RICERCA ITALIANA     

INGEGNERIA TISSUTALE: SVILUPPO DI NUOVE STRATEGIE PER LA RIGENERAZIONE DEL PARODONTO E DELL'OSSO ALVEOLARE MEDIANTE CELLULE MESENCHIMALI DI DERIVAZIONE EMATOPOIETICA NELL'ANIMALE E NELL'UOMO. VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI SISTEMICI.

Università degli Studi di Milano-Bicocca

Abstract

Tra gli approcci terapeutici alle malattie parodontali o alla rigenerazione dell'osso durante l'osseointegrazione nelle creste alveolari atrofiche, le procedure per la rigenerazione dei difetti parodontali o ossei non sono ancora perfettamente prevedibili.
Per quanto riguarda la rigenerazione parodontale, molte procedure chirurgiche non hanno un completo successo istologico, poiché rigenerano raramente tutti i componenti del parodonto (osso alveolare, cemento, legamento parodontale con guadagno di nuovo attacco connettivale), frequentemente provocano un'eccessiva migrazione apicale dell'epitelio e non ristabiliscono mai perfettamente le caratteristiche anatomiche precedenti.
A volte, per quanto riguarda la chirurgia implantare avanzata, le procedure prevedono un ulteriore e contemporaneo prelievo chirurgico dell'osso in sedi anatomiche non orali, aumentando i rischi chirurgici, la morbosità ed i disagi postoperatori.
Recentemente, nuovi approcci biologici ad alcuni disordini specifici hanno esplorato il potenziale dell'Ingegneria Tessutale, con ricerche di laboratorio, sull'animale e, raramente, sull'uomo.
L'Ingegneria Tessutale prevede lo sviluppo di tecniche per la costruzione di nuovi tessuti in sostituzione di quelli danneggiati. Essa è basata sui principi della biologia delle cellule, della biologia inerente allo sviluppo e della scienza dei biomateriali. Questo campo di ricerca biomedica applicata attrae l'attenzione considerevole sia dei settori pubblici che privati a causa dell'elevato potenziale economico.
Questa ricerca longitudinale intende utilizzare modelli animali e di laboratorio per applicare i principii dell'Ingegneria Tessutale alla rigenerazione parodontale e dell'osso alveolare durante la terapia osseointegrativa; successivamente, se i risultati degli studi pre-clinici indicheranno un positivo contributo delle procedure analizzate per le terapie rigenerative selettive parodontali/ossee e dopo la verifica della sicurezza biologica di queste terapie, sarà esplorata una prima fase nell'essere umano, con le appropriate approvazioni della Commissione Etica e sotto un adatto monitoraggio dei parametri sistemici. Il processo è favorito dalla possibilità di generare clinical-grade MSC da midollo osseo umano e dalle applicazioni più recenti in fase di studio che già hanno dimostrato la loro sicurezza e beneficio nel contesto del trapianto umano di stem cells.
I risultati ottenuti saranno utili per i nuovi metodi terapeutici.
Il programma di ricerca è costituito da tre Unità Operative, appartenenti a tre università differenti (Milano-Bicocca, Cagliari, Roma-La Sapienza), che già hanno verificato e caratterizzato i modelli selezionati.
Campo Parodontale (Milano-Bicocca, Cagliari): nei primi 18 mesi, isoleremo, differenzieremo e faremo proliferare Cellule Staminali Mesenchimali (aMSC), con e senza scaffolds, producendo linee cellulari parodontali. 300 animali (ratti), con 3 differenti modelli di difetto parodontale (legatura-indotto, difetti parodontali chirurgicamente creati e periodontal wound windows), saranno sottoposti ad una engineered regeneration parodontale, sotto controllo standardizzato clinico, di laboratorio, istologico e strumentale. Inoltre, analizzeremo, in un campione animale limitato, la potenzialità delle aMSC impiantate di differenziare in vitro e nel modello animale nelle linee cellulari neuronali, per identificare il rischio sistemico latente collegato con la diffusione di queste cellule dopo impianto.
Se i risultati di questi studi pre-clinici indicheranno il contributo positivo delle engineered procedures per terapie rigeneratrici parodontali, una fase successiva dello studio, che durerà 18 mesi, sarà esplorata in 100 uomini affetti da malattia parodontale, sotto le approvazioni del Comitato Etico e sotto appropriato monitoraggio dei parametri sistemici.
Campo della Rigenerazione dell'Osso Alveolare e Osseointegrazione (Milano-Bicocca, Cagliari, Roma-La Sapienza): nei primi 18 mesi, isoleremo, differenzieremo e faremo proliferare Cellule Staminali Mesenchimali (aMSC), con e senza scaffolds, producendo il linee cellulari ossee. 200 animali (roditori), con 2 modelli differenti di difetti ossei (difetti transmandibolari chirurgicamente creati nel ratto e impianti dentali con filettatura esposta nella tibia di coniglio), saranno sottoposti ad una engineered regeneration ossea, sotto controllo standardizzato clinico, di laboratorio, istologico e strumentale. Se i risultati di questi studi pre-clinici indicheranno il contributo positivo delle engineered procedures per le terapie rigeneratrici selettive dell'osso alveolare, una seguente fase dello studio, che durerà altri 18 mesi, sarà esplorata in 100 uomini con la necessità di riabilitazione orale implantare e grave atrofia mascellare, sotto le approvazioni del Comitato Etico e sotto monitoraggio dei parametri sistemici.
Questo studio costituisce un'innovazione assoluta nel panorama della ricerca scientifica italiana ed internazionale, non soltanto per il metodo multidisciplinare, ma anche per l'originalità dell'ipotesi iniziale e per l'importanza terapeutica, sociale ed economica che può avere. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

MARCO GIOVANNI BALDONI, Universita' degli Studi di MILANO-BICOCCA

Obiettivo del Finanziamento

Questo studio intende valutare la potenzialità dell'Ingegneria Tessutale per la rigenerazione parodontale ed ossea nello scheletro orale. Fra le cellule differenti che sembrano contribuire ai processi di rimodellamento tissutale, le cellule mesenchimali sono le più adatte allo scopo dello studio. Il midollo osseo dell'adulto contiene le cellule staminali mesenchimali (MSC), che contribuiscono alla rigenerazione dei tessuti mesenchimali, quali l'osso, la cartilagine, il muscolo, il legamento, il tendine, il grasso animale e lo stroma. La coltura espansa delle MSC verrà differenziata, in modo controllato, in linee cellulari multiple.
La ricerca verrà condotta attraverso modelli nell'animale e di laboratorio e, infine, attraverso un approccio all'uomo. Ogni fase permetterà l'analisi degli eventi biologici che producono la rigenerazione del legamento parodontale, del cemento e dell'osso alveolare a partire dalle cellule mesenchimali.
Nella prima parte dello studio intendiamo produrre le adeguate condizioni di coltivazione in vitro, per ottenere MSC dalle cellule progenitrici del midollo osseo del coniglio e del ratto. Quindi valuteremo la capacità delle MSC di differenziare nei cementoblasti, osteoblasti e fibroblasti, analizzeremo i mediatori umorali, l'attività cellulare e tissutale e le caratteristiche della differenziazione cellulare delle cellule mesenchimali. Un secondo obiettivo importante è la definizione di uno scaffold bioassorbibile che possa essere tagliato e modellato nelle forme volute. Le cellule possono essere seminate e coltivate nello scaffold in vitro per permettere la sintesi d'una matrice adatta all'impianto nei tessuti danneggiati. L'engineered material dovrebbe essere di consistenza sufficiente per permettere la sua collocazione all'interno del difetto parodontale od osseo e per impedire il collasso dei tessuti riposizionati sul luogo del difetto. Quindi, il materiale dovrebbe rispettare i principi della rigenerazione guidata del tessuto. L'architettura interna dello scaffold dovrebbe permettere la colonizzazione veloce da parte delle cellule e la crescita interna di tessuti compatibili con quelli da rigenerare (cemento, legamento parodontale, osso). Gli engineered tissues dovrebbero fungere da barriera alla crescita di tessuti indesiderabili, ma l'architettura interna dello scaffold deve essere conduttiva per la crescita del tessuto. Il materiale dello scaffold dovrebbe essere biodegradabile, permettendo la graduale sostituzione con il tessuto rigenerato. Poiché la rigenerazione del tessuto attraverso l'uso di un materiale bioingegneristico sembra essere dipendente dalla porosità e dal diametro del poro, la pianificazione dell'utilizzo di tale materiale deve includere la considerazione in merito al diametro del poro, al fine di permettere l'adesione e l'incorporazione delle cellule in vitro così come la successiva maturazione del tessuto durante la rigenerazione in situ. La matrice sintetica dovrebbe essere costruita da un materiale con affinità per l'assorbimento di fattori di crescita e differenziazione come pure di integrine, di recettori cellulari ed altre molecole istruttive presenti normalmente nei tessuti in rigenerazione.
Non appena saranno stabilite le condizioni per la coltura in vitro delle MSC dal precursore del midollo osseo, sarà studiato l'uso potenziale nel modello animale di engineered regeneration parodontale e ossea. Più specificamente intendiamo usare modelli animali differenti. Il periodontal window wound model attraverso la superficie vestibolare della mandibola del ratto, sviluppato da Melcher e modificato da Gould, facilita gli studi sull'omeostasi del legamento parodontale, poiché parti precise dell'osso alveolare e del legamento parodontale possono riproducibilmente essere rimosse. Il secondo modello (modello di malattia parodontale indotta da legature) è costituito dal posizionamento di legature sintetiche attorno alla circonferenza e sotto l'equatore dentale, estremamente vicino al margine gengivale, permettendo il libero accumulo della placca e lo sviluppo di malattia parodontale. Il terzo modello è costituito da lesioni della formazione ed altre lesioni parodontali chirurgicamente create (difetti ossei a 1, 2, 3 pareti e difetti sopraossei).
Per quanto riguarda la rigenerazione dell'osso alveolare, verranno usati difetti transmandibolari chirurgicamente creati sulla superficie vestibolare dell'osso del ratto e l'inserzione di impianti dentali incompletamente coperti dall'osso (con alcune spire esposte) nella tibia di coniglio (Dahlin).
In tutti i modelli, le cellule coltivate saranno introdotte da sole o attraverso scaffolds.
Le cellule usate durante la chirurgia parodontale o ossea saranno cellule mesenchimali (non stimolate alla differenziazione attraverso i messaggi istruttivi) o cellule differenziate (stimolate con messaggi istruttivi e differenziate nelle cellule utili per la rigenerazione parodontale od ossea).
I risultati istologici, radiografici e clinici della terapia saranno valutati attraverso i mezzi convenzionali. L'analisi istologica valuterà la ripopolazione e la differenziazione delle cellule del legamento parodontale e dell'osso alveolare nei tessuti in corso di guarigione e definirà come le popolazioni cellulari di legamento parodontale e osso ristabiliscono i loro domini cellulari nel tessuto. L'analisi radiografica e clinica permetterà la valutazione dei risultati funzionali della terapia e la comprensione dell'influenza della procedura chirurgica e dei parametri orali sul risultato della terapia.
Se i risultati degli studi pre-clinici indicheranno il contributo positivo delle MSC nella rigenerazione parodontale ed ossea, sarà esplorata una prima fase di studio sull'uomo, dopo approvazione del Comitato Etico. Il processo è facilitato dalla possibilità di generare clinical-grade MSC da midollo osseo umano e dalle applicazioni più recenti in fase di studio che già hanno dimostrato una certa sicurezza e beneficio nel contesto del trapianto umano della cellula staminale.
Poiché la sicurezza sistemica dell'impianto delle cellule staminali per la rigenerazione parodontale non è ancora completamente stabilita, intendiamo controllare l'eventuale alterazione sistemica concomitante. Per verificare la localizzazione delle MSC dopo il loro impianto parodontale od osseo, esploreremo estesamente la potenziale interferenza a livello cardiovascolare, renale, polmonare e neurologico delle MSC; questi risultati contribuiranno ad identificare alterazioni morfologiche o funzionali a seguito di terapia rigenerativa parodontale e ossea. A tal fine, ci si prefigge di isolare una sotto-popolazione di cellule staminali di origine mesenchimale e indurla a differenziare in vitro in fenotipo neuronale, sapendo che esistono già protocolli per il differenziamento di cellule staminali neuronali (Pagano, 2000) e sapendo che ci sono evidenze di una sovrapposizione genetica per l'ematopoiesi e la neuropoiesi (Quesenberry, 1999; Woodbury, 2000; Geschwind, 2001; Terskikh, 2001). Le HSC CD34+/CD90+/CD38-/Lin- ottenute da donatori sani potranno essere selezionate per gli studi di proliferazione e differenziamento neuronale in DMEM-F12 arricchito con EGF e bFGF, in presenza di LIF. Verrà testata su queste cellule la presenza di markers neuronali (Neu-N, III-b-tubulina e NF-H) ed anche di GFAP, marker astrocitario e F4/80 come marker gliale. Si verificherà anche la presenza di CREB-P, come mediatore di segnali di trasduzione neuronale e quindi implicato nella proliferazione cellulare (Johnson, 2000). Si studieranno gli effetti delle NT, come BDNF e NT3, e l'influenza dell'acido retinoico per i processi di proliferazione e differenziamento in fenotipo neuronale (Takahashi, 1999; Nicolini, 1998). Verrà inoltre studiato il ruolo del glutammato, principale neurotrasmettitore eccitatorio che ha un ruolo nei fenomeni di differenziamento, plasticità sinaptica ed apoptosi (eccitottossicità) (Kavanaugh B, 2000; Lin, 2001). Queste indagini verranno effettuate anche su linee di neuroblastoma umano SH-SY5Y, già utilizzate nel nostro laboratorio come controllo neuronale e come modello di stress ossidativo e compromissione del trasporto di glutammato.
I dati ottenuti da questo lavoro sperimentale potranno essere utili per studiare i meccanismi candidati a regolare la differenziazione e la proliferazione di un fenotipo neurale derivato da cellule periferiche e, allo stesso tempo, per indagare le possibili applicazioni terapeutiche future delle cellule staminali nei disordini neurologici acuti e cronici.
Tutte le Unità Operative in questione già hanno usato i modelli animali descritti per altri progetti di ricerca. Saranno incluse 3 Unità Operative, appartenenti a tre università differenti (Milano-Bicocca, Cagliari, Roma-La Sapienza), selezionate per la loro vasta esperienza nell'integrazione delle finalità e delle competenze differenti.
Le unità intendono organizzare il loro lavoro con le seguenti priorità:
1. fase di laboratorio:
a. isolamento delle cellule progenitrici;
b. determinazione dello scaffold biodegradabile per la coltura e l'impianto delle cellule;
c. crescita e differenziazione delle cellule progenitrici in cellule rigeneratrici parodontali ed ossee (cementoblasti, fibroblasti ed osteoblasti).
2. fase animale ed umana:
a. determinazione del metodo chirurgico per l'ingegneria parodontale ed ossea;
b. valutazione dei risultati chirurgici con l'analisi istologica, radiografica e clinica;
c. valutazione dei parametri orali ed anatomici che influenzano i risultati della terapia;
d. confronto fra le procedure rigenerative parodontali ed ossee tradizionali (scaling e root planing, gestione del lembo, innesto di osso, rigenerazione guidata del tessuto) e l'ingegneria rigenerativa parodontale ed ossea;
e. valutazione dell'efficacia del condizionamento di superficie della radice con fattori di crescita sui risultati dell'ingegneria parodontale;
f. valutazione dell'efficacia delle proteine morfogenetiche dell'osso sui risultati dell'ingegneria ossea;
g. valutazione della sicurezza biologica e sistemica delle procedure rigenerative parodontali ed ossee con Ingegneria Tessutale.<<<

Durata

36 mesi