RICERCA ITALIANA     

Identificazione e validazione di meccanismi genetico-molecolari coinvolti nel trasporto tubulare renale del sodio nell'ipertensione e nelle sue complicanze d'organo.

Libera Università "Vita Salute S. Raffaele" - Milano

Abstract

Questa proposta si inserisce nel tema più generale "IDENTIFICAZIONE DI ALTERAZIONI MOLECOLARI IMPLICATE NELLA E/O ASSOCIATE ALLA GENESI E ALLO SVILUPPO DI MALATTIE COMUNI E RARE", nell'ambito del Programma Strategico Post Genoma.

L'ipertensione arteriosa colpisce almeno il 20% della popolazione adulta dei paesi occidentali e la sue complicanze cardiovascolari e renali sono una delle principali voci di spesa dei Servizi Sanitari Nazionali.
Gli scopi della proposta sono:
1) Validazione dei meccanismi molecolari del coinvolgimento dei geni di alfa adducina (ADD1), ACE e aldosterone sintetasi (CYP11B2) nello sviluppo dell'ipertensione e delle sue complicanze cardiovascolari che abbiamo recentemente segnalato.
2) Ricerca di associazioni tra genotipi e fenotipi intermedi rilevanti per la clinica dell'ipertensione con studi di genomica funzionale.
3) Identificazione della sequenza di eventi molecolari che vanno dalla alterazione genetica iniziale a quelle secondarie che causano le alterazioni funzionali cellulari e di organo responsabili dei fenotipi clinici (ipertensione e sue complicanze cardiovascolari e renali).

La scelta di questi tre meccanismi genetici è basata su:
1) Studi di genetica statistica su ADD1 (Bianchi G & Cusi D, Am J Hypertens 2000;13:739-43)
2) La osservazione in una popolazione di mancanza di associazione dell'allele 460Trp di ADD1 che è diventata associazione significativa con l'inclusione nella analisi di altri SNPs di ADD1, di beta (ADD2) e gamma (ADD3) adducina, conferendo un attributable risk del 18% (non pubblicato).
3) Come nel caso di ADD1, anche il polimorfismo I/D di ACE e -344CT di CYP11B2 non sono sempre stati associati a ipertensione o alle sue complicanze. Abbiamo recentemente osservato che ACE interagisce epistaticamente con ADD1 nel determinare la risposta pressoria a carico salino acuto (Barlassina C et al, Kidney Int 2000;57:1083-90), mentre ADD1 e CYP11B2 interagiscono epistaticamente con ACE sulla incidenza di ipertensione (Staessen J et al, J Hypertens, 2001:19,1349-55).
4) Numerose altre osservazioni sperimentali e cliniche suggeriscono che questi tre geni interagiscano tra di loro nel controllo del riassorbimento renale di Na e sulla pressione arteriosa.

Anche se è molto probabile che altri geni siano coinvolti, per ora limiteremo il nostro studio su ADD1, ADD2, ADD3, ACE e CYP11B2, basandoci sul rischio attribuibile illustrato sopra e su considerazioni di potenza statistica. Comunque, dal momento che, alla fine della prima parte dello studio saremo in grado di valutare correlazioni genotipo-fenotipo su un campione molto vasto (circa 20000 individui, anche se sottoposti a disegni sperimentali diversi: studi di incidenza, casi-controlli, famiglie), i calcoli di power dovranno essere ripetuti, per valutare anche lo studio di altri geni come la la sub-unità alfa1 della pompa Na-K (ATP1A1), il cotrasporto Na-K (NKCC2) 11beta-idrossisteroido deidrogenasi (HSD11B2) e la kinasi regolata da siero e glucocorticoidi (SGK).

a) LA GENETICA STATISTICA analizzerà
1) la popolazione di Framingham in collaborazione con D Levy
2) una popolazione europea in collaborazione con J Staessen
3) popolazioni di Milano, Sassari e Napoli (UR 001, 002, 004, 005)
Vi sono altre due ragioni che giustificano al analisi delle tre sub-unità ADD1, ADD2 e ADD3:
i) L'adducina è normalmente presente nella cellula come un eterodimero composto da tre sub-unità simili ma non identiche (alfa, beta e gamma), che sono codificate da geni specifici che mappano su cromosomi diversi. Questa peculiarità rende l'adducina ideale per studi di interazione epistatica che se trovata costituisce una prova genetica molto evidente per dimostrarne il ruolo causale.
ii) Non è possibile predire quale combinazione dell'eterodimero è più o meno patogena per usarla in studi post genomici (tanto come alleli quanto come espressione relativa nei vari tessuti). Quindi i risultati della analisi di genetica statistica forniranno questa informazione.

b) GENETICA FUNZIONALE
Studi effettuati a Milano hanno dimostrato che, rispetto ai portatori di almeno un allele 460Trp, gli omozigoti 460Gly di ADD1 hanno: maggior incremento pressorio dopo carico salino, maggior caduta pressoria dopo terapia diuretica o dieta iposodica, maggior riassorbimento tubulare prossimale e minor attività reninica plasmatica, minor concentrazione serica di altri ormoni Na ritentivi. Molte di queste caratteristiche sono state osservate anche a Sassari (su Sardi), nonostante che la frequenza dell'allelte 460Trp sia simile tra ipertesi e normotesi. Le UR 001, 002, 004, 005 estenderanno questi studi tanto aumentando il numero di pazienti quanto il numero di geni e SNPs come indicato sopra. In questo modo ci aspettiamo di raccogliere un numero di pazienti sufficiente per analizzare le possibili combinazioni di genotipi con il fenotipo e di definire quelle più e quelle meno patogene.

c) CELLULE E PROTEINOMICA
Cellule tubulari di ratto (NRK) transfettate con cDNA ADD1 iperteso hanno maggior numero di unità di pompa del Na, di alfaV integrine e di siti di adesione focale sulla superficie cellulare e filamenti di actina più spessi.
Queste osservazioni concordano con quelle ottenute con le proteine in soluzione dove la sub-unità ADD1 lega la pompa del Na con maggiore affinità e stimola la polimerizzazione e il bundling di actina più di quella da MNS. Anche l'endocitosi della pompa del Na varia a seconda del genotipo di ADD1. Questo è stato confermato in ratti congenici che hanno il patrimonio genetico dell'MNS, tranne un piccolo segmento di cromosoma (<6cM) che contiene la ADD1 da MHS. Essi hanno pressione arteriosa e attività di pompa del Na renale maggiore degli MNS parentali. Infine anche la variante umana di ADD1 460Trp lega la pompa del Na con maggiore affinità della variante 460Gly.
Tutte queste osservazioni:
1) indicano che l'adducina ha effetto pressorio controllando la pompa del Na
2) sono la base di partenza per gli studi di genetica funzionale e di proteomica di questa proposta
3) suggeriscono che, oltre all'effetto pressorio, l'adducina può anche essere responsabile di danno d'organo mediato dai suoi effetti sul citoscheletro, sui siti di adesione focale e sulle integrine. Studi in popolazioni umane (in collaborazione con J Staessen) confermano questa ipotesi.

Quindi questa proposta studierà:
a) fibroblasti cutanei da pazienti con differenti genotipi ove si misurerà l'attività di ACE, il volume cellulare, la composizione ionica, i trasporti del Na. In un sottogruppo selezionato in base ai genotipi di ACE, adducina e funzione cellulare si studierà anche l'espressione genica.
b) cellule di ratto MHS, MNS e vari congenici saranno confrontate in vitro con
c) cellule di uomo, cane e ratto (tubulari renali, endoteliali e muscolari vascolari) transfettate con cDNA delle varie adducine. I parametri studiati saranno: pompa del Na, volume, composizione ionica, capacità di migrazione (cellule endoteliali). La UR 003 ha già osservazioni preliminari che indicano che ADD1 controlla la formazione di neocapillari su matrigel. Questo tipo di studio può contribuire a chiarire il noto fenomeno di rarefazione capillare degli ipertesi ed è sicuramente coinvolto nel danno d'organo. In queste cellule si studierà anche la interazione tra proteine con coimmunoprecipitazione, 2D elettroforesi, biotinilazione selettiva di domini, cromatografia di affinità, localizzazione di proteine con immunofluorescenza e microscopia confocale, immunomicroscopia elettronica, tecnica del doppio ibrido.
Questo approccio va dalla epidemiologia alla interazione tra proteine tramite varie procedure sperimentali integrando le competenze di 4 esperti di biologia cellulare di fama internazionale (Capogrossi, De Matteis, Perrotti, Zurzolo), con quelle dei fisiopatologi, dei genetisti e dei clinici. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

GIUSEPPE BIANCHI, Libera Universita' "Vita Salute S.Raffaele" MILANO

Obiettivo del Finanziamento

Il presente progetto si inserisce nel filone di ricerca relativo alla definizione dei meccanismi genetico-molecolari che sottointendono malattie poligeniche e multifattoriali ad alto impatto sociale quale l'ipertensione arteriosa essenziale e le sue complicanze d'organo.
L'obiettivo cardine di tale progetto é di individuare e validare sul piano genetico, biochimico e funzionale alterazioni molecolari di proteine coinvolte nella regolazione dei trasporti ionici di membrana implicati nell'eziopatogenesi dell'ipertensione essenziale e delle sue complicanze.

La strategia adottata per perseguire tale obiettivo si avvale delle conoscenze di fisiopatologia fin qui acquisite per definire quale sia il meccanismo biochimico primariamente coinvolto e per poter eventualmente individuare nuovi meccanismi molecolari che si associano all'alterazione primaria, modulandola. Nel dettaglio tale strategia prevede di : a) definire un meccanismo biochimico-cellulare associato alla malattia, che nello specifico é rappresentato dal trasporto ionico attraverso la membrana cellulare; b) individuare quale tra le diverse proteine coinvolte nella regolazione di tale trasporto sia strutturalmente e funzionalmente diversa tra malati e sani, avvalendosi anche di modelli animali predittivi della patologia umana; c) stabilire se il gene che codifica per tale proteina presenta dei polimorfismi che si associano alla malattia sia nell'uomo che nel modello animale.
La possibilità che una strategia impostata sul cosidetto "gene candidato" possa fallire in quanto l'ipotesi patogenetica unica risulti incorretta o applicabile solo a una ristretta porzione di pazienti, fa parte del rischio connaturato alla ricerca genomica per la quale altre strategie possono venir adottate non prive di differenti fattori di rischio. Nello specifico tale rischio viene però consistentemente ridotto dalle acquisizioni scientifiche fin qui consolidate che indicano come alterazioni del trasporto cellulare di Na nel rene siano primariamente associate all'ipertensione, sia nell'uomo che nel ratto MHS, e come tali alterazioni funzionali siano sempre dimostrabili in presenza di polimorfismi nel gene della proteina citoscheletrica adducina.

Gli obiettivi specifici di questo progetto saranno pertanto i seguenti:

a) Conferma in nuove e diverse popolazioni che i polimorfismi di alfa (ADD1), beta (ADD2) e gamma (ADD3) adducina, da soli e/o in combinazione con quelli di altri geni come enzima di conversione dell'angiotensina (ACE) e aldosterone sintasi (CYP11B2) coinvolti nella regolazione dell'escrezione renale di Na, diano un "attributable risk" significativo per l'insorgenza dell'ipertensione e delle sue complicanze d'organo;

b) Definizione, mediante studi di genomica funzionale, delle interazioni proteiche che si associano ai geni alterati e che sottintendono i meccanismi molecolari responsabili delle alterate funzioni cellulari coinvolte nella patogenesi della malattia e delle sue complicanze d'organo. Questo secondo obiettivo, che prevede di analizzare le diverse funzione a seconda dei vari livelli di organizzazione biologica, si articolerà seguenti sotto-obiettivi:
b1) Definizione delle interazioni proteiche fra le tre subunità alfa, beta e gamma di adducina, fra adducina e Na-KATPasi e fra adducina e ACE. Risultati già acquisiti sia in sistemi cell free che in cellule in cultura indicano che ADD1 interagisce e coimmunoprecipita con la Na,K-ATPasi. L'obiettivo è quello perciò di consolidare questi dati verificando se a questa interazione partecipino altre proteine coinvolte nella regolazione del trasporto di Na, quali ad esempio quelle che regolano i processi di permanenza e endocitosi della Na,K-ATPasi sulla membrana cellulare, utilizzando cellule sia del distretto vascolare che renale in quanto primariamente coinvolte nella regolazione della pressione arteriosa. Si applicheranno sia tecniche di coimmunoprecipitazione che di interazione molecolare quali quella dei two-hybrids per l'identificazione di proteine non candidate.
b2) definizione delle alterazioni funzionali cellulari associate alle diverse varianti di adducina.
Si condurranno studi sia su culture cellulari primarie, ottenute da uomo (fibroblasti), da ratti del ceppo Milano e topi portatori del knock-out del gene della ADD2 (renali, vascolari, endoteliali), sia su linee cellulari stabilizzate transfettate con le diverse varianti di adducina umana e di ratto. Lo scopo è valutare quali anomalie funzionali si associano all'espressione delle varianti di adducina sia nelle linee primarie che transfettate. In particolare, si valuteranno gli effetti di adducina sulla regolazione del volume cellulare, del trafficking proteico di membrana con particolare attenzione al turn-over della Na,K-ATPasi e di altre proteine coinvolte nell'escrezione renale di sodio, quail CYP11B2 e ACE. Per valutare il ruolo dell'adducina sull'insorgenza delle complicanze d'organo soprattutto a livello vascolare si condurranno studi in cellule endoteliali e vascolari lisce transfettate atti a verificare se i processi di differenziamento, migrazione e neovascolarizzazione ridultino alterati in funzione delle diverse varianti di adducina. Questo obiettivo si fonda su evidenze sperimentali già acquisite che dimostrano come adducina partecipi alla formazione dei siti di contatto cellula-cellula e faccia parte di quella serie di focal adesion molecules che regolano l'interazione tra cellula e matrice extracellulare la cui alterazione può essere alla base del ben noto fenomeno di rarefazione dei capillari nell'ipertensione che a sua volta può favorire le complicanze d'organo.
b3) definizione delle alterazioni funzionali d'organo (fenotipi intermedi) che "in vivo" si associano alle diverse varianti di adducina.
Questo obiettivo verrà perseguito studiando in parallelo sia modelli animali rilevanti alla patologia umana portatori di polimorfismi di adducina (ratti Milano, topi knock-out per ADD2), sia soggetti affetti da ipertensione essenziale e sue complicanze portatori delle diverse varianti di adducina.
Lo scopo è verificare nell'uomo, come nel modello animale, l'associazione tra genotipo e fenotipi intermedi che siano congruenti con le alterazioni funzionali cellulari, molecolari e geniche verificate ai punti b1) e b2). Tali fenotipi riguarderanno soprattutto le funzioni d'organo collegate alla modulazione del trasporto ionico cellulare, quali l'handling del Na a livello renale, la risposta pressoria al sale, l'assetto ormonale relativo agli ormoni Na-dipendenti, la risposta farmacologica a terapie che influenzano l'omeostasi salina attraverso la modulazione della funzione/espressione di trasportatori di membrana.

Risultati attesi
La probabilità che gli obiettivi perseguiti dal presente progetto possano essere raggiunti con risultati positivi rispetto all'ipotesi scientifica di partenza si fonda su una serie di dati già acquisiti che suggeriscono come l'adducina svolga un ruolo rilevante nella regolazione della pressione arteriosa attraverso la modulazione dei processi di trasporto ionico cellulare che risultano alterati in presenza di adducina mutata (vedi referenze).
I risultati che si prevedono di ottenere dal presente progetto dovranno confermare tale ruolo dell'adducina e sostanziare l'ipotesi che esso venga amplificato e modulato in funzione del background genetico dell'individuo con particolare riferimento all'interazione con altri geni coinvolti nella regolazione della pressione e nello sviluppo delle complicanze d'organo connesse all'ipertensione.
Nel dettaglio si prevede di:
a) confermare in diverse popolazioni un "Attributable risk" (AR) positivo in funzione dei polimorfismi delle tre subunità di adducina, considerate singolarmente e in associazione fra loro, e in associazione con altri geni cosi' come descritto al punto 3.2. Questi dati potranno essere utilizzati sia per identificare, tramite la genotipizzazione dei soggetti, quelli con la piu' alta probabilità di sviluppare ipertensione e complicanze d'organo quali le alterazioni vascolari e la nefropatia, sia per definire quale sia la combinazione di subunità di adducina e di sue varianti genetiche che è piu' "patogena". .
b) Definire la sequenza di eventi che partendo dal gene mutato e dal suo prodotto proteico comporti alterazioni dell'interazione con altre proteine direttamente responsabili della regolazione dell'escrezione renale di sodio. La definizione di questi meccanismi permetterà poi di sviluppare strategie terapeutiche mirate alla correzione del difetto primario con conseguente miglioramento della risposta terapeutica e della compliance del paziente.
Per i diversi sottoobiettivi si prevede di ottenere i seguenti risultati:
b1) identificazione delle proteine che insieme all'adducina partecipano alla regolazione del processo di esocitosi, inserzione sulla membrana e endocitosi della Na,K-ATPasi . Dati perliminari indicano infatti che in presenza di adducina mutata (variante ipertesa) il processo di endocitosi della Na,K-ATPasi è rallentato con conseguente aumento del tempo di residenza sulla membrana della pompa aumento del numero di pompe funzionanti nell'unità di tempo. Si prevede di identificare nel numero delle proteine coinvolte nell'endocitosi e già note (clatrina, AP2, Rab etc) quelle che interagendo con l'adducina e la pompa Na-K vengano differentemente modulate in funzione del genotipo di adducina portando alle differenze di endocitosi già osservate. Alternativamente e congiuntamente, l'identificazione di nuove proteine che interagiscono sia con adducina che con la pompa e che non siano strettamente collegate al traffico cellulare della pompa potrà avvenire mediante la tecnica dei two hybrids. Questo approccio servirà soprattutto a identificare le proteine coinvolte nei processi di cross-talking cellulare e di interazione tra cellula e matrice extracellulare che se alterati in conseguenza delle mutazioni di adducina possono essere responsabili dei fenomeni di danno d'organo connessi all'ipertensione.
b2) definizione del pattern funzionale relativo al trasporto di Na in cellule renali e vascolari sia primarie che transfettate con le diverse varianti di adducina. Ci si attende di confermare l'alterazione del processo di endocitosi della pompa Na-K in presenza di adducina mutata ed eventualmente anche quello del trasporto endocellulare ed esposizione sulla membrana di ACE in cellule renali transfettate; conseguentemente di verificare un aumento dell'esposizione di pompe sulla membrana cellulare responsabile di un aumentato trasporto ionico transepiteliale e di una alterazione della regolazione del volume cellulare. Coltivando cellule primarie (fibrobalsti) espiantate da soggetti con diversi genotipi per adducina e ACE o da ratti Milano e topi knock-out per la ADD2 (renali, vascolari) ci si attende di verificare alterazioni dei processi di cui sopra analoghe a quelle osservate nelle cellule transfettate.
b3) In analogia con quanto atteso a livello cellulare si prevede di definire, prima nel modello animale (ratto Milano e ceppi congenici derivati), e poi nell'uomo, con opportuni adattamenti sperimentali, le caratteristiche funzionali del rene, della risposta pressoria a variazioni di intake sodico, dell'assetto ormonale relative a un determinato genotipo per adducina e adducina piu' ACE e CYP11B2. Questo permetterà di diagnosticare sul piano funzionale i pazienti identificando i soggetti proni a sviluppare forme di ipertensione Na-sensibile e suscettibili di essere curati con terapie atte a modulare tale Na-sensibilita'.

Le ricadute scientifiche di tali studi sono evidenti e riguardano la possibilità di: a) sviluppare strategie diagnostiche atte a identificare precocemente i soggetti a rischio per l'ipertensione e le sue complicanze; b) attuare strategie comportamentali (dieta) e terapeutiche mirate a prevenire tale insorgenza; c) indicare nuovi target terapeutici per lo sviluppo di nuovi farmaci causali. Ma soprattutto una delle ricadute piu' importanti sarà quella di costituire una rete di collaborazione tra Ricercatori di base e Clinici che rappresenta l'unica possibilità di affrontare in tutti I suoi vari aspetti un problrma cosi' complesso come quello di identificare I meccanismi molecolari di una malattia comune di natura poligenica-multifattoriale.<<<

Durata

36 mesi