RICERCA ITALIANA     

GENOMICA FUNZIONALE DELLE MALATTIE MUSCOLARI E CARDIACHE. RICERCA DI NUOVI MARCATORI MOLECOLARI E DI NUOVI BERSAGLI PER LA TERAPIA

Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)

Abstract

Ci proponiamo di organizzare un programma di ricerca multidisciplinare che metta insieme la competenza di un gruppo di ricercatori che si focalizzeranno sullo studio del muscolo scheletrico e cardiaco. Lo scopo a lungo termine di questo progetto e' di costruire una cellula muscolare striata virtuale iniziando un lavoro sistematico che parta da un inventario dei geni espressi nei tessuti muscolari e stabilisca le loro interazioni funzionali. I profili trascrizionali verrano stabiliti mediante la tecnica dei microarrays. Le risposte dei muscoli alla perdita di funzione di specifici geni saranno studiate in vitro e in vivo usando le tecniche del RNAi e topi transgenici. La funzione di nuovi geni sara' poi studiata con approcci multipli tra cui l'uso del doppio ibrido e la tecnica del FRET. Questo approccio genomico funzionale verra' applicato allo studio delle malattie del muscolo scheletrico e cardiaco tra cui le distrofie muscolari, le cardiomiopatie, le aritmie e la malattia ischemica del cuore. Lo studio delle variazioni dell'espressione genica nelle malattie muscolari ci fornira' le basi molecolari per la comprensione delle stesse e contribuirà' alla comprensione della patogenesi di queste malattie. Queste informazioni permetteranno di distinguere i pazienti in sottocategorie richiedenti specifici trattamenti terapeutici e forniranno le basi allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

STEFANO SCHIAFFINO, Consiglio nazionale delle ricerche (CNR)

Obiettivo del Finanziamento

L'obiettivo generale del presente progetto e' l'identificazione di nuovi geni coinvolti nella patogenesi delle malattie del muscolo scheletrico e cardiaco. Questi possono includere sia geni coinvolti on patologie multifattoriali come la atrofia del muscolo scheletrico o lo scompenso cardiaco e geni modificatori responsabili del diverso quadro clinico che puo' essere assunto da malattie monogeniche quali la sindrome del QT lungo (LQTS) o la ipertermia maligna (MH). Il nostro scopo principale e' identificare questi geni poiche' possono offrire potenziali bersagli per nuovi approcci terapeutici. Inoltre, questo progetto potrebbe contribuire a identificare nuovi markers diagnostici/prognostici di malattia o parametri di valutazione della risposta alla terapia.

Il progetto e' indirizzato allo studio della cellula muscolare striata: pertanto la nostra ricerca si restringe a quei geni che sono espressi nella cellula muscolare e non in altri tipi di cellule quali quelle endoteliali o nervose la cui disfunzione puo' contribuire allo sviluppo di malattie muscolari.Il progetto di ricerca comprende sia un approccio sistematico mirato a identificare geni e analizzare la loro funzione sia un approccio focalizzato mirato a caratterizzare specifici geni responsabili per lo sviluppo di malattie del muscolo scheletrico o cardiaco. Il progetto si sviluppa sia a livello clinico che pre-clinico. I primi due obiettivi sono piu' generali e forniscono le basi per affrontare i successivi obiettivi che sono piu' focalizzati alla risposta di quesiti direttamente collegati con specifiche patologie.

1) Il primo obiettivo e' definire il profilo di espressione globale del tessuto muscolare. Per questo fine verra' utilizzata la collezione del CRIBI di EST di muscolo umano per produrre microarrays di cDNA su vetrini utilizzando la strumentazione specifica recentemente acquisita dal CRIBI. I microarrays verranno applicati allo studio dei pattern di espressione nel muscolo scheletrico e cardiaco per ottenere un data base completo dei geni espressi in questi tessuti nell'uomo. Questo data base sara' il punto di partenza per successivi studi che analizzeranno le modificazioni in in malattie muscolari in collaborazione con gruppi di ricerca clinica. Il confronto potra' fornire una visione globale delle perturbazioni del profilo di espressione genico legato alla malattia contribuendo alla conoscenza dei meccanismi patogenetici. I microarrays prodotti al CRIBI verranno anche confrontati con quelli disponibili in commercio (Affimetrix).

2) Un secondo obiettivo e' definire la funzione di geni specifici del tessuto muscolare scheletrico e cardiaco usando due approcci: 1) overexpression e inattivazione dei geni per trasfezione in vitro in coltura di cellule muscolari e nel muscolo scheletrico di ratto in vivo.2) inattivazione selettiva mediante la tecnologia dell'antisenso RNA e della RNA interferenza in modelli animali (Drosophila and zebrafish). Ci poniamo l'obiettivo di validare la tecnica del trasferimento genico in vico come efficace alternativa al tradizionale approccio dell'animale transgenico. Ci proponiamo di esplorare il potenziale del knock-out somatico negli stessi sistemi usando RNA antisenso e RNA interferenza.

3. Ci poniamo l'obiettivo di definire i meccanismi responsabili della atrofia muscolare. La perdita di massa e di forza muscolare e' una importante causa di disabilit' nell'invecchiamento, nelle situazioni di immobilizzazione e nelle malattie muscolari. Ci proponiamo di identificare i geni coinvolti nella regolazione della dimensione delle fibre muscolari. Confronteremo a questo scopo i profili di trascrizione di muscoli che vanno incontro a atrofia o a ipertrofia sia nell' uomo che nel ratto. Esploreremo le cascate di trasduzione del segnale coinvolte nella regolazione delle dimensioni delle fibre muscolari perturbandole in modo selettivo con mutanti costitutivamente attivi o inattivi di specifici componenti la cascata.

4. Ci proponiamo di studiare la relazione genotipo-fenotipo nelle malattie neuromuscolari caratterizzate da un quadro clinico variabile. Per questo analizzeremo i profili di espressione genica nelle malattie muscolari con difetto molecolare primario gia'noto, per definire associazioni fra profili di espressione e fenotipi variabili in gruppi di pazienti geneticamente omogenei.
Esamineremo a questo scopo le distrofie muscolari, in particolare la distrofia di Becker, la distrofia dei cingoli di tipo 2A (calpainopatia), e di tipo 2B, le distrofie muscolari causate da espansione o delezione di un motivo ripetitivo come la distrofia miotonica (MD) e la distrofia facioscapoloomerale (FSHD). Cercheremo di individuare geni che sono up- or down-regolati e di collegare profili di espressione e quadri sintomatologici. Per meglio comprendere i meccanismi sottostanti la ipertermia maligna (MH) e la Central Core Disease (CCD), entrambe causate da mutazioni nel gene del recettore della rianodina RyR1, e caratterizzate da un ampio spettro fenotipico metteremo a punto modelli di topi con knock-in delle mutazioni trovate nei pazienti con MH/CCD.

5. Ci proponiamo di identificare i geni responsabili di aritmie cardiache, particolarmente quelli che hanno un ruolo nel determinare il diverso grado di gravita' clinica osservabile nei pazienti con LQTS e portatori della medesima mutazione. Il principale obiettivo e' identificare dei geni modificatori nella LQTS che possano portare a un piu' alto o piu' basso rischio di morte improvvisa. Per questo aspetto analizzeremo gruppi di pazienti portatori della medesima mutazione (A341V) sul gene KCNQ1(gene malattia) e esploreremo la associazione fra polimorfismi nei geni candidati come modificatori e il rischio di aritmia. Data la significativa associazione fra eventi cardiaci (sincope, arresto e morte improvvisa) e aumento della attivita' ortosimpatica, esploreremo in dettaglio i geni coinvolti nel controllo nervoso del cuore. Un modello animale di questa condizione verra' generato e introducendo la mutazione A341V nel topo (modello knock-in) per verificare l'ipotesi che il pattern di espressione delle proteine coinvolte nel controllo della attivita' elettrica del cuore e' modificato come conseguenza del difetto genetico primario e che queste modificazioni si correlano con il fenotipo della clinico della malattia. Un secondo obiettivo e' la esplorazione del possibile ruolo delle connessine, le subunita' delle giunzioni gap fra cardiomiociti che potrebbero essere importanti per disturbi della conduzione nella patogenesi delle aritmie. Per determinare se alterazioni della diversita' fra connessina corrisponde a maggior suscettibilita' ad aritmie, un modello di topo transgenico con un unico tipo di connessine espresso nel cuore, verra' generato con la tecnica del knock-in replacement.

6. Ci proponiamo di studiare le basi per la variabile evoluzione della disfunzione contrattile cardiaca in pazienti con infarto miocardico. Per identificare i geni associati a diversi esiti clinici della cardiomiopatia ischemica verranno usati profili di espressione genica globale ottenuti mediante micro-arrays. Inoltre ci proponiamo di identificare i geni associati alla proliferazione cellulare post-infarto nel miocardio di ratti Fischer 344. Questo studio potrebbe portare all'identificazione di markers delle stem cells cardiache.<<<

Durata

36 mesi