RICERCA ITALIANA     

Sviluppo di molecole innovative per potenziare la risposta immune cellulo-mediata, e di vaccini peptidici e a DNA per l'immunoterapia della Tubercolosi.

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Il progetto ha due obiettivi: (1) produrre ligandi sintetici in grado di stimolare la risposta immunitaria naturale mediante l'attivazione di linfociti T con recettore per l'antigene (TCR) gamma-delta e di linfociti T CD1 ristretti (NKT), (2) produrre un modello di vaccino antitubercolare in grado di stimolare tutte le popolazioni cellulari coinvolte nella risposta protettiva sia acquisita che naturale usando (2A) peptidi sintetici e (2B) un vaccino a DNA policistronico.

Il primo obiettivo del progetto è la valutazione di almeno uno o due composti capaci di potenziare l'immunità naturale, specialmente in soggetti immunocompromessi, quali dializzati, trapiantati, neonati, anziani, e pazienti HIV+, nei quali risulta difficile generare una risposta acquisita efficiente con i vaccini batterici o sintetici. Lo scopo di questi studi è di attivare i linfociti che esprimono il recettore per l'antigene gamma delta e i linfociti NKT che sono CD1d ristretti. Queste due sottoclassi di linfociti riconoscono e sono attivate da antigeni non proteici naturalmente presenti nel metabolismo di procarioti ed eucarioti. Per l'identificazione di nuovi composti in grado di attivare i linfociti T gamma-delta verranno generati tramite chimica combinatoriale ed analizzati ligandi che possano interagire con il recettore gamma-delta di cui recenti studi cristallografici hanno elucidato la struttura terziaria. Per l'identificazione di composti capaci di attivare i linfociti NKT, verranno sintetizzati glicolipidi quali l'alpha-galactosylceramide (alfa-galcer), capaci di legare la molecola CD1d, l'elemento di restrizione delle cellule NKT.
Le strutture sintetizzate dalle U.R. chimiche del Progetto e individuate come immunologicamente attive saranno valutate in vivo nei seguenti modelli animali:
- il Marmoset (Callitrix iacchus iacchus) per l'analisi dell'attività delle molecole selezionate per attivare i linfociti T gamma-delta umani. L'impiego di questo modello animale è reso necessario dal fatto che solo i primati hanno un recettore T gamma-delta con specificità antigeniche simili a quello umano;
- la cavia per l'analisi dell'attività di glicolipidi quali l'alfa-galcer, che è un prodotto naturale ritrovato nelle spugne ma che non è presente nelle cellule di mammifero.
Per ambedue queste classi di molecole verranno studiate le modalità di inoculo, le dosi e la biodistribuzione, e la loro capacità di stimolare i rispettivi target in vivo, con particolare riferimento all'espansione delle popolazioni target nel sangue periferico e nei vari tessuti, ed alla produzione di citochine proinfiammatorie (IFN-gamma, TNF-alpha) e regolatorie (IL-4, IL-10).

Il secondo obiettivo del Progetto riguarda la messa a punto di un modello di vaccino anti-tubercolare terapeutico post-infezione, usando sia peptidi che DNA. Ambedue questo modelli di vaccino si baseranno su un'immunizzazione con prodotti genici selezionati (1) per la presenza nel genoma del ceppo di collezione virulento H37Rv ma non in quello del ceppo di collezione attenuato H37Ra o (2) per la loro espressione in pazienti con tubercolosi polmonare. Delle proteine prodotte da questi geni verranno selezionati gli epitopi immunodominanti. A tal fine oltre a geni già identificati dai gruppi proponenti, nuovi geni la cui espressione correli positivamente con la sopravvivenza intracellulare e l'invasività del micobatterio verranno identificati mediante l'uso di microarray. Nel contesto delle conoscenze attuali sulla struttura e sui meccanismi di selezione di peptidi antigenici da parte delle molecole MHC è possibile identificare sequenze proteiche in grado di legarsi ai recettori MHC e conseguentemente di attivare i linfociti T. Pertanto, il progetto si propone di identificare sequenze peptidiche immunodominanti dei geni micobatterici selettivamente attivati nell'infezione naturale umana. I peptidi selezionati saranno modificati con aggiunta di (1) sequenze in grado di ancorare i peptidi antigenici alla membrana con appositi spaziatori (identificati con approcci di chimica combinatoriale) in modo da facilitare l'associazione con molecole MHC di classe II e (2) sequenze in grado di aumentare il trasferimento dei peptidi antigenici all'interno del reticolo endoplasmatico e legarsi a molecole MHC di classe I.

In una prima fase saranno sperimentate:
- l'attività di vaccini nell'induzione di immunità cellulo-mediata e di protezione nel topo, nella cavia e nel marmoset . Cavia e marmoset saranno impiegati perché rappresentano uno spettro ampio di risposta all'infezione tubercolare essendo la cavia molto sensibile, ed il marmoset molto resistente;
- il potenziamento, mediante co-somministrazione di molecole attivanti i linfociti T gamma delta e le cellule NKT, dell'attività protettiva di vaccini peptidici e a DNA.

In una seconda fase sarà analizzata l'attività anti-infettiva in vivo delle stesse molecole, valutando la possibilità di interferire con l'infezione micobatterica. In particolare sarà valutato l'effetto di queste molecole sulla produzione di IFN-gamma, sulla disseminazione del micobatterio e sulla sopravvivenza degli animali trattati. Verrà anche studiato se l'attivazione delle cellule T gamma delta e NKT determina secrezione di IL-4 ed una conseguente risoluzione dei granulomi con il rilascio dei micobatteri sequestrati. Sarà importante valutare se questi bacilli vengono poi più facilmente distrutti dai macrofagi pre-attivati e dai farmaci antitubercolari utilizzati in terapia.
Infine, poichè le cellule del sistema immune necessitano di mantenere per tutta la vita la capacità proliferativa assicurata dalla telomerasi, un ulteriore parametro analizzato sarà l'effetto delle molecole inoculate in vivo sulla produzione di telomerasi, con particolare riferimento a linfociti T gamma delta e NKT.


I risultati attesi sono: l'identificazione e la caratterizzazione farmacologica e funzionale in modelli animali di almeno uno o due nuovi composti capaci di attivare l'immunità naturale (linfociti T gamma delta e cellule NKT) e di vaccini peptidici ed a DNA anti-tubercolare. I nuovi composti ed i vaccini saranno caratterizzati in modo tale da costituire dei composti di partenza per lo sviluppo di un vaccino terapeutico contro l'infezione da M. tuberculosis <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

VITTORIO COLIZZI, Universita' degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Finanziamento

Un vaccino contro la tubercolosi deve indurre una risposta immunitaria protettiva che stimoli sia cellule helper che citotossiche. Un terzo parametro importante è la generazione di una memoria immunologica a lungo termine. I recenti sviluppi delle conoscenze immunologiche e biotecnologiche permettono di proporre nuovi approcci per indurre e selezionare il tipo di risposta immunitaria antimicrobica.

In un modello di malattia quale la Tubercolosi appare possibile potenziare la risposta immunitaria cellulo-mediata tramite i) l'utilizzo di molecole innovative (analoghi di metaboliti fospforilati e di glicolipidi) in grado di attivare la risposta di linfociti T gamma delta ed alfa beta CD1-ristretti, e ii) l'uso degli antigeni proteici di MTB espressi nel corso dell'infezione naturale sotto forma di peptidi sintetici modificati (turbopeptidi) e vaccini a DNA. Tale approccio sperimentale, se funzionante per la protezione contro la tubercolosi, potrebbe essere applicato ad altre malattie conseguenti all'infezione da patogeni intracellulari. Questo progetto di ricerca si promette di studiare ambedue questi aspetti con i seguenti modelli sperimentali.

1) Sviluppo di molecole innovative in grado di potenziare l'immunità cellulo mediata.

La sottopopolazione T gamma delta che esprime il recettore V gamma 9-V delta 2 riconosce metaboliti fosforilati in assenza di processazione antigenica e presentazione da parte delle molecole MHC (De Libero et al., Immunol.Today 1997). Questi linfociti rilasciano grandi quantità di linfochine proinfiammatorie quando stimolate con questi ligandi e partecipano alle fasi iniziali della risposta antibatterica. Per questo motivo sono state definite cellule sentinella, che permettono il controllo dell'infezione nelle fasi iniziali prima che si sviluppino i linfociti dell'immunità acquisita.
Una seconda popolazione linfocitaria capace di rilasciare grandi quantità di linfochine proinfiammatorie è rappresentata dalle cellule NKT che riconoscono glicolipidi presentati dalla molecola CD1d. Anche queste cellule provvedono al controllo delle prime fasi dell'infezione quando opportunamente attivate in vivo. Per questo motivo sia le cellule gamma delta, che quelle NKT sono state definite cellule della risposta innata capaci di controllare lo sviluppo dell'immunità acquisita.
Scopo del progetto è di sviluppare molecole capaci di stimolare ambedue queste popolazioni e di studiare se la concomitante stimolazione di queste cellule dell'immunità naturale facilita la generazione di una risposta immunitaria più efficace e duratura dopo vaccinazione antitubercolare.
E' utile sottolineare che lo sviluppo di queste molecole innovative in grado di potenziare le risposte naturali potranno essere utilizzate in tutte quelle condizioni patologiche in cui ci sia un deficit di risposta immune ed in altre forme di vaccinazioni, incluse quelle tumorali.

2) Identificazione e sviluppo di nuovi antigeni micobatterici di virulenza e di sopravvivenza associati alla protezione.

M. tuberculosis è tra i patogeni del genere umano di maggior successo in termini di popolazione mondiale infettata e durata dell'infezione. La maggior parte degli individui infettati rimane sana sebbene ospiti microrganismi vitali all'interno delle cellule macrofagiche (MF). E' quindi molto importante capire cosa permette al bacillo di evadere il controllo dell'ospite per poter lavorare alla costruzione di un vaccino capace di indurre una risposta protettiva. Gli studi più recenti sulla virulenza dei microrganismi intracellulari si sono concentrati sul comportamento dei batteri nel corso della sopravvivenza e replicazione in vivo (2,3). Ad esempio, MTB regola la sua espressione genica secondo l'ambiente (terreno sintetico o macrofago umano) nel quale avviene la sua replicazione (Mariani et al. 2000, Gene). Tale risposta trascrizionale si è rivelata profondamente influenzabile dall'attivazione del MF umano con Interferone gamma (IFN-g) e Lipopolisaccaride (LPS). Ambedue questi trattamenti modulano l'espressione genica di MTB ma non la sua replicazione (Cappelli et al., 2001, Infect. Immun.). La disponibilità di microarrays contenenti l'intero genoma di MTB ha permesso l'individuazione di clusters di geni trascritti da MTB nel corso della sopravvivenza intracellulare (Mariani et al., in preparation). Questa nuova metodica molto promettente permetterà di rivelare quali proteine vengono sintetizzate dal microrganismo durante la sua rsidenza all'interno del MF e quindi di quali devono essere i target di un vaccino che vuole indure una risposta protettiva anche contro queste cellule.

3) Sviluppo di un vaccino terapeutico antitubercolare basato su peptidi sintetici da utilizzare in fase I/II.

Modelli di vaccini terapeutici pronti ad essere utilizzati nell'uomo si basano oggi sull'utilizzo di proteine ricombinanti o di coktail di peptidi sintetici. Per quanto riguarda la tubercolosi, l'approccio seguito in questo progtetto di ricerca è quello di modificare i peptidi immunodominati in modo da essere presentati più facilmente dalle cellule dendritiche e di attivare la reattività di tipo CD4 helper e quella CD8 citotossica. Quest'ultima è di enorme rilevanza per combattere il fenomeno della latenza intramacrofagica. L'identificazione di nuovi epitopi presenti in proteine associate alla virulenza ed alla sopravvivenza del batterio nella cellula ospite rappresenta un altro importante obiettivo di questo progetto.

4) Sviluppo di un vaccino sperimentale a DNA.

Il miglioramento di vaccini a DNA, ormai sviluppati e saggiati in modelli animali da diversi gruppi a livello mondiale, rappresenta una naturale applicazione di una tecnologia ormai matura. Il modello dell'infezione tubercolare offre un'applicazione possibile per tali vaccini a DNA, specialmente se si tratta di vaccini terapeutici effettuati in condizioni controllate. Il prototipo di vaccino proposto in questo progetto di ricerca ha un elevato livello di fattibilità per il lavoro pregresso svolto e per le ulteriori informazioni scientifiche che il progetto potrà fornire nell'arco del primo anno. L'istituzione presso l'Università di Roma "Tor Vergata" della Nuova Stazione a Tecnologia Animale rappresenta una ulteriore opportunità per l'analisi in vivo di tali vaccini in condizioni accettabili dalle industrie.<<<

Durata

36 mesi