RICERCA ITALIANA     

Analisi comparata in vitro ed in vivo di vaccini ricombinanti innovativi basati su sistemi procariotici di display, proteine di fusione e peptidi bioattivi.

Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)

Abstract

Il rischio di diffusione su larga scala delle malattie infettive causate da nuovi patogeni o da patogeni che hanno sviluppato resistenza ai trattamenti convenzionali è alla base di un crescente interesse verso i vaccini. Idealmente, un vaccino dovrebbe attivare tutte le componenti del sistema immunitario, dovrebbe cioè stimolare i linfociti B a produrre anticorpi, attivare la risposta dei linfociti T citotossici (CTL) e dei linfociti T helper (Th, essenziali sia per la risposta dei linfociti B, sia per quella dei CTL). I vaccini con peptidi sintetici hanno la potenzialità di indurre risposte immunitarie altamente specifiche e attivare sia il braccio umorale sia quello cellulare della risposta immunitaria. Tuttavia, pur in presenza di sporadici successi, le aspettative riguardo questo nuovo approccio sono state finora deluse. In effetti, sono ancora in larga parte sconosciuti i meccanismi che regolano la risposta immunitaria agli epitopi presenti in un vaccino con peptidi sintetici, come il caricamento dei peptidi sulle cellule presentanti l'antigene (APC), la stabilizzazione dei peptidi, il loro veicolamento, l'influenza della via di immunizzazione e la possibilità di antagonismo fra peptidi.

Lo scopo generale del nostro progetto è quello di riempire questo vuoto di conoscenze, definendo i parametri chiave per la selezione, l'ottimizzazione e il veicolamento degli epitopi peptidici capaci di indurre risposte immunitarie specifiche, durature e di natura appropriata per la protezione contro le malattie infettive. Il progetto sarà incentrato su antigeni proteici e epitopi peptidici presenti in patogeni di importanza cruciale nel mondo, per la salute pubblica e per motivi socio-economici, verso i quali non si dispone attualmente di alcun vaccino, ovvero il citomegalovirus umano (HCMV) ed il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1).

Nel nostro progetto, i determinanti immunogenici saranno espressi da veicoli innovativi, derivati da organismi procariotici non patogeni, e la loro efficacia nell'indurre le diversi componenti della risposta immunitaria, nello scatenare risposte polarizzate e nell'attivare l'immunità mucosale sarà sistematicamente paragonata a quella dei corrispondenti peptidi sintetici o analoghi di peptidi, facendo uso di animali transgenici come modello.

Oltre all'impiego dei diversi vettori per l'immunizzazione in vivo di topi transgenici modello e l'immunizzazione in vitro di PBL umani, sarà condotto uno studio sistematico sugli antigeni dei virus HIV-1 e CMV che inducono risposte immunitarie nei pazienti. Le informazioni raccolte consentiranno di progettare combinazioni multivalenti di vaccini che possono essere efficaci in un'ampia parte della popolazione di pazienti e fare fronte alla variabilità genetica di patogeni come l'HIV-1. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

GIOVANNA DEL POZZO, Consiglio nazionale delle ricerche (CNR)

Obiettivo del Finanziamento

La conoscenza sia della genetica che della biologia molecolare di organismi patogeni emergenti o ri-emergenti ha condotto all'identificazione di sequenze aminoacidiche che possono avere un ruolo importante nella progettazione di un vaccino. Fra l'altro, si è visto che i vaccini a subunità che esprimono specifiche sequenze antigeniche appartenenti a proteine del patogeno sono efficaci nell'indurre un'immunità specifica e protettiva e non presentano effetti avversi. In questo contesto, è stata studiata l'immunogenicità di peptidi sintetici che rappresentano epitopi B e T che talvolta, a causa della loro rapida degradazione e della loro tossicità, risultano essere poco efficaci in vivo. Inoltre, esiste un'ulteriore limitazione al loro uso dovuta sia all'elemento di restrizione MHC che li presenta, che alla variabilità genetica del patogeno, limitazione che può essere superata attraverso l'identificazione di determinanti antigenici che siano promiscui nella presentazione e poco variabili nella sequenza.
Al fine di aggirare alcuni dei problemi riscontrati, sono stati proposti sistemi di veicolazione capaci di rendere i vaccini a subunità più efficaci nel loro effetto protettivo stimolando sia la risposta umorale che quella cellulare. L'esistenza di diverse vie di processazione e quindi di presentazione da parte delle molecole MHC fa sì che mentre risposte immunitarie di tipo umorale e T helper possono essere stimolate da proteine o estratti proteici, risposte immunitarie di tipo cellulare citotossiche non possono essere indotte da preparazioni di questo tipo.
I vaccini attualmente in uso che si propongono di indurre risposte CTL sono costituiti da patogeni attenuati o inattivati o altrimenti resi incapaci di patogenicità. Tali vaccini presentano tuttavia rischi di infezione o di effetti collaterali, in special modo quando il sistema immunitario del paziente è gia' compromesso, come nel caso di immunodeficienze causate da HIV o di immunosoppressione post-trapianto in pazienti infettati da citomegalovirus.
Questo progetto di ricerca si propone lo studio di vaccini innovativi basati su carriers non patogeni, il paragone delle diverse vie di immunizzazione e la messa a punto di efficienti strumenti di monitoraggio della risposta immunitaria. E' necessario infatti una valutazione comparativa, in condizioni ben controllate, della risposta immunitaria ottenuta nei confronti di alcuni epitopi noti utilizzando le differenti strategie disponibili. Questo progetto, in particolare, mira alla formulazione e alla sintesi di differenti vaccini sintetici, utili sia dal punto di vista dell'applicazione generale che nei confronti di specifiche patologie quali l'AIDS e l'infezione da citomegalovirus. La scelta di studiare i virus HIV-1 e CMV è dettata dalla loro rilevanza clinica e dalle competenze specifiche dei partecipanti a questo progetto. Lo scopo principale riguarda la caratterizzazione di immunogeni basati su vettori procariotici non patogenici (batteriofagi, batteri, spore batteriche) o su proteine ricombinanti da confrontare con peptidi bioattivi o analoghi di peptidi. Il progetto si propone l'ottimizzazione delle vie di somministrazione e lo sviluppo di strumenti di monitoraggio della risposta immunitaria indotta dai vaccini.
Al fine di conseguire tali risultati le diverse unità di ricerca si concentreranno sugli obiettivi specifici descritti qui di seguito.
1 Identificazione e caratterizzazione di epitopi B: Parte del progetto sarà dedicato all'uso di librerie di batteriofagi per l'identificazione di mimotopi riconosciuti dagli anticorpi circolanti nel siero di pazienti a vari stadi della malattia. Tali analisi ci condurrà alla formulazione di vaccini sintetici basati su miscele di mimotopi. Peptidi sintetici derivati dalle sequenze dei mimotopi identificati verranno caratterizzati immunologicamente al fine di progettare degli analoghi aventi la struttura di dendrimeri.
2 Identificazione e caratterizzazione di epitopi T: Verrà determinata la specificità delle cellule T attivate nei pazienti durante il decorso della malattia. Cloni di cellule T e ibridomi verranno selezionati e ne verrà studiata la specificità e restrizione MHC. Le risposte da parte delle cellule T verranno analizzate con i test classici di proliferazione delle cellule T helper, mediante l'uso di coloranti vitali o ELISPOT. Peptidi sintetici e analoghi di peptidi come i dendrimeri potranno essere usati per caratterizzare le specificità delle cellule T selezionate.
3 Costruzione e caratterizzazione di "carriers" esprimenti epitopi dei virus HIV e CMV: sono già stati costruiti batteriofagi "double display", capaci di esprimere differenti combinazioni di epitopi B e T. E' stata dimostrata la capacità di tali particelle virali di indurre differenti tipi di risposta immunitaria, in particolare risposte T citolitiche in vitro ed in vivo. Analogamente, è stato messo a punto, da uno dei gruppi partecipanti, un sistema alternativo di espressione di proteine antigeniche dei virus HIV o CMV basato sul batterio gram positivo Streptococcus gordoni. Tale carrier è in grado di esprimere contemporaneamente un antigene ed un fattore immunomodulatorio capace di amplificare e polarizzare la risposta antigenica. Parallelamente, il batterio Bacillus subtilis è stato ingegnerizato da una delle unità partecipanti in modo che l'espressione dei determinanti antigenici possa essere ottenuta sulle spore batteriche. La resistenza di tali spore ad una serie di condizioni ambientali conferisce grande stabilità a tale immunogeno. E' noto che particelle batteriofagiche e spore di bacillo sono già utilizzati per scopi clinici e l'assenza di effetti collaterali e' stata dimostrata. Spore di B. subtilis sono anche adoperate come additivi nei cibi, mentre S. gordoni è un ospite commensale del tratto digerente umano. Le proprietà antigeniche degli immunogeni prima descritti saranno confrontate con le proprietà antigeniche di proteine di fusione esprimenti gli stessi peptidi e con quelle dei corrispondenti peptidi sintetici o dendrimeri. Un'altra strategia è basata sulla capacità della proteina TAT del virus HIV di attraversare le membrane cellulari e di entrare nei compartimenti in cui avveine la processazione dell'antigene. La sequenza TAT che conferisce tale proprietà può essere fusa a peptidi antigenici o a proteine che possono essere conseguentemente internalizzate dalle Antigen Presenting Cells. Tuttavia l'immunogenicità di tali costrutti richiede ulteriori approfondimenti. Sono state anche studiate le caratteristiche strutturali della componente E2 del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi di Bacillus stearothermophilus. Il complesso E2 è strutturato in trimeri che si aggregano a formare una struttura dodecaedrica costituita da 24 monomeri a simmetria ottaedrica con un core cubico o, in B. stearothermophilus, da 60 monomeri con un core pentagonale dodecaedrico a simmetria icosaedrica di 1.5 Mda. Il complesso E2 ingegnerizzato (E2DISP) può presentare fino a 60 copie di polipeptidi esogeni sulla superficie della struttura proteica E2. Il complesso E2DISP 60-mer ricombinante prodotto in batteri può essere rinaturato in vitro; un'efficiente ripristino della struttura terziaria è indipendente dal dominio polipeptidico fuso all'estremità N-terminale. Sono già stati effettuati alcuni studi sull'antigenicità di questo complesso proteico. Infatti i nostri dati mostrano che, analogamente ai batteriofagi "double display", E2DISP induce una forte risposta helper e CTL sia in vivo che in vitro in seguito alla processazione nei rispettivi compartimenti. In ognuno dei costrutti sopra menzionati verranno espressi antigeni conosciuti (intere proteine o sequenze peptidiche in esse contenute)del virus HIV-1, quali gag, env o la RT e del virus CMV, quale la proteina p65. Inoltre, nuovi epitopi identificati da altre unità (vedi obiettivi 1 e 2) saranno espressi in questi costrutti.
4 Monitoraggio delle immunizzazioni in vivo ed in vitro mediante l'utilizzazione di carriers ricombinanti esprimenti i determinanti di HIV e CMV: Risposte immunitarie di tipo B nei confronti dei mimotopi o dei peptidi sintetici derivati dai mimotopi o degli analoghi verranno misurate in topo e, in collaborazione con un gruppo esterno, in modelli animali di primati. I mimotopi verranno usati per monitorare le risposte anticorpali nei pazienti a vari stadi della malattia. Le risposte cellulari T verranno studiate in vitro, in seguito alla stimolazione delle PBL dai pazienti o mediante l'uso di cloni di cellule T o ibridomi (vedi obiettivo 2). Le risposte T cellulari verranno studiate in vivo in seguito all'immunizzazione di topi transgenici aventi un elemento di restrizione MHC umano, quale HLA-A2. In particolare verrà studiata la risposta dei topi transgenici nei confronti dello stesso determinante antigenico, veicolato da differenti carriers (vedi obiettivo 3). Studi in collaborazione con gruppi esterni relativi all'uso di batteriofagi come veicolo per determinanti antigenici B, T helper e CTL derivati da HIV-1 verranno effettuati nei macachi. Al fine di valutare l'ottimizzazione dei protocolli di immunizzazione dei topi verranno misurate l'intensità, la specificità e la polarizzazione della risposta immune evocata. A tale scopo verranno effettuate analisi mediante ELISPOT, citofluorimetria, studi di binding ai tetrameri da parte di popolazioni cellulari del sangue periferico o dei linfonodi o della milza degli animali immunizzati. Inoltre è nostra intenzione mettere a punto metodi rapidi di valutazione della risposta quale la DTH. Si tratta di un test rapido e semiquantitativo della risposta ottenuta nei topi immunizzati con carrier esprimenti determinati epitopi e ristimolati con gli stessi epitopi, ma veicolati da un vettore diverso, non cross-reattivo con il precedente.
5 Confronto tra le diverse vie di immunizzazione: Differenti carriers derivati da organismi procariotici (batteriofagi, S. Gordoni, B. subtilis) dalla fusione con la proteina TAT o espressi in strutture macromolecolari (E2 display system)possono mostrare diverse capacità nell'entrare in contatto con i vari compartimenti della risposta immune. Siamo già in possesso di alcune osservazioni preliminari riguardanti l'uso di particelle batteriofagiche nell'immunizzazione nasale o orale; anche i costrutti di S. Gordoni hanno dimostrato di essere in grado di indurre una risposta umorale in seguito all'immunizzazione attraverso la mucosa vaginale e le spore di Bacillus subtilis possono avere buone prospettive nell'immunizzazione attraverso l'epitelio. Il progetto prevede dunque di analizzare e confrontare le proprietà immunologiche di vaccini basati su differenti carriers veicolanti gli stessi antigeni somministrati attraverso diverse vie di immunizzazione.
Per il raggiungimento degli obiettivi sopra menzionati, il progetto sarà organizzato secondo lo schema di tre diversi workpackage, incentrati sullo studio dei tre tipi di risposte immunitarie:anticorpi e linfociti B, linfociti Th, linfociti T citotossici.<<<

Durata

36 mesi