RICERCA ITALIANA     

Identificazione delle vie di signaling implicate nella riparazione molecolare e nel recupero funzionale di cellule post-mitotiche (miocardiociti, miociti scheletrici e neuroni). Studio pre-clinico e clinico.

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Una deficienza funzionale a livello di organo è spesso dovuta a morte cellulare (necrosi o apoptosi). Il suo recupero e la sua riparazione sono possibili solo con il ripristino delle cellule mancanti. Questo tipo di riparazione avviene in tessuti, come il sangue e gli epiteli, capaci di reclutare, far proliferare e differenziare un sufficiente numero di cellule staminali e sostituire le cellule morte. Nel caso di un danno esteso, quando vengono superate le capacità riparative del sistema staminale, è stato possibile contribuire alla riparazione con cellule staminali esogene. Di qui il recente grande interesse sulla biologia e le applicazioni terapeutiche di cellule staminali amplificate e differenziate in vitro.
Vi sono tuttavia tessuti, come il miocardio, il muscolo scheletrico e il tessuto nervoso, caratterizzati da una struttura altamente vettoriale e organizzata, in cui questa strategia riparativa risulta inefficace, per cui le cellule mancanti vengono sostituite da tessuto fibroso (fibrosi) con irreversibile e progressiva perdita funzionale. Si pensa che due siano le ragioni principali di questa inefficienza: anzitutto la limitata capacità di reclutare nel luogo della lesione al momento opportuno le cellule del sistema staminale e, soprattutto, perché è poco verosimile che le cellule staminali, sia quelle esogene che, forse, quelle endogene, possano integrarsi anatomicamente e funzionalmente in questi tessuti già altamente e vettorialmente strutturati. Poiché la patologia globale di questi tessuti (scompenso cardiaco, miopatie degenerative, malattie neurodegenerative) costituisce la quota principale di morbilità e mortalità nelle popolazioni occidentali, appare necessario individuare strategie diverse per preservare la funzione di questi tessuti prima che le cellule muoiano o giungano ad una disorganizzazione irreversibile. Queste strategie sono di due tipi principali: quelle miranti a ridurre l'impatto dei vari tipi di danno sulla integrità molecolare e sulla funzione di queste cellule (miocardio-/muscolo scheletrico-/neuro-protezione) e quelle che stimolano la sostituzione di componenti molecolari danneggiati in cellule in degradazione subletale, ma ancora viventi (riparazione molecolare). La prima strategia implica la precisa conoscenza delle vie di danno sui componenti cellulari, la seconda necessita della conoscenza delle vie di signaling che permette la sostituzione delle molecole danneggiate.
Questo programma di ricerca ha due principali obiettivi: 1.-lo studio preclinico di modelli di danno subletale in linee cellulari e animali normali e transgenici (avvantaggiati o svantaggiati) e le pathways di signaling per la loro riparazione. 2.-lo studio clinico di patologie umane croniche (scompenso cardiaco e cardiomiopatie croniche, miopatie degenerative e malattie neuro-degenerative), delle vie di danno (analoghe a quelle viste nello studio preclinico) e del signaling per la riparazione molecolare con recupero di funzione delle cellule danneggiate (analogie con lo studio preclinico).
Per questo collaboreranno nove Unità di ricerca con specifiche competenze: tre per il miocardio, tre per il muscolo scheletrico e tre per il tessuto nervoso. Le stesse hanno competenze trasversali nei rispettivi campi di Biologia molecolare e cellulare, Fisiopatologia cellulare e clinica (Cardiologia, Patologia muscolare e Neurologia).
I risultati attesi comprendono l'identificazione di marcatori molecolari e cellulari del danno subletale in tessuti post-mitotici, l'identificazione di vie di signaling e di marcatori molecolari e cellulari della riparazione negli stessi tessuti, l'identificazione e il suggerimento di vie terapeutiche dello scompenso cardiaco, delle miopatie degenerative e delle malattie neurodegenerative alternative al trapianto di organi (cuore) e di cellule staminali (miocardiociti, miociti scheletrici e neuroni) e, infine, la dimostrazione dell'efficacia clinica e terapeutica di questa strategia in gruppi di pazienti opportunamente selezionati nell'ambito di queste patologie. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

MATTEO ANTONIO RUSSO, Universita' degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Finanziamento

L'ipotesi di lavoro che i danni subletali, responsabili di una perdita di funzione nel miocardio, nel muscolo scheletrico e nel tessuto nervoso, possano essere riparati mediante il ripristino dell'integrità molecolare sotto opportuni segnali che attivino i geni delle molecole danneggiate, obbliga a raggiungere una serie di obiettivi sia per dimostrare che l'ipotesi è giusta, sia per le immediate applicazioni cliniche che essa suggerisce. Alcuni di questi obiettivi sono preliminari, altri possono essere perseguiti in parallelo, partendo dal presupposto, suggerito da molti risultati preliminari, che l'ipotesi sia giusta. Gli obiettivi vengono elencati in relazione alla priorità, definendone la natura preclinica o clinica, descrivendolo per sommi capi e, infine, indicando le UR che principalmente lo perseguiranno e con quali strategie e/o metodologie.

1.-Primo obiettivo: DEFINIRE L'EQUAZIONE DANNO/RIPARAZIONE NEI TESSUTI STABILI.

Equazione Danno/Riparazione e vie di riparazione

- NATURA DELL'OBIETTIVO: essenzialmente conoscitivo (preclinico).
- DESCRIZIONE: Nonostante in letteratura si parli della capacità omeostatica di mantenere la struttura/funzione di una cellula post-mitotica, non vi sono criteri certi in grado di aiutare a definire l'equazione danno/riparazione per la conservazione dei miocardiociti, delle cellule muscolari scheletriche e dei neuroni. Pertanto, uno dei risultati più attesi, anche dalla letteratura, in questo progetto è l'indicazione dei limiti di queste capacità omeostatiche anzitutto in condizioni normali, o in condizioni svantaggiate (es. mutazione con perdita di funzione di una proteine sarcomerica) o anche in condizioni avvantaggiate (es. guadagno di funzione di IGF-1 da polimorfismi recettoriali o altri segnali downstream). Questo permetterà di valutare individualmente nei pazienti o nelle specifiche condizioni sperimentali il prodotto dell'equazione.
- CHI e COME: si prevede di raggiungere questo obiettivo dai risultati che si otterranno da una serie di esperimenti preliminari previsti dai protocolli delle UR di base (Cattaneo, Condorelli, Gulino, Molinaro, Nicoletti, Russo).

2.-Secondo obiettivo: VALUTAZIONE DEL DANNO SUBLETALE.

- NATURA DELL'OBIETTIVO: conoscitivo (preclinico) e applicativo (clinico).
- DESCRIZIONE: Il primo fattore dell'equazione impone di definire i criteri di valutazione del danno subletale non necrotico cellulare e molecolare nel miocardio, nel muscolo scheletrico e nel tessuto nervoso. Pertanto, ci si attende di individuare una lista di parametri molecolari, cellulari e clinico-funzionali per definire il danno (scompenso miocardico, miopatia scheletrica degenerativa, malattia neurodegenerative) attuale o nella sua progressione. Da risultati preliminari, per esempio, è possibile evidenziare l'attivazione di caspasi (caspasi-3 e caspasi-9) con evidente (TEM) degradazione di vari componenti citoscheletrici, senza che siano presenti alcuni cruciali indicatori di apoptosi (TUNEL e annessina/fosfatidilserina). Per questo ci si attende di chiarire il ruolo della degenerazione che solo lentamente esita (o non esita) nell'apoptosi (apoptosi lenta o abortiva). La necrosi segmentaria di frequente riscontro nella patologia delle fibre del muscolo scheletrico, da risultati preliminari di alcune UR (Russo e Molinaro), rappresenta una conferma dell'esistenza e dell'impatto di questo tipico danno subletale. Ci si attende di correlare strettamente questo danno con la perdita globale di funzione e di struttura che la clinica e la fisiopatologia possono evidenziare nello studio dei pazienti arruolati o negli animali da esperimento. Per esempio, poter correlare il grado di miofibrillolisi al grado di scompenso (contrattilità delle pareti, attività elettrica, frazione di eiezione), poter correlare il grado di degenerazione dei miociti scheletrici al danno molecolare di partenza, ma anche all'attività motoria prevalente e alla velocità di progressione della malattia. Negli animali (normali e transgenici) correlare le alterazioni neurologiche a quelle cellulari e molecolari
- CHI e COME: si prevede di raggiungere questo obiettivo mediante la preparazione di schede per la raccolta delle informazioni e la descrizione del danno nei pazienti, nei tessuti e cellule e con eventuali marcatori molecolari. La preparazione delle schede specifiche (pazienti, animali, cellule) e la raccolta delle informazioni sarà un compito coordinato tra tutte le UR.


Figura 2: miofibrillolisi nella cardiomiopatia dilatativa da deficienza dell'asse GH/IGF-1 e suo recupero dopo trattamento con recombinant hGH. (Frustaci e Russo: Am J Clin Pathol, 97:503-511, 1992, New Engl J Med, 335:672-673, 1996)

3.-Terzo obiettivo: IDENTIFICARE IL SIGNALING DELLA RIPARAZIONE MOLECOLARE.


- NATURA DEL'OBIETTIVO: conoscitivo (preclinico) e clinico
- DESCRIZIONE: Identificare i segnali che attraverso una coordinata espressione genica permettono la riparazione dei componenti cellulari e un recupero di funzione di tessuto e di organo. Dalla letteratura e da risultati preliminari appare possibile recuperare per esempio le aree di miofibrillolisi e la funzione del miocardio (Figura 2). Per questo cruciale obiettivo dovranno essere chiariti i messaggi esogeni (endocrini, paracrini, autocrini) e le vie seguite (recettori, proteine di trasduzione, chinasi e fattori di trascrizione). Molteplici vie di traduzione appaiono implicate e per questo inizialmente dovranno essere valutate le più verosimili (la via dei recettori a 7 domini TM, la via dei recettori di ormoni steroidei e tiroidei, dei recettori citochinici da gP130, ecc.)
- CHI e COME: Le UR di Condorelli, Gulino, Molinaro, Cattaneo, Russo e Nicoletti hanno tutti una esperienza che in parte si sovrappone e in parte e complementare. Il traffico delle proteine segnale potrà essere visto con varie tecniche complementari (microscopio confocale, immunogoldlabeling, colocalizzazione).

4.-Quarto obiettivo: RUOLO DEL MICROAMBIENTE.

- NATURA DELL'OBIETTIVO: conoscitivo, preclinico.
- DESCRIZIONE: studiare il ruolo del microambiente tessuto-specifico nel signaling riparativo. In particolare i segnali di natura paracrina, autocrina ed endocrina presenti nel tessuto nella sede del danno e attorno alle cellule in via di riparazione. Inoltre, l'eventuale ruolo di segnali provenienti dalle interazioni delle cellule danneggiate con la matrice extracellulare.
- CHI e COME: alla base di questo studio vi sarà una metodologia recentemente introdotta nel laboratorio di una delle UR (Russo), la laser capture microdissection, che permette di separare il microambiente della lesione e della riparazione dal tessuto circostante, e su queste frazioni evidenziare la diversa composizione in mRNA e proteine.

5.-Quinto obiettivo: DEFINIRE DEI DNA MICROARRAYS DEL DANNO E DELLA RIPARAZIONE.

- NATURA DELL'OBIETTIVO: applicativo, preclinico e clinico
- DESCRIZIONE: Definire i diversi gruppi di geni interessati al danno e alla riparazione e costruire un DNA microarray specifico (uno umano e uno murino) per valutare a livello molecolare, sia il danno e quindi gli effetti riparativi delle diverse vie di signaling. Questo obiettivo avrà la priorità per alcune UR per l'evidente vantaggio nelle successive fasi della ricerca: l'accelerazione e la standardizzazione di alcuni aspetti cruciali e quantitativamente importanti della ricerca.
- CHI e COME: tutte le UR interessate parteciperanno alla costituzione dell'iniziale data-base. Successivamente l'UR di Gulino, in collaborazione con quelle di Molinaro, Condorelli, Cattaneo, Nicoletti e Russo, avrà la coordinazione per la valutazione e l'uso dei microarrays costruiti

6.-Sesto obiettivo: APPLICAZIONI TERAPEUTICHE.

- NATURA DELL'OBIETTIVO: applicativo, preclinico e clinico. Comprende due sottobiettivi:

6a-STRATEGIE PER IL RALLENTAMENTO DEL DANNO MOLECOLARE E FUNZIONALE.
- DESCRIZIONE: Strategie terapeutiche per il rallentamento del danno in pazienti selezionati con alcuni tipi di scompenso cardiaco e miocardiopatie autoimmuni (Frustaci), con miopatie degenerative ad andamento lento (Tonali), con malattie neurodegenerative genetiche [accumulo di sequenze poliglutaminiche, malattia di Huntigton (Cattaneo), Sclerosi Laterale Amiotrofica (Fieschi e Tonali)] o da danno post-ischemico (Fieschi).
- CHI e COME: Saranno interessate prevalentememnte le UR cliniche (Frustaci, Tonali, Fieschi) coadiuvate per gli studi di base dalle altre UR e da Nicoletti per i suggerimenti farmacologici.

6b-STRATEGIE PER L'UTILIZZAZIONE CLINICA DI MOLECOLE EFFICACI COME SEGNALI DI RIPARAZIONE.
- DESCRIZIONE: Studiare condizioni cliniche nelle quali è lecito l'uso di molecole che dalla letteratura o dai risultati preliminari e preclinici di altre UR si sono dimostrate efficaci nel recupero molecolare. Per es. in pazienti con patologia da scompenso e/o neurodegenerative e/o miodegenerative che presentano contemporanee deficienze ormonali si valuterà l'effetto di ormoni (GH/IGF-1, ormoni steroidei vari, ormoni tiroidei). Uno studio analogo potrà essere intrapreso per l'uso di molecole steroidee (ormoni corticosterodi, androgeni, estrogeni).
- CHI e COME: Le UR cliniche saranno tutte interessate e coinvolte per questo obiettivo con la collaborazione delle altre UR per gli aspetti di base.<<<

Durata

36 mesi