penetranza incompleta che compare caratteristicamente negli eterozigoti, virtualmente per qualsiasi gene del cancro ad alta penetranza. Nello specifico, in soggetti che sono eterozigoti per mutazioni patogenetiche nei geni BRCA1 o BRCA2, CDKN2A, o nei geni del HNPCC, verificheremo con l'uso di appropriati polimorfismi genetici, il possibile effetto "modificatore" sulla penetranza di diversi geni candidati. Questi geni verranno selezionati sulla base di interazioni note o probabili con il principale gene di suscettibilità, ed anche sulla base di altre informazioni. In secondo luogo, intendiamo utilizzare un approccio ad ampio spettro sull'intero genoma, basato sul linkage disequilibrium. Data una popolazione inbred relativamente piccola, assumiamo che si verifichi in una persona una mutazione che comporti un aumento nel rischio di cancro, per esempio, di cinque volte. La corrispondente regione cromosomica è riconoscibile attraverso un aplotipo ancestrale, che verrà gradualmente ridotto per effetto della ricombinazione genetica (meiotica). Tuttavia questo processo è molto lento. Sulla base di stime correnti, dopo circa cento generazioni può ancora essere presente una frazione di circa 2 centimorgans dell'aplotipo ancestrale, in linkage disequilibrium con la mutazione in questione. Dunque, uno studio caso-controllo nella popolazione attuale avrà una buona probabilità di rivelare le mutazioni ancestrali, e di conseguenza, di identificare i corrispondenti loci genetici per mezzo del "positional cloning" o semplicemente sfruttando le informazioni del progetto Genoma Umano. In conclusione, questo progetto utilizzerà una varietà di approcci in vista del fine comune di migliorare la nostra conoscenza della componente ereditaria del cancro. Il vantaggio del nostro gruppo di ricerca è che esso è fortemente interattivo, come è documentato dalle numerose pubblicazioni in collaborazione. Inoltre un importante vantaggio sarà quello di poter condividere risorse biologiche e umane (pazienti): per esempio gruppo di famiglie con rare forme di cancro familiare o con specifiche mutazioni germinali associate con un alto rischio di cancro. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Liliana VARESCO, ISTITUTO NAZIONALE PER LA RICERCA SUL CANCRO - GENOVA

Obiettivo del Finanziamento

Questo progetto si pone due specifici obiettivi, indicati di seguito come (1) e (2). Ciascuno dei due obiettivi sarà perseguito per mezzo di una varietà di approcci, elencati nei sottotitoli che seguono.

1. Definire il meccanismo d'azione di geni già noti, avere un effetto importante nel determinare il rischio di sviluppare il cancro.
a. Determinare a livello molecolare, con saggi funzionali appropriati (transattivazione trascrizionale, dominanza dell'allele mutante, stabilità in vivo) le proprietà di mutazioni p53 presenti in pazienti Li-Fraumeni.
b. Determinare, attraverso un saggio di immunoprecipitazione della cromatina, lo spettro di geni bersaglio di specifici mutanti p53 e correlarlo con i rispettivi fenotipi.
c. Identificare nuove mutazioni patogenetiche di BRCA1 e BRCA2 sia nelle regioni codificanti che in quelle non codificanti, ed utilizzarle per comprendere il meccanismo di patogenicità di queste e di altre mutazioni note.
d. Determinare e analizzare le correlazioni genotipo-fenotipo in soggetti eterozigoti per mutazioni ai loci BRCA1 o BRCA2, con particolare riguardo all'età di comparsa, all'organo bersaglio, al tipo istologico di tumore ed al decorso clinico.
e. Correlare, in pazienti con HNPCC, l'età di comparsa ed il decorso clinico del cancro del colon con mutazioni specifiche in particolari geni HNPCC.
f. Definire in che misura mutazioni in geni candidati contenenti microsatelliti possano effettivamente contribuire alla cancerogenesi e/o alla progressione tumorale in pazienti HNPCC.
g. Determinare il ruolo della metilazione al promotore rispetto ad altri meccanismi di perdita, silenziamento o inattivazione (dell'allele non mutato) nella via che porta al cancro del colon in eterozigoti per mutazioni germinali nei geni HNPCC.
h. Determinare il meccanismo attraverso il quale geni identificati nel ratto con analisi genetica siano in grado di conferire resistenza allo sviluppo di epatomi e valutare la loro rilevanza nello sviluppo del cancro nell'uomo.
i. Stabilire la penetranza di particolari mutazioni CDKN2A e determinare altri fattori genetici (in particolare nel gene del recettore 1 della melanocortina e nel gene della ciclina D1) che possono modificare la penetranza di mutazioni CDKN2A nel causare il melanoma.
j. Determinare il meccanismo che può contribuire allo sviluppo del melanoma in presenza di una particolare mutazione nel gene CDKN2A, G101W, presente con alta frequenza nella popolazione italiana nord-occidentale.
k. Determinare se e in che modo l'alta incidenza di leucemie/linfomi di cellule T in pazienti con atassia telangiectasia possa derivare da traslocazioni cromosomiche attribuibili ad attività RAG in cellule linfoidi mature in presenza di una proteina ATM non funzionale.
l. Determinare, attraverso saggi di accessibilità della cromatina, fosforilazione degli istoni, riparazione delle rotture del DNA a doppia elica (DSB), ed apoptosi stimolata da DSB non riparate, il ruolo della proteina ATM nel limitare l'attività RAG alla ricombinazione V(D)J.

2. Identificazione di nuovi geni di suscettibilità al cancro e di geni che possono modificare il rischio di cancro attraverso qualsiasi meccanismo.
a. verificare se polimorfismi all'interno dei geni BRCA1 e BRCA2 possano influenzare, in cis o in trans, la penetranza di mutazioni patogenetiche in questi stessi geni.
b. Identificare geni che possano influenzare la penetranza, l'organo bersaglio (seno vs ovaio) o il fenotipo tumorale di persone appartenenti a famiglie con alta incidenza di cancro del seno/ovaio, investigando varianti polimorfiche di geni implicati nel metabolismo dei cancerogeni (GSTP1), sorveglianza immunitaria (TNF-a, HSP70-2), risposta al danno del DNA (OGG1), protezione dallo stress ossidativo (MnSOD), controllo del ciclo cellulare (prohibitin), metabolismo dei lipidi (PPARg2, 192C>G).
c. Isolare nuovi potenziali "geni BRCA" attraverso l'identificazione di famiglie con frequente cancro del seno/ovaio non legato a BRCA1 o BRCA2, ed analizzarli mediante positional cloning.
d. Identificare, attraverso l'analisi genetica di incroci tra ceppi, loci genetici che influenzano il rischio di cancro nel ratto conferendo aumentata suscettibilità o resistenza allo sviluppo di epatomi.
e. Identificare nuovi geni che possano essere responsabili dello sviluppo del cancro ereditario del colon-retto (HCRC) e/o cancro colorettale familiare (FCRC) mediante analisi di linkage in famiglie con alta incidenza di cancro colorettale (CRC) non associato ad alcuno dei geni HNPCC.
f. Identificare i geni potenzialmente responsabili dell'HCRC e/o FCRC - associati o non associati a geni HNPCC noti - mediante algoritmi bio-informatici appositamente sviluppati.
g. Trovare polimorfismi nei geni candidati o EST identificate sotto (f) e misurare in studi di associazione le frequenze alleliche in pazienti con adenoma e CRC; eseguire, per i migliori candidati, analisi di linkage o diretta ricerca delle mutazioni in modo da ottenere la prova definitiva del loro ruolo patogenetico.
h. Identificare il gene di suscettibilità all'adenoma polmonare Pas1 associato al gene Kras2 sul cromosoma 12p12; identificare varianti alleliche di Kras2 e/o geni vicini che possano influenzare lo sviluppo e/o il decorso clinico dell'adenocarcinoma del polmone.
i. Identificare nuovi geni che aumentano il rischio di cancro con bassa penetranza mediante studi di associazione che sfruttino il linkage disequilibrium tra aplotipi basati su microsatelliti o SNP con gli stessi geni in popolazioni con limitato flusso genico, come le popolazioni della Sardegna, del Cilento o di certe aree della Nigeria occidentale.

Con riferimento agli obiettivi di cui sopra, e tenendo in considerazione alcuni risultati preliminari già disponibili, la durata triennale del progetto, le risorse disponibili e richieste, i risultati attesi possono essere elencati come segue:
-p53
(i) Correleremo in lievito proprietà funzionali rilevanti (spettro di transattivazione trascrizionale, termostabilità e dominanza dell'allele mutante) di 24 mutanti p53 a mutazioni specifiche. La dominanza dell'allele mutante sarà di particolare interesse perché soltanto membri di famiglie con mutazioni al di fuori della regione di legame al DNA hanno mostrato perdita di eterozigosità nei tumori maligni.
(ii) Stabiliremo in linee cellulari umane, mediante un approccio di PCR-ChIP, la specificità di legame di proteine mutanti p53 a geni bersaglio implicati nella progressione del ciclo cellulare e nell'apoptosi.
(iii) Con l'aiuto di banche-dati genomiche ci aspettiamo di identificare geni che possano essere il bersaglio di mutanti p53 ma non della proteina normale. Di qui, esploreremo la possibilità che tali mutanti siano oncogenici in conseguenza di guadagno di funzione.

- BRCA1 e BRCA2
(i) Con l'uso di criteri stringenti di accertamento continueremo, all'interno del nostro centro di Cancer Genetic Counceling, ad estendere il nostro pannello di famiglie con cancro del seno/ovaio fino ad un totale di oltre 300.
(ii) Implementando i saggi esistenti, come il PTT, con la tecnologia DHPLC e con analisi di RNA (espressione genica allele-specifica), ci aspettiamo di identificare le mutazioni alla base della maggioranza di queste famiglie aumentando così sostanzialmente il numero di pazienti disponibili per studi di penetranza e di correlazioni genotipo-fenotipo.
(iii) Ci aspettiamo di ottenere le frequenze di varianti polimorfiche dei geni BRCA1 e BRCA2. Inoltre ci aspettiamo di ottenere le frequenze di alleli polimorfici di altri geni che potrebbero essere legati al meccanismo di azione di BRCA1 e BRCA2, come ad esempio: GSTP1 (1404A>G e 2294C>T), implicati nel metabolismo dei cancerogeni; TNF-a (308G>A) e HSP70-2 (1267G>A), implicati nella sorveglianza immunitaria; OGG1 (1033A>T), implicati nella risposta al danno al DNA; MnSOD (1183C>T), implicato nella protezione dallo stress ossidativo; prohibitin (1703C>T), implicato nel controllo del ciclo cellulare; PPARg2 (192C>G), implicato nel metabolismo lipidico.
(iv) Ci aspettiamo di ottenere correlazioni tra le frequenze di tutte queste varianti alleliche e parametri clinici quali tipo tumorale (seno vs. ovaio o ambedue), numero di ricorrenze, bilateralità ed età di comparsa della malattia. In questo modo avremmo identificato e definito il ruolo di veri geni modificatori, che sarebbe di ovvia importanza per l'accuratezza delle stime accurate di rischio negli individui predisposti e per un progresso nella nostra capacità di offrire misure preventive appropriate.
(v) Dall'analisi di famiglie con cancro del seno/ovaio non associato a BRCA1 o BRCA2, ci aspettiamo di ottenere associazione ad un nuovo locus o loci.

- HPNCC
(i) Definiremo quali marcatori abbiano maggior valore per la diagnosi della instabilità dei microsatelliti (MIN), ottimizzando il pannello di microsatelliti da studiare. In tal modo renderemo la diagnosi molecolare di HNPCC più semplice ed economica.
(ii) Utilizzando i dati del Registro del Cancro colorettale riguardante Modena e dintorni, che comprende l'analisi MIN su oltre 300 tumori, verificheremo se MIN sia un fattore di prognosi favorevole in pazienti con tumori colorettali indipendentemente dalla storia familiare.
(iii) Verrà compilata una lista dei geni che possono essere i bersagli più frequenti ed importanti della disfunzione MMR, cominciando con l'identificare, mediante analisi di data bases di trascritti piuttosto che di DNA genomico, geni che contengano sequenze vulnerabili e passando poi all'identificazione di geni funzionalmente correlati ai meccanismi noti o presunti di cancerogenesi colorettale, e
(iv) Verrà anche compilato un pannello di candidati geni-bersaglio i cui trascritti sono destabilizzati e degradati in conseguenza di mutazioni frameshift causate da difetti nella riparazione dei mismatches.
(v) Otterremo evidenze sul ruolo di soppressori di tumori di geni di nuova scoperta studiando l'accumulo di mutazioni somatiche in questi geni in tumori di pazienti HNPCC.
(vi) Otterremo evidenza conclusiva che nuovi geni candidati identificati con gli approcci sopra indicati siano effettivamente bersagli di mutazione nella situazione in cui vi sia un difetto nel MMR, esaminando tali geni per mutazioni presenti nei tumori. In tal modo identificheremo nuovi trascritti mutati nel cancro colorettale con instabilità dei microsatelliti, in conseguenza di difetti nel MMR.
(vii) Sulla base dei risultati di cui sopra, potremmo riuscire a costruire un pannello di cDNA da utilizzare per disegnare un chip "dedicato", con cDNA contenenti sequenze ripetute corrispondenti a RNA ipo-espressi in cellule di carcinoma colorettale MIN. Questo chip sarà convalidato usando RNA da linee cellulari e tumori precedentemente analizzati.
(viii) Identificheremo polimorfismi e determineremo frequenze alleliche in geni-bersaglio noti o potenziali che non sono stati ancora studiati per la variazione genetica.
(ix) Otterremo confronti di frequenze genotipiche per i geni sopra indicati tra pazienti con adenoma o cancro colorettale e controlli, fornendo così il materiale per l'identificazione di potenziali geni di suscettibilità, da confermare con studi epidemiologici.
(x) Per i geni più frequentemente mutati, determineremo la posizione nel processo di cancerogenesi analizzando la frequenza di mutazioni in funzione dello stadio tumorale.
(xi) Sarà definito il ruolo relativo dei meccanismi epigenetici rispetto a quelli genetici nel silenziamento di geni implicati nel CCR sporadico o ereditario. In particolare sarà determinata la frequenza di ipermetilazione del promotore di MLH1 nell'HNPCC e in tumori sporadici con MIN. Inoltre verranno stabilite correlazioni tra mutazione e silenziamento epigenetico di geni MMR ed espressione di proteine MMR in tumori con MIN.
(xii) Identificheremo famiglie con HNPCC che non presentano mutazioni dei geni MMR noti ed otterremo, mediante un'analisi genomica totale, dati di linkage relativi a nuovi geni predisponenti al cancro colorettale ereditario.

- MELANOMA FAMILIARE
(i) Stabiliremo la frequenza di mutazioni germinale CDKN2A e CDK4 in famiglie con casi multipli dell'Italia settentrionale per confermare la predominanza di G101W, per il quale abbiamo già dimostrato un effetto del fondatore.
(ii) Stabiliremo la frequenza dei polimorfismi comuni nt 500 e nt 540 nelle 3'UTR di G101W in pazienti con melanoma rispetto a controlli dalla stessa area geografica, per stabilire l'impatto di questi polimorfismi sul rischio di melanoma.
(iii) Con l'uso di analisi di immunofluorescenza con tre diversi anticorpi ed analisi di immagine digitale, otterremo dati quantitativi definitivi sull'espressione e localizzazione cellulare (soprattutto nucleare) di p16 in vivo nei mutati G101W.
(iv) Forniremo una possibile spiegazione a livello biochimico per la perdita di funzione e la localizzazione errata di p16 in mutanti G101W.
(v) Determineremo quale sia il metodo migliore (ASO, SSCP, sequenziamento) per identificare in modo efficiente varianti MC1R, e così spiegare correlazioni tra varianti di MC1R a basso rischio e penetranza del melanoma nelle famiglie G101W liguri.

GENI DI SUSCETTIBILITA' ALL'EPATOMA
(i) Identificheremo nuovi loci implicati nella predisposizione genetica al cancro del fegato nel ratto, in particolare quelli coinvolti nella reversione fenotipica dei noduli preneoplastici, il cui meccanismo è tuttora sconosciuto.
(ii) Identificheremo geni modificatori implicati nella cancerogenesi epatica mediante analisi genetica, e precisamente attraverso la generazione di ratti congenici e un metodo basato su QTL già identificati.
(iii) Identificheremo anche geni modificatori confrontando ceppi suscettibili e resistenti mediante RDA e tecnologia del microarray.
(iv) Con saggi su campioni umani, definiremo il ruolo nell'epatoma umano degli omologhi dei geni identificati nel ratto.

TUMORI DELLE CELLULE T NELL'ATASSIA TELANGIECTASIA (AT)
(i) Analizzando l'espressione genica di RAG1, RAG2 e TdT, e gli intermedi di ricombinazione come indicatori di riarrangiamenti V(D)J, determineremo se la revisione del recettore giochi un ruolo nel rischio di traslocazioni cromosomiche leuchemogene nei pazienti AT.
(ii) Introdurremo metodi per analizzare cloni pre-leucemici in pazienti AT; analizzeremo i pazienti per la presenza di traslocazioni potenzialmente patogenetiche e per la loro espansione quantitativa.
(iii) Mediante analisi ChIP con un anticorpo contro gli istoni H3 acetilati seuita da PCR quantitativa dei geni bersaglio nella frazione legata, analizzeremo il ruolo di ATM nel determinare la struttura della cromatina e l'accessibilità alla ricombinasi di loci specificamente implicati nelle traslocazioni oncogenetiche.
(iv) Confrontando linee cellulari AT e di controllo, determineremo in quale misura l'accumulo di DSD possa essere attribuito a difetti di segnalazione ai meccanismi riparativi o ad un difetto nell'apoptosi.

SUSCETTIBILITA' AL CANCRO POLMONARE
(i) Otterremo dati di sequenza su Kras e geni fiancheggianti e stabiliremo correlazioni tra differenti alleli in pazienti con adenocarcinoma del polmone ed appropriati controlli. Otterremo anche correlazioni con l'età di comparsa, il decorso clinico e la prognosi.
(ii) Otterremo correlazioni tra differenti alleli presenti in linee cellulari di adenocarcinoma e la produzione di tumori ed il grado di malignità in topi NOD/SCID.

ALTRI GENI DI SUSCETTIBILITA' AL CANCRO
(i) Una volta identificate popolazioni adatte a studi di associazione, stabiliremo i relativi meriti dei microsatelliti rispetto agli SNP per una scansione totale del genoma umano ad alta densità.
(ii) Previo consenso informato, otterremo campioni da pazienti con tumori e controlli appaiati e determineremo i loro genotipi per i marcatori di cui in (i). Questo materiale sarà utilizzato per l'analisi di linkage disequilibrium e l'identificazione di potenziali loci di suscettibilità da verificare mediante analisi mutazionale e funzionale.<<<

Durata

36 mesi