RICERCA ITALIANA     

Post-genomica dei disordini del metabolismo del ferro

Università degli Studi di Brescia

Abstract

Il progetto riunisce dieci gruppi di ricerca italiani accomunati da una notevole competenza sui problemi del metabolismo del ferro, riconosciuta a livello internazionale, e che collaborano con successo da anni. Essi hanno cognizioni complementari che vanno dalla pratica clinica, alla genetica, biochimica, biologia molecolare e cellulare. Il progetto ha realistiche prospettive di sviluppare sinergie e migliorare la visibilità internazionale degli studi sui disordini del metabolismo del ferro.
Uno degli obiettivi principali del progetto è di risolvere a livello genetico e molecolare la diagnostica relativa all'emocromatosi ereditaria. Questo è un disordine relativamente diffuso nel Nord Europa dove è strettamente associato a una mutazione omozigote del gene HFE, mentre nel Sud Europa l'emocromatosi ha una maggiore eterogeneità. Queste osservazioni hanno guidato i gruppi qui proponenti alla identificazione di almeno altre tre forme geneticamente distinte di emocromatosi. In due forme è stato identificato il gene e nella quarta forma è stato identificato il locus. La collaborazione tra i gruppi con tale esperienza sull'emocromatosi permette di avere accesso ad una casistica genetica unica al mondo, essenziale per affrontare una nuova classificazione nosologica dei disordini basata su marcatori molecolari e sui profili genetici. Inoltre, la interazione tra i gruppi con maggiore esperienza di genetica e quelli con esperienza di biologia molecolare e biochimica facilita e stimola lo studio molecolare e funzionale dei disordini. Ciò verrà fatto per tutti i prodotti genici finora associati all' emocromatosi, denominati HFE, TfR2, Ftp1 con lo scopo di trovare possibili interazioni tra essi e colmare le attuali lacune interpretative sui meccanismi di omeostasi del ferro e sulla loro alterazione in condizioni morbose.
Il progetto propone anche di studiare a livello molecolare due disordini associati ad alterazioni dell'omeostasi mitocondriale del ferro: l'anemia sideroblastica, che è relativa al sistema eritroide e l'atassia di Friedreich (FRDA), che colpisce principalmente il sistema nervoso e il miocardio. E' noto che il ferro deve transitare nel mitocondrio per diventare funzionalmente attivo, ma ben poco si sa sui meccanismi con i quali il mitocondrio gestisce il traffico di ferro al suo interno. Lo studio dell'anemia sideroblastica e della FRDA può pertanto avere la duplice valenza di migliorare la nostra comprensione dei meccanismi mitocondriali di regolazione del ferro, e di identificare strategie terapeutiche innovative. Questi studi sono stimolati anche dalla recente identificazione ottenuta dalla collaborazione tra alcuni gruppi proponenti di una nuova ferritina localizzata nel mitocondrio che potrebbe essere un bersaglio molecolare importante per lo studio e trattamento dei disordini associati a sovraccarico mitocondriale di ferro.
Il progetto prevede anche studi mirati sui meccanismi di cardiotossicità ferro-mediata, sul possibile sviluppo di farmaci per prevenirla, e l'analisi del ruolo delle cellule macrofagiche nella regolazione dell'omeostasi del ferro. Oltre a integrarsi concettualmente e sperimentalmente con le altre linee tematiche del progetto, questi studi mirati potranno identificare nuovi marcatori di malattia nonché bersagli molecolari di interventi terapeutici, basati su una migliore comprensione della regolazione biologica del ferro.
Il progetto si articola in nove work packages che hanno l'obiettivo di definire e caratterizzare sul piano molecolare le quattro forme di emocromatosi genetica sinora conosciute, di verificare se esista ulteriore eterogeneità genetica, di studiare l'anemia sideroblastica e atassia di Friedreich, i disordini associati ad alterazioni delle ferritina, e di affrontare argomenti di base quali i meccanismi ferro-mediati di tossicità epatica cardiaca ed il traffico del ferro nel sistema reticolo endoteliale.
In conclusione, il progetto proposto mantiene un buon equilibrio tra ricerca di base e applicata, con realistiche prospettive di importanti contribuiti a livello nazionale ed internazionale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

PAOLO AROSIO, Universita' degli Studi di BRESCIA

Obiettivo del Finanziamento

Vi è una crescente consapevolezza che il ferro ha un ruolo importante se non essenziale nei fenomeni ossidativi patologici che includono le malattie neurodegenerative, aterosclerosi, danni cardiaci ed epatici. I recenti risultati di ricerca genomica hanno individuato importati associazioni tra alterazioni di geni specifici e disordini del metabolismo del ferro. Questi includono principalmente la emocromatosi ereditaria, ed anche l'atassia di Friedreich e la anemia sideroblastica, la neuroferritinopatia e sindromi di iperferritinemia. Questi dati aprono la via a nuove ricerche post-genomiche atte a studiare, a livello molecolare e cellulare, la funzionalità dei prodotti genetici identificati ed il loro ruolo nei disordini del metabolismo del ferro. Una maggiore conoscenza dei meccanismi di regolazione e della tossicità del ferro possono avere importanti ricadute anche per la comprensione e cura di disordini neurodegenerativi, quali la sindrome di Hallervorden-Spatz, il morbo di Alzheimer e di Parkinson, che sono associati a sovraccarichi cerebrali locali di ferro.
Le unità di ricerca che partecipano a questo progetto hanno avuto un ruolo importante nell'identificazione dei geni coinvolti nell'emocromatosi genetica ed hanno competenze internazionalmente riconosciute sui disordini del metabolismo del ferro ce sono riconosciute dalla comunità internazionale. Uno scopo del progetto è di implementare ulteriormente le sinergie tra i laboratori italiani al fine di aumentare il loro contributo e a livello internazionale ed assumere un ruolo prioritario, con la possibilità di affrontare e risolvere alcuni problemi di primaria importanza nella regolazione del metabolismo del ferro utilizzando approcci multidisciplinari, clinici, fisiopatologici, biochimici e di biologia molecolare.
Gli obiettivi scientifici del progetto includono:
Una dettagliata analisi dell'emocromatosi ereditaria. Questa patologia molto comune determina un aumento dell'assorbimento di ferro con possibili danni a diversi parenchimi quali fegato, cuore e pancreas. Conoscere la patogenesi di questo disordine é un punto essenziale per meglio comprendere i meccanismi che regolano l'assorbimento, la compartimetalizzazione e la tossicità del ferro. Questi meccanismi possono avere notevoli implicazioni nel trattamento e nella diagnosi di altri disordini anche più gravi sempre associati a sovraccarico marziale, quali talassemie, nefropatie, anemie delle malattie croniche, e malattie neurodegenerative. In particolare, nei workpackages dedicati si vuole: a) identificare mediante "positional cloning" il gene coinvolto nella emocromatosi giovanile di tipo 2, il cui locus è stato identificato da alcuni partners di questo progetto, b) definire il ruolo di TfR2 nella regolazione dell'omeostasi del ferro e le cause per cui le sue mutazioni inducono un sovraccarico parenchimale del ferro, c) definire il ruolo delle ferroportina-1 nella regolazione dell'omeostasi del ferro e la cause molecolari per cui mutazioni eterozigoti del gene portano dapprima ad anemia e poi a sovraccarico del ferro, d) identificare le possibili interazioni tra le proteine sopra indicate e quella codificata da HFE, il gene mutato nella maggior parte dei casi di emocromatosi. Inoltre, la caratterizzazione genotipica di un vasto numero di soggetti con le varie forme di emocromatosi porterà a suggerimenti per una nuova classificazione nosologica del disordine basata sui marcatori molecolari.
Studio della anemia sideroblastica. E' un disordine eterogeneo in cui si formano depositi patologici di ferro nei mitocondri degli eritroblasti. Una forma genetica è associata a mutazioni del gene per la forma eritroide della ALA sintasi sul cromosoma X. Le più diffuse forme acquisite rientrano nelle sindromi mielodisplastiche o preleucemiche, disordini clonali della cellula staminali emopoietica. In una parte di questi pazienti l'anemia evolve in leucemia mieloide acuta. Osservazioni recenti indicano che esse potrebbero essere disordini da mutazioni acquisite del DNA mitocondriale. Uno dei nostri gruppi ha osservato che i depositi mitocondriali del ferro sono associati ad un accumulo di ferritina mitocondriale che potrebbe avere un ruolo protettivo. Nel corso della presente ricerca si studierà l'espressione della ferritina mitocondriale negli eritroblasti di individui normali e di pazienti affetti da anemia sideroblastica congenita o acquisita. I pazienti verranno studiati per possibili mutazioni di ALAS2 e di HFE, e campioni di DNA verranno conservati per lo studio successivo di possibili geni modificatori. In pazienti selezionati si studierà la clonalità dell'emopoiesi e verranno ricercate mutazioni o delezioni del DNA mitocondriale. Nei pazienti con anemia sideroblastica idiopatica acquisita verranno condotti studi cosiddetti di "gene expression profiling", utilizzando "human cDNA microarrays". Verranno inizialmente studiati geni coinvolti nella differenziazione e proliferazione eritroide, ed i loro fattori trascrizionali. I risultati dovrebbero consentire di migliorare la conoscenza della patogenesi dell'anemia sideroblastica idiopatica acquisita, e fornire indicazioni diagnostiche.
Studio dell'atassia di Friedreich (FRDA). La FRDA è la più comune atassia ereditaria con una frequenza di ca. 1:50.000. E' una malattia trasmessa con modalità autosomica recessiva caratterizzata da progressivo deterioramento della capacità di coordinare i movimenti e neuropatia sensitiva. Circa 2/3 dei pazienti sviluppano una grave cardiopatia ipertrofica/dilatativa con esiti spesso fatali. In una minoranza di casi si osserva intolleranza al glucosio o diabete. L'alterazione molecolare più frequente è l'espansione di una ripetuta GAA nel 1° introne del gene FRDA (Campuzano et al., 1996) che riduce grandemente l'espressione del gene FRDA. La proteina in difetto, fratassina, è localizzata nei mitocondri con una funzione ancora largamente sconosciuta. Secondo le ipotesi basate su modelli di lievito (Babcock et al., 1997) il deficit di fratassina determinerebbe un abnorme accumulo di ferro intramitocondriale con conseguente danno ossidativo di numerose proteine mitocondriale e della catena respiratoria. Noi abbiamo osservato che linee cellulari con deficit di fratassina derivate da pazienti con FRDA hanno una elevata sensibilità allo stress ossidativo e una ridotta vitalità che è in parte restituita dall'impiego di inibitori dell'apoptosi (Wong et al., 1999; Tan et al., 2001). Inoltre, il contenuto di ferro dei mitocondri di queste linee era significativamente aumentato. E' stato recentemente proposto che la fratassina di lievito sia in grado di legare il ferro similmente alla ferritina (Adamec et al, 2000). Questa ipotesi avrebbe un rilevante impatto terapeutico per potenziali interventi farmacologici diretti a ridurre i livelli di ferro ed lo stress ossidativo. Ad esempio, l'idebenone, un agente antiossidante avrebbe un effetto positivo sull'evoluzione della cardiopatia. Tuttavia, il modello patogenetico è in attesa di validazione e gli studi strutturali non hanno confermato che la fratassina umana sia in grado di legare ferro. Gli studi biochimici svolti dalle nostre UR in linee cellulari umane normali e con deficit di fratassina non hanno confermato la presenza di complessi ad alto peso molecolare. Infine, nell'unico modello animale disponibile, la neurodegenerazione appare chiaramente precedere l'accumulo di ferro intramitocondriale (Puccio et al., 2001). Nell'ambito di questo progetto ci proponiamo pertanto di elucidare la funzione della fratassina nelle cellule umane avvalendoci della collaborazione tre le UR di Dr. Taroni, Dr. Arosio e Dr. Levi. L'attività si avvarrà della UR di Dr. Minotti per lo studio delle cardiotossicità. Inoltre, l'esperienza del Dr. Taroni sarà particolarmente utile per poter eventualmente allargare lo studio ad altre forme neurodegenerative con alterazione del metabolismo del ferro.
Studio dei disordini associati ad alterazioni della ferritina. E' stato recentemente descritto un nuovo disordine, denominato neuroferritinopatia, associato ad una mutazione delle ferritina L che si trasmette in maniera auosomica dominante. Con la nostra lunga esperienza sulla caratterizzazione della molecola ci proponiamo di studiare in dettaglio le proprietà strutturali e funzionali del mutante per individuare la cause che portano ad un aumento del ferro nei gangli basali con effetto tossico. Inoltre, si continueranno gli studi sulla sindrome di iperferritinopatia genetica associata alla cataratta, provocata da mutazione delle zona regolatoria del trascritto della ferritina L, anche per migliorare i sistemi diagnostici e compiere studi di popolazioni che determinino la prevalenza delle mutazioni in Italia. Il medesimo approccio verrà usato per identificare mutazioni della equivalente zona regolatola del trascritto della ferritina H in soggetti con disordini del metabolismo del ferro.
Cardiotossicità indotta da doxorubicina (DOX), un'antraciclina antitumorale. Questo è un buon modello per studiare la tossicità del ferro sia dal punto di vista di un suo coinvolgimento in fenomeni ossidativi che dal punto di vista di un'alterata funzionalita' di enzimi ferro-dipendenti. Infatti, studi precedentemente condotti da uno dei partners di questa proposta negoziale hanno evidenziato che alcuni metabolici della DOX, e segnatamente il derivato alcolico secondario doxorubicinolo (DOXolo), hanno spiccata reattivita' verso il cluster Fe-S dell'aconitasi citoplasmatica/IRP-1, un'importante fattore di regolazione post-trascrizionale de TfR e ferritina. In questo progetto si valutera' se il DOXolo puo' attaccare anche il cluster dell'aconitasi mitocondriale, sprovvista di attivita' IRP ma di primaria importanza bioenergetica in quanto enzima limitante il ciclo di Krebs. Oltre a provocare delocalizzazione di ferro tossico nel mitocondrio, questo processo puo' propagarsi ad altri enzimi Fe-S della catena respiratoria, con relativo collasso di potenziale energetico. Nel corso della ricerca si studiera' anche un possibile attacco del DOXolo al cluster Fe-S della ferrochelatasi, l'enzima che incorpora ferro nell'eme. Quest'ultimo processo porterebbe a un blocco del ciclo di import del ferro ed export di eme a livello mitocondriale, con ulteriore accumulo di ferro nell'organello e ridotta biodisponibilita' di enzimi eme-dipendenti. Oltre a fornire importanti informazioni sulla patogenesi e modulazione farmacologica della tossicita' di questo importante farmaco antitumorale, gli studi consentiranno di riprodurre alterazioni mitocondriali osservate in altre patologie oggetto della Proposta negoziale (anemia sideroblastica, atassia di Fridereich). Il modello offre quindi la possibilita' di riunire in un quadro unificante il ruolo del ferro in patologie con diverse basi eziopatogenetiche
Studio del metabolismo del ferro nelle cellule reticoloendoteliali e delle sue alterazioni nell'emocromatosi. I macrofagi, rendendo disponibile il ferro eritrocitario per il midollo osseo, processano un'enorme quantità di ferro e giocano un ruolo essenziale nello spostare grosse quantità di ferro tra il comparto di deposito ed il comparto di utilizzo, in risposta alle richieste dell'organismo. Più che agendo sull'acquisizione di ferro, sembra che i macrofagi svolgano questo particolare compito modificando il rilascio del metallo, ma i meccanismi molecolari responsabili sono pressochè ignoti. Nell'ambito di questo progetto ci proponiamo di approfondire lo studio del metabolismo del ferro nelle cellule RE e di come le mutazioni dei geni associati all'emocromatosi possano modificarlo. In particolare, riaffronteremo lo studio delle attività delle iron regulatory proteins (IRP-1 e -2) proteine regolatrici dell'omeostasi intracellulare del ferro. Dal momento che abbiamo in precedenza dimostrato da un lato un inappropriato innalzamento dell'attività totale di IRP nei pazienti con emocromatosi e dall'altro che il comportamento delle due proteine in diverse situazioni fisiopatologiche può essere molto differente, studieremo le IRP utilizzando anticorpi che ci permettano di analizzare separatamente il ruolo di IRP-1 e di IRP-2. Cercheremo anche di misurare le variazioni nel rilascio di ferro dalle cellule RE correlandole al contenuto cellulare di ferro, e quindi all'attività delle IRP. Infine, analizzeremo l'espressione di HFE e valuteremo se HFE influenza l'interazione del recettore della trasferrina con altre proteine del pathway di endocitosi.
Ruolo del ferro nelle epatopatie. Il ferro gioca un ruolo importante nelle varie forme di epatopatia, e quando è in eccesso aggrava il processo di fibrosi, e l'evoluzione a cirrosi e ad epatocarcinoma. Il ferro sembra anche avere anche un effetto pro-cancerogeno diretto. Ci proponiamo quindi di studiare HFE in un vasto numero di pazienti con vari tipi di epatopatie di cui sia disponibile la biopsia per definire la severità della malattia ed il carico di ferro. Di essi si studieranno il genotipo HFE ed i polimorfismi del TNF-alfa, che abbiamo dimostrato essere correlati al carico di ferro e al danno epatico. Particolare attenzione verrà data ai fenomeni ossidativi, considerando sia i meccanismi di regolazione del ferro che la espressione di ferritina mitocondriale ed i polimorfismi della Mn superossido dismutasi mitocondriale, un enzima con attività anti-ossidante, tutti fattori già coinvolti in altre patologie. Questi studi, uniti ad una maggiore caratterizzazione delle sindromi metaboliche con iperferritineimia porteranno ad una maggior comprensione delle relazioni tra riposta immunitaria, attività mitocondriale e tossicità epatica del ferro.<<<

Durata

36 mesi