RICERCA ITALIANA     

Sviluppo di Tecnologie Avanzate per lo Studio della Proteomica Differenziale del Segnale (Segnalo-Proteomica)

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

Scopo primario del progetto è lo studio differenziale di proteomi e/o complessomi proteici coinvolti in diverse fasi dei processi di trasduzione del segnale mediante lo sviluppo di strategie e tecnologie fortemente innovative.
La vita di una cellula dipende da una moltitudine di processi metabolici regolati, a partire dalla capacità di riconoscere e rispondere a stimoli esterni. L'attività cellulare può essere descritta come l'insieme di processi di attivazione, stabilizzazione dei complessi molecolari attivati, e la loro degradazione. La caratterizzazione dell'insieme di proteine modificate in vivo dalla fosforilazione proteica (fosfoproteoma) è essenziale per la comprensione dei meccanismi regolativi della trasduzione di segnale. Un primo obbiettivo del progetto, oltre l'identificazione delle proteine coinvolte in un determinato segnale, è l'individuazione dei residui riconosciuti dai sistemi enzimatici chinasi/fosfatasi in varie condizioni di crescita cellulare. Un secondo obbiettivo è costituito dalla comprensione dei processi globali di risposta agli stimoli Ca+2 dipendenti che comportano la formazione dei legami isopeptidici catalizzati dalle transglutamminasi con l'obiettivo di identificare differenzialmente le proteine ed i residui amminoacidici coinvolti (transglutammoma). La coniugazione con ubiquitina costituisce un importante momento metabolico nella fase dello spegnimento del segnale, la definizione del proteoma legato al processo di ubiquitinazione (ubiquitinoma) rappresenta un terzo obbiettivo del progetto. Infine, l'identificazione delle subunià costitutive di recettori ionotropi ancestrali e di recettori nucleari orfani, la caratterizzazione dei loro ligandi e l'identificazione delle molecole strutturali complementari (caderine, catenine, proteine di ancoraggio) costituisce un quarto obbiettivo per l'analisi dinamica dei meccanismi di segnalazione cellulare (complessomi recettoriali).
Il ventaglio di obbiettivi proposti punta all'identificazione di complessi molecolari fondamentali nei diversi sistemi cellulari. Ciò offrirà la possibilità di iniziare a dissezionare la complessità del proteoma, che, per la combinazione delle diverse modifiche post-sintetiche, aumenta rispetto alla parte espressa del genoma di due, o anche, tre ordini di grandezza.
Il conseguimento di obbiettivi di così vasta portata richiede il sostegno di adeguate metodologie di indagine. La spettrometria di massa si è rivelata la metodologia chiave nello studio della proteomica. L'identificazione di proteine, native e sottoposte a modifiche post-traduzionali, separate mediante tecniche elettroforetiche, è condotta attraverso mappe peptidiche ottenute per spettrometria di massa MALDI-TOF. Questo approccio tuttavia lascia ancora irrisolti molti problemi di separazione/purificazione e di identificazione di complessi proteici. Una parte essenziale del progetto è costituita dalla messa a punto di nuove tecniche di elettroforesi e cromatografia multidimensionale, essenzialmente basate su processi di affinità. Per l'identificazione di complessi molecolari e di proteine ad alto peso molecolare o poco abbondanti nei preparati bidimensionali è in fase di sviluppo una nuova metodologia di analisi spettrometrica basata sulla disponibilità di un prototipo equipaggiato con rivelatori criogenici. Questa tecnologia sarà sviluppata da uno dei gruppi partecipanti e sarà complementare alla spettrometria MALDI-TOF, di cui un altro gruppo di ricerca ha consolidata esperienza.
In sintesi, il progetto si propone di analizzare alcuni aspetti di proteomica funzionale mediante tecnologie fortemente innovative utilizzando differenti sistemi enzimatici in vitro ed in vivo; librerie di peptidi fagiche o sintetiche; recettori transmembranari e nucleari e loro complessi supramolecolari), sistemi modello (lievito, hydra, topo) e sistemi cellulari (macrofagi, cellule neuroectodermiche). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

GENNARO MARINO, Universita' degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Finanziamento

Il progresso delle conoscenze nel campo della proteomica funzionale richiede il sostanziale miglioramento delle metodologie oggi disponibili per quanto riguarda l'aumento della sensibilità strumentale associata alla possibilità di determinazioni quantitative praticabili ed affidabili. Lo scopo finale di questo progetto è lo sviluppo di significativi avanzamenti degli studi di proteomica differenziale. Allo scopo di affrontare obbiettivi di così vasta portata gli interessi del progetto sono centrati sull'analisi proteomica differenziale in rapporto ai principali eventi della trasduzione del segnale, una problematica di frontiera della genomica funzionale. Spettrometria di massa e metodi di separazione multidimensionale sono i metodi di elezione per studi di proteomica; per questo i più esperti gruppi italiani nel campo della spettrometria di massa biomolecolare e di tecniche di prefrazionamento intendono unire i loro sforzi a quelli di un eccellente gruppo di ricerca specializzato in fisica delle basse temperature, che ha contribuito a sviluppare un prototipo di spettrometro di massa MALDI estremamente sensibile. Diversi gruppi di ricerca, tutti impegnati su tematiche di ricerca avanzate e di frontiera nel campo della biologia cellulare e molecolare ed internazionalmente riconosciuti, intendono coordinare i loro programmi di ricerca sulle problematiche della trasduzione del segnale, con il duplice obbiettivo di integrare le diverse specifiche competenze e di approfondire le conoscenze nel loro settore grazie al ricorso a nuove strategie e nuove metodologie per studi di proteomica già disponibili o previste da questo progetto.
L'uso di uno spettrometro di massa di nuova concezione, dotato di rivelatori criogenici, per studi di proteomica costituisce un obbiettivo in sè e può aprire la strada alla scoperta di proteine finora sconosciute in grado di modulare a livello fine i segnali cellulari. E' ragionevole supporre che questi prodotti di espressione e/o le loro forme modificate siano transienti, e quindi presenti nelle cellule solo in pochi esemplari, sfuggendo perciò all'individuazione dati i limiti di sensibilità delle metodiche oggi disponibili. Obbiettivo di questa parte del progetto è 1)introdurre nell'ambito della spettrometria di massa di macromolecole una strumentazione innovativa, ossia il primo prototipo di spettrometro di massa MALDI-TOF equipaggiato con rivelatori criogenici basati su dispositivi superconduttori, allo scopo di aumentare la sensibilità e la risoluzione per l'analisi di proteine di elevata massa molecolare. La tecnologia chiave su cui si basa questo spettrometro di ultima generazione è quella dei rivelatori criogenici. Questi hanno una sensibilità ed una efficienza tali da rivelare singole macromolecole con masse oltre i 150 kDa con un elevato rapporto segnale/rumore ed una efficienza del 100%, risultando particolarmente utili laddove sono disponibili solo piccolissime quantità di materiale da analizzare o specie in traccia. In confronto con gli attuali rivelatori a ionizzazione utilizzati nei tradizionali spettrometri TOF si può raggiungere un miglioramento di tre ordini di grandezza nell'efficienza intrinseca di rivelazione. 2) applicare con successo la strumentazione descritta per l'identificazione e lo studio delle proteine di interesse del progetto. 3) qualificare in termini di prestazioni tale strumentazione innovativa al fine di valutare il vantaggio apportato da questa nuova tecnologia nell'affrontare problematiche complesse quali quelle di oggetto del presente progetto. Inoltre, la combinazione dell'estrema sensibilità della nuova macchina con una nuova generazione di marcatori (Isotope Coded Affinity Tags) può permettere di analizzare le modifiche subite dalla molecola bersaglio di eventi di trasduzione del segnale in termini quantitativi rigorosi. Infine lo sviluppo di nuovi protocolli di prefrazionamento di miscele peptidiche provenienti dall'idrolisi di preparati biologici costituisce il fondamentale complemento metodologico delle innovazioni descritte e sarà il principale compito dell'UR Verona
I risultati attesi sono descritti per esteso nei Work Packages individuati, e riguardano fondamentalmente la scoperta di substrati specifici, con metodi analitici di proteomica differenziale, nel ciclo di fosforilazione/ defosforilazione, nel processo di ubiquitinazione e negli eventi di transglutaminazione, e di proteine recettoriali o di complessi recettoriali multimolecolari. In sintesi, le ricerche verranno dirette e coordinate sui seguenti obbiettivi:
L'identificazione dei siti di fosforilazione e le variazioni proteomiche del livello di fosfoproteine sarà condotta dall'Unità di Napoli in collaborazione con le Unità di Firenze e Padova utilizzando un approccio multifase basato sull'uso di reagenti ICAT: i) trasformazione di Ser-P e Thr-P in deidroalanina o acido deidro-ammino 2-butirrico rispettivamente mediante reazione di beta eliminazione; ii) introduzione del reattivo ICAT attraverso addizione di Michael del gruppo tiolico libero al gruppo vinilico della DSer e/o DThr utilizzando spacers marcati e non marcati; iii) isolamento dei peptidi modificati mediante cromatografia di affinità con streptavidina iv) analisi quantitativa dei peptidi mediante spettrometria di massa. L'abbondanza relativa dei vari componenti proteici sarà determinata dalle intensità relative delle coppie di peptidi marcati con le forme leggere e pesanti del reattivo, e quindi differenti di 8 Da. Le miscele proteiche da cellule in varie condizioni verranno trattate con questi reattivi ed idrolizzate enzimaticamente. I peptidi modificati saranno selezionati attraverso l'uso della cromatografia di affinità con streptavidina e caratterizzati mediante MS consentendo l'identificazione dei substrati specifici.
Si punterà all'identificazione, nel fosfoproteoma del lievito, di "famiglie" di proteine fosforilate che sono substrati, rispettivamente, della CK2 e della piD261. Inoltre, attraverso l'analisi del proteoma fosforilato del Golgi, facilitata dal numero limitato di protein chinasi presenti in questo compartimento subcellulare, sarà possibile ottenere un panorama completo dei substrati endogeni anche di un'altra chinasi in parte caratterizzata, la "casein chinasi del Golgi (G-CK)", una chinasi pleiotropa ed ubiquitaria, i cui ruoli fisiologici, a parte quello molto specialistico di fosforilare la caseina nella ghiandola mammaria dei mammiferi, sono ancora poco compresi. Il progetto della UO di Firenze prevede sia l'identificazione di proteine cellulari (substrati e altri partners molecolari) capaci di formare complessi con la LMWPTP e con l'ACP, sia studi sull'effetto di stimoli extracellulari, in particolare da fattori di crescita e stimoli ossidativi, sull'azione cellulare e la localizzazione delle due fosfatasi.
Il legame covalente dell'ubiquitina a specifiche proteine bersaglio all'interno della cellula rappresenta un meccanismo regolatorio particolarmente sofisticato coinvolto in numerosi processi biologici, dall'eliminazione di proteine danneggiate fino al controllo della popolazione dei recettori GABA ergici sulla superficie cellulare. Allo
stesso modo, la transglutamminazione è un evento-chiave regolato dal Ca+2 implicato in vari stati fisio-patologici ed in differenti stadi di vita della cellula. L'identificazione delle specifiche proteine bersaglio dell'ubiquitina e dei substrati della TGase verrà condotta dall'Unità di Napoli in collaborazione con l'UO di Roma utilizzando peptidi sintetici substrati della Tgase ed ubiquitina opportunamente
modificati con biotina. 1) Analisi delle proteine target utilizzate in vivo dalle TGs come substrato in condizioni normali (differenziamento epidermico, apoptosi) e in condizioni patologiche (malattie neurodegenerative, morbo celiaco). 2) Studio delle modificazioni post-traduzionali dei substrati con identificazione dei residui aminoacidici interessati. 3) Identificazione di eventuali domini regolatori (ad esempio, BH3) sulle TGs in grado di regolare la loro attivita' enzimatica e il loro coinvolgimento nei vari processi biologici specifici.
L'integrazione del laboratori interessati ai fenomeni di segnalazione cellulare può costituire un valore aggiunto del progetto, poiché può portare alla scoperta di molteplici eventi post-trascrizionali per uno stesso prodotto di espressione, in relazione a condizioni fisio/patologiche ancora sconosciute. Ciò può risultare particolarmente vero per quanto riguarda i recettori cellulari il cui inserimento e stabilizzazione nella membrana sono probabilmente regolati da molte modificazioni. Gli obbiettivi specifici di questa parte del progetto saranno sviluppati dall'UR CNR IC-IIGB, in collaborazione con la UR di Napoli e con la UR CNR IC, e sono i seguenti: Caratterizzazione molecolare di subunità di recettori ionotropici di tipo inibitorio (recettori per GABA e glicina) presenti in un sistema nervoso primitivo (Hydra vulgaris, Cnidaria, Hydrozoa); analisi trascrizionale e funzionale. Descrizione dei complessi recettoriali multimerici identificati. Questo primo obiettivo mira alla comprensione della derivazione filogenetica dei recettori ionotropici di mammifero. Identificazione ed eventuale caratterizzazione di proteine di ancoraggio coinvolte nel clustering dei recettori di interesse in Hydra, quali gefirina, GABARAP, Plic-1. Identificazione dei ligandi di recettori nucleari orfani in colture primarie dopaminergiche e in linee cellulari neuroectodermiche di roditore (Nurr1). Caratterizzazione del complesso proteico che regola l'espressione dei geni bersaglio del fattore trascrizionale Nurr1.
Applicazione di nuove metodiche e tecnologie di spettrometria di massa (MALDI-TOF, spettrometria criogenica, eventualmente cromatografia multidimensionale) a preparati di notevole complessità quali estratti crudi di membrane eucariotiche (Hydra) e ad estratti nucleari di colture primarie e linee cellulari di roditore. Analisi differenziale degli estratti cellulari nella configurazione di riposo e attivata.<<<

Durata

36 mesi