RICERCA ITALIANA     

UN APPROCCIO DI FORWARD GENETICS PER LA MUTAGENESI NEL TOPO BASATO SULLA SELEZIONE GENETICA DELLE INATTIVAZIONI INSERZIONALI

Fondazione Telethon

Abstract

Fino ad oggi sono stati adottati diversi approcci tesi a creare vaste collezioni di topi mutanti per studi di genomica funzionale. Ciascun approccio ha punti forti e punti deboli. La strategia qui proposta si basa sulla proprieta' dei trasposoni del tipo Tc-Mariner di integrarsi a random nei genomi di vertebrato. Noi abbiamo concepito una strategia tesa a selezionare quegli eventi di integrazione che portano all'inattivazione funzionale dei geni. A questo scopo abbiamo progettato un costrutto per exon trapping chiamato Hitching Hunk, fiancheggiato da elementi ripetitivi trasponibili, e capace di complementare l'effetto di una mutazione che conduce a sterilita'. La complementazione avra' luogo in quelle cellule germinali in cui il costrutto si integrera' a monte di un segnale di poliadenilazione. Inoltre, abbiamo progettato un sistema reporter modulare e universale (il topo Flasher) utile a semplifcare gli studi funzionali dei fenotipi mutanti prodotti dall'integrazione di Hitching Hunk. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

FRANCESCO CECCONI, FONDAZIONE TELETHON

Obiettivo del Finanziamento

Il presente progetto propone una nuova strategia mirata alla produzione di topi "knockout" e mutanti attraverso l'integrazione in vivo di elementi trasponibili. Anche se sicuramente ambiziosa noi riteniamo che questa strategia abbia un razionale fondato. chiediamo al revisore di valutare che la nostra proposta risponde in maniera diretta a uno dei criteri principali del bando che e' quello dello sviluppo di tecnologie innovative ed originali nell'ambito della postgenomica e rappresenta un reale sforzo cooperativo nel quale tutti i gruppi si impegnano a condividere strumenti e informazioni per cercare di risolvere le difficolta' del progetto in vista del raggiungimento di un obiettivo comune. Numerosi aggiustamenti alla strategia generale possono essere fatti ai vari passaggi della nostra strategia per risolvere gli eventuali problemi che dovessero presentarsi nel corso dello svolgimento del progetto.

a) Sviluppo di una collezione di mutanti selezionati secondo il fenotipo attraverso il sistema di trasposizione "Hitching Hunk"

Il primo obiettivo del presente progetto e' quello di sfruttare la capacita' dei trasposoni di venire mobilizzati in genomi di mammifero per sviluppare una collezione di topi mutati. L'approccio qui proposto e' concettualmente diverso dagli approcci tradizionali di "reverse genetics" e rappresenta un reale approccio di "FORWARD GENETCS". Difatti, i mutanti generati attraverso la nostra strategia verranno selezionati ed analizzato PRIMA che sia nota la base molecolare del fenotipo mutato, ovvero prima che il gene colpito venga identificato. In questi rispetto la nostra strategia e' piu' simile alle strategie di mutagenesi a saturazione , quale la mutagenesi ENU, con l'importante eccezione che nella nostra strategia L'IDENTIFICAZIONE DEL GENE INATTIVATO E' DIRETTA E NON RICHIEDE IL CLONAGGIO POSIZIONALE. L'approccio e' anche simile alle strategie di "gene trapping" ma NON RICHIEDE LA MANIPOLAZIOE DI CELLULE STAMINALI EMBRIONALI (ES), in quanto la trasposizione avviene in un organismo vivente e din particolare nelle cellule germinali.
Inoltre a differenza dei topi "gene trap" nella nostra strategia ogni nidiata dara luogo a TANTI MUTANTI INDIPENDENTI QUANTI SONO I COMPONENTI DELLA NIDIATA e molti di questi porteranno mutazioni CHE ALTERANO O ABOLISCONO LA FUNZIONE GENICA. Al contrario nei protocolli di mutagenesi mediante trasposoni in mammiferi descritti in letteratura solo una piccola percentuale di integrazioni avviene all'interno di unita' trascrizionali ed in maniera tale da inattivare la funzione del gene. Infatti le integrazioni dei trasposoni nel genoma murino di solito avvengono in maniera casuale e spesso coinvolgono regioni genomiche silenti.
Ci attendiamo di raggiungere questi obiettivi ambiziosi attraverso una strategia basata sulla SELEZIONE IN VIVO. Ci proponiamo di ottenere trasposizioni in vivo nel topo in una linea che porta un amutazione omozigote nel gene TLF, una mutazione che in omozigosi rende i maschi sterili a causa della totale inabilita' degli spermatidi di completare la spermatogenesi. Nonostante che TLF sia un fatore di trascrizione espresso in molti tipi cellulari, i topi TLF-/- non mostrano altri difetti al di fuori dell'arresto nella spermatogenesi. Il trasposone da noi concepito "HITCHING HUNK" (HH) conterra' il gene TLF sotto il controllo del promotore della protammina1 (prm1) che e' funzionale solo e specificamente in cellule in fase meiotica.








Questo portera' alla complementazione genica del difetto TLF-/- solo in quelle cellule germinali nelle quali il trasposone si sara' integrato produttivamente in una unita' trascrizionale. In questi casi il costrutto HH portera' al ripristino della spermatogenesi nello spermatide in cui e' avvenuta l'integrazione. La strategia e' descritta in dettaglio nella sezione 3.3.

UN OBIETTIVO A LUNGO TERMINE DI QUESTO PROGETTO E' QUELLO DI GENERARE UNA COLLEZIONE DI TOPI CON FENOTIPI MUTANTI CHE POSSANO ESSERE UTILIZZATI COME MODELLI DI MALATTIE GENETICHE UMANE.

b) Messa a punto del sistema "Picklox/Flasher"

Il secondo obiettivo principale del nostro progetto e' di generare un uno strumento molecolare ( la coppia "Picklock/Flasher") che verra' utilizzato quale STRUMENTO UNIVERSALE PER L'ANALISI IN VIVO DI MUTAZIONI INDOTTE NEL TOPO. Molti costrutti per il "knockout" contengono geni reporter siano essi proteine fluorescenti (GFP, YFP, DsRed) o geni che codificano per enzimi (b-galattosidasi, fosfatasi alcalina, PLAP). In alcuni casi i costrutti mutagenici contengono un gene reporter fuso a domini proteici che li dirigono verso specifici compartimenti subcellulari. Questo approccio deriva dall'idea che gli effetti funzionali sul fenotipo di una data mutazione in vivo possano essere predetti efficacemente in base a risultati in vitro o da studi di biologia cellulare. In molti casi anche se non in tutti questa idea si e' rivelata essere sbagliata. Nella maggior parte dei casi il fenotipo di un mutante ottenuto dalla "reverse genetics" e molto diverso da quello atteso. Inoltre, la rete di interazioni intracellulari e intermolecolari complesse che opera all'interno di un organismo vivente spesso rivela che geni che sembravano indispensabili per talune funzioni cellulari si rivelano essere ridondanti mentre per altre funzioni sono indispensabili. Ad esempio un fattore di trascrizione che e' stato visto in vitro essere essenziale per assonogenesi puo' rivelarsi in vivo essere superfluo per tale processo ma importante per altri processi biologici. Pertanto abbiamo pensato che un costrutto "knockout" non debba comportarsi solo come tale ma che debba anche contenere uno strumento universale (Cre ricombinasi, il PICKLOX) in grado di ATTIVARE UN COSTRUTTO REPORTER GENERATO COME TRANSGENE INDIPENDENTE (IL FLASHER) IN UNA DEVERSA LINEA DI TOPI.







In questo caso l'interazione tra un "picklox" ed un "flasher" viene resa possibile attraverso l'icrocio tra le due linee murine.








Nel nostro schema generale che puo' essere modificato secondo le specifiche esigenze il costrutto "flasher" e' posto sotto il controllo di un promotore ubiquitario ma la sua attivazione e' bloccata da segnali di stop fiancheggiati da due siti loxP. Pertanto solo le cellule nelle quali la Cre e' attivata, accenderanno il cosatrutto "flasher" e l'epressione di questo verra' mantenuta per tutta la vita della cellula e nella sue progenie somatica anche dopo lo spegnimento di Cre. Cio' permettera' di seguire nelle strutture adulte gli effetti di un segnale genico accesosi transientemente durante l'ontogenesi e permettera' anche di di paragonare la morfologia a livello cellulare tra eterozigote e omozigote. Gli eterozigoti infatti potranno in alcuni casi mantenere una funzione genica parziale mentre gli omozigoti non mostreranno nessuna attivita' residua nel gene in cui il trasposone si e' integrato. Se ipotizziamo che l'integrazione ha colpito e inattivato un gene X la cui funzione riguarda la detrminazione di un particolare fato cellulare, inquesto caso l'omozigote per HH mostrera' assenza totale di cellule che seguivano tale fato. Se questo topo porta un costrutto "flasher" che codifica per la b-galattosidasi sotto il controllo del promotore dell actina, preceduto da un segnale di stop fiancheggiato da due siti loxP, la b-galattosidasi veraa' accesa in cellule in cui il gene X sia stato attivato anche transientemente in qualche fase dello sviluppo o del differenziamento. Inoltre la b-galattosidasi verra' espressa in tutte le cellule somatiche derivate da queste. Diverra' quindi possibile studiare la presenza di strutture immature in strutture anatomiche adulte e l'effetto di un evento determinativo avvenuto durante l'ontogenesi. Se un gene X svolge un ruolo nella determinazione dei tipi cellulari a, b e c , ma il suo ruolo e' ridondante in a e b, i mutanti eterozigoti HH nel gene X avranno cellule di tipo a, b e c, mentre gli omozogoti avranno a e b mentre mancheranno di c. Ad esempio in un processo ontogenetico che influisce sul fato di derivati della cresta neurale, topi omozigoti per HH avranno cellule di Schwann e neuroni dorsali ma non neuroni del simpatico.

Nel caso in cui l'esame morfologico non dovesse rivelare alcun difetto nella specificazione dei destini cellulari sara' sempre possibile incrociare i topi con un dato costrutto HH con altri topi "flasher" per analizzare un diverso processo biologico.










Il sistema e' efficacemente modulare e se trovera' una ampia diffusione si otterra' in breve tempo una vasta collezione di STRUMENTI MOLECOLARI DI RIFERIMENTO a disposizione della comunita' scientifica che permettera' negli anni a veire di caratterizzare un sempre crescente numero di linee murine mutanti.

c) Sviluppo di una collezione di topi Cre per la mutagenesi condizionale.

Un derivato e obiettivo secondario legittimo di questo progetto sara' la caratterizzazione di topi che portano una integrazioen del costrutto "PICKLOX" per quanto riguarda la mutagenesi condizionale tessuto e stadio specifica. Questi topi HH si aggiungeranno alla collezione di topi Cre e VERRANNO MESSI A DISPOSIZIONE DELLA COMUNITA3 SCIENTIFICA per essere utilizzati in progetti di mutagenesi condizionale. Il trasposone "hitching hunk" rappresenta un costrutto per la produzione di alleli ipo o nulli morfi non per la produzioni di mutanti condizionali, in altre parole non produrra' fenotipi. Nonostante cio', l'esistenza di una Cre ricombinasi nella parte "promoter trap" del costrutto rendera' possibile l'utilizzo dei mutanti HH eterozigoti per mutagenizzare costrutti "knockout" con siti loxP. Allo stesso tempo la presenza di una proteina reporter fluorescente nel "promoter trap" ci permettera' di caratterizzare finemente la distribuzione tissutale dell'attivita della Cre ricombinasi in tessuti embrionali ed adulti.

d) il nostro e' un approccio di exon trapping!

Riteniamo fondamentale attirare l'attenzione su di un punto cruciale della nostra strategia: Il nostro trasposone HH non contiene alle sue estremita' segnali accettori o donatori di splicing. Questo e' stato deciso per evitare che il gene all'interno del quale il trasposone si integra ignori i segnali di splicing e salti sopra il trasposone, generando un trascritto maturo senza sequenze trasposte. Il nostro e' un approccio di exon trapping. L'inattivazione funzionale avverra' se il trasposone si integra in un esone. Questo e' un evento raro ma il nostro sistema prevede di selezionarlo grazie all'attivita' del gene TLF nel modulo poly A trap. Una inattivazione funzionale si verifichera' con ogni probabilita' anche nel caso di un'integrazione intronica o a monte dell'inizio di trascrizione, grazie a un meccanismo di read through. In questo caso, tuttavia, non ci aspettiamo che il modulo promoter-trap del costrutto venga attivato.<<<

Durata

36 mesi