RICERCA ITALIANA     

NUOVI APPROCCI PER LO STUDIO DELLO SVILUPPO E MATURAZIONE DELLA SINAPSI NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE

Centro Farmacologia Cellulare e Molecolare

Abstract

La formazione della sinapsi rappresenta l'evento culminante dello sviluppo del sistema nervoso, il cui aspetto piu' rilevante consiste nell'elaborazione di innumerevoli connessioni che mettono in comunicazione i neuroni in modo altamente specifico. Pur rappresentando tipicamente la conclusione di eventi precoci, quali la migrazione neuronale e l'estensione di neuriti, la sinaptogenesi si manifesta come un fenomeno distinto, caratterizzato 1) dall'attivazione di una cascata di segnalazione, che assicura la formazione del contatto tra partners appropriati, 2) dalla opportuna localizzazione spaziale di componenti pre e postsinaptici e 3) dalla ulteriore maturazione della sinapsi a generare un contatto funzionalmente affidabile. Scopo del presente progetto e' quello di mettere a punto una serie di tecnologie innovative che, con un approccio multidisciplinare, permettano l'analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nei fenomeni di sviluppo e plasticita' sinaptica nel cervello. A partire dallo studio biochimico di componenti molecolari sinaptiche, attraverso una dettagliata analisi morfologica e funzionale della singola sinapsi, si arrivera' all'esame funzionale di modelli cellulari estremamente semplificati (singolo neurone che forma contatti autaptici in presenza o in assenza di astrociti), fino allo studio dei classici modelli di reti neuronali/gliali in coltura e in fettina. Le informazioni ottenute saranno infine convalidate su sistemi in vivo (retine in vivo ed espianti). Saranno analizzati in parallelo la maturazione del compartimento presinaptico e il differenziamento di quello postsinaptico, con particolare attenzione a eventuali meccanismi di regolazione reciproca (U.R. Matteoli). Saranno utilizzate tossine clostridiali per dissezionare chirurgicamente singoli componenti dell'apparato di fusione delle vescicole sinaptiche allo scopo di stabilirne la funzionalita' a vari stadi di sviluppo neuronale (U.R. Montecucco). Le interazioni tra varie proteine delle vescicole sinaptiche e loro eventuali modifiche post-traduzionali (in particolare: fosforilazione) saranno analizzate durante la maturazione sinaptica allo scopo di stabilirne il ruolo funzionale (U.R. Benfenati e U.R. Valtorta). I meccanismi che, attraverso l'inserzione e la stabilizzazione nella membrana plasmatica di canali ionici (U.R. Fumagalli) e recettori per neurotrasmettitori (U.R. Gotti), regolano l'eccitabilita' e la responsivita' neuronale saranno analizzati durante la formazione del contatto sinaptico. Un approccio proteomico sara' inoltre utilizzato per identificare tutte le componenti molecolari che sono alla base del fenotipo neuronale durante la sinaptogenesi e dopo l'induzione di fenomeni di plasticita' a lungo termine (U.R. Malgaroli). Utilizzando modelli in vivo (retina) si cerchera' di definire il legame tra la maturazione delle proprieta' di eso/endocitosi e la attivazione della circuiteria visiva e le proprieta' "temporali' della scarica spontanea (U.R. Galli-Resta). Infine si definira' in che misura l'interazione tra cellule gliali e neuroni e' coinvolta nella corretta formazione e maturazione del contatto sinaptico (U.R. Carmignoto). Ogni aspetto del progetto sara' affrontato dalle diverse unita' di ricerca attraverso approcci multidisciplinari innovativi e strettamente interattivi. Riteniamo che i risultati di tali studi permetteranno di ottenere un quadro molecolare dei processi di sinaptogenesi e plasticita' sinaptica, dalla molecola al sistema integrato, fornendo allo stesso tempo un know-how tecnologico per lo studio funzionale della sinapsi.



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Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

MICHELA MATTEOLI, Centro Farmacologia Cellulare e Molecolare

Obiettivo del Finanziamento

Scopo del presente progetto e' quello di mettere a punto una serie di saggi innovativi che consentano lo studio dell' attivita' sinaptica. Tali saggi saranno applicati allo studio della funzionalita' sinaptica durante lo sviluppo e nel corso di fenomeni di plasticita' a lungo termine. A tale scopo si prevede l'utilizzazione di uno spettro di modelli sperimentali di varia complessita'- dalle vescicole sinaptiche purificate, alla rete neuronale in coltura, alle fettine di cervello fino alla retina in vivo-.

OBIETTIVI Ci proponiamo di raggiungere i seguenti obiettivi:
1) Definizione dei segnali e dei meccanismi che mediano la maturazione funzionale della sinapsi. Attraverso un approccio multidisciplinare (espressione esogena di proteine coniugate a GFP; utilizzo di sonde fluorescenti per la valutazione del recycling vescicolare; patch-clamp e perfusione intracellulare di peptidi e anticorpi in singoli neuroni ippocampali che formano autapsi; analisi di interazione proteina-proteina mediante co-immunoprecipitazione da colture primarie; registrazioni combinate di imaging per il calcio ed elettrofisiologia) saranno identificati i segnali e i meccanismi che regolano la maturazione delle proprieta' funzionali della presinapsi. Particolare enfasi sara' posta sulla definizione del ruolo del bersaglio postsinaptico nel dirigere la maturazione funzionale del terminale presinaptico. In particolare, si valutera' la possibilita' che segnali retrogradi regolino e modulino vari aspetti delle dinamiche del terminale presinaptico, quali l'interazione tra coppie di proteine delle vescicole sinaptiche (sinaptofisina-sinaptobrevina) e della membrana plasmatica (sinaptobrevina-sintaxina) e/o i processi di fosforilazione proteica nel terminale (vedi anche obiettivi 2 e 3).
2) Definizione delle interazioni proteina-proteina coinvolte nel traffico delle vescicole sinaptiche durante lo sviluppo e la plasticita' sinaptica. Utilizzando un metodo basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza tra proteine, accoppiato alla microscopia ad alta risoluzione, saranno analizzate in maniera dinamica e quantitativa le interazioni tra coppie di proteine delle vescicole sinaptiche o della membrana presinaptica durante lo sviluppo e l'attivita' neuronale. Lo studio delle interazioni proteina-proteina coinvolte nell'esocitosi sara' analizzata anche mediante tecniche di cross-linking, cromatografia di affinita' e co-immunoprecipitazione.
3) Definizione del ruolo dei sistemi di trasduzione del segnale nella trasmissione sinaptica durante lo sviluppo e la plasticita' sinaptica. Sara' analizzato il ruolo di sistemi presinaptici di trasduzione del segnale, ed in particolare dei processi di fosforilazione in serina/treonina e tirosina nella trasmissione e plasticita' sinaptica, tramite l'uso di anticorpi fosfospecifici accoppiato all'analisi del segnale nella singola sinapsi. Si analizzeranno inoltre i meccanismi di regolazione e il ruolo funzionale delle fosforilazioni mediate dalla protein chinasi associate alle vescicole sinaptiche Ca2+/calmodulina dipendente di tipo II (CaMKII) e dalle tirosina chinasi della famiglia Src che si ritiene svolgano un ruolo chiave nella plasticita' sinaptica.
4) Definizione del meccanismo d'azione di neurotossine presinaptiche e loro utilizzo per lo studio del reciclo delle vescicole sinaptiche. Si studiera' il meccanismo di ingresso e d' azione delle neurotossine presinaptiche di serpente PLA2 utilizzando tecniche di biologia molecolare, di biochimica e di neurofisiologia. Saranno prodotte tossine chimeriche marcate con perossidasi o biotina per studiarne le vie di penetrazione nel neurone, e saranno messi a punto nuovi paradigmi per l'utilizzazione di tali tossine per lo studio del riciclo delle vescicole sinaptiche.
5) Definizione dei meccanismi cellulari e molecolari che regolano la localizzazione subcellulare, l'inserzione e il recycling di canali ionici nel corso della sinaptogenesi e nei fenomeni di plasticitˆ sinaptica. Attraverso metodi morfologici avanzati (imaging ad alta risoluzione su cellule viventi mediante deconvoluzione, imaging del calcio, microscopia elettronica) accoppiati con nuove procedure biochimiche per lo studio del turnover di proteine di membrana, si analizzeranno i meccanismi che regolano il turnover e la localizzazione di canali SK in corso di sinaptogenesi e di LTP. Eventuali interattori del canale SK saranno identificati mediante la tecnica del two-hybrid screening. Sara' inoltre definito in che misura l'inserzione e la stabilizzazione di canali ionici nella membrana plasmatica modula l'attivita' eso-endocitotica delle vescicole sinaptiche al terminale.
6) Definizione della localizzazione e del ruolo di diversi sottotipi di recettori nicotinici durante lo sviluppo Saranno utilizzati metodi immunocitochimici, di ibridizzazione in situ ed autoradiografia recettoriale per studiare l'espressioni dei recettori nicotinici , durante lo sviluppo neuronale in aree particolari del sistema nervoso centrale quali la retina, lo striato e il mesencefalo di ratto. Anticorpi subunita' specifici verranno utilizzati per identificare i sottotipi maggiormente regolati durante lo svilupppo neuronale e questi sottotipi verranno caratterizzati da un punto di vista biochimico, farmacologico, immunologico ed elettrofisiologico. Si studiera' inoltre l'effetto che l'esposizione alla nicotina durante lo sviluppo neuronale ha sull'espressione di questi recettori . In parallelo su culture in vitro di neuroblastoma umano e di neuroni corticali di ratto studieremo i meccanismi cellulari attraverso i quali la nicotina regola l'espressione e la funzionalita' dei recettori nicotinici .
7) Definizione del profilo proteico neuronale durante la sinaptogenesi e la plasticita' sinaptica. Si prevede di separare proteine neuronali e sinaptiche da colture ippocampali su larga scala, in condizioni di controllo, di LTP e di sinaptogenesi alterata. Si eseguira' quindi una analisi della sintesi proteica de-novo e/o delle modificazioni post-traduzionali in seguito a tali trattamenti sperimentali, allo scopo di identificare tutte le componenti molecolari che sono alla base del fenotipo neuronale durante la sinaptogenesi e dopo l'induzione di fenomeni di plasticita' a lungo termine.
8) Definizione del ruolo delle cellule gliali nello sviluppo e maturazione funzionale della sinapsi. Saranno utilizzate tecniche avanzate (microscopia confocale a livello di singola cellula per l'analisi dei cambiamenti del calcio intracellulare, registrazioni elettrofisiologiche dell'attivita' sinaptica da singoli neuroni, registrazioni contemporanee da un astrocita e un neurone) per valutare l'ipotesi che la trasmissione neuroni-glia sia cruciale nel controllo del rilascio di glutammato dagli astrociti attivati. In particolare si cerchera' di identificare la presenza, in astrociti in vitro ed ex vivo, delle vescicole contenenti glutamato e di definire i meccanismi di regolazione del loro rilascio. Sara' quindi valutato se tale rilascio svolge un ruolo determinante nel regolare la distribuzione e la maturazione funzionale delle sinapsi.
9) Caratterizzazione dello sviluppo e della maturazione delle sinapsi in vivo. Lo sviluppo e la maturazione delle sinapsi saranno seguiti su retine in vivo, utilizzando imaging confocale e time -lapse, neuroanatomia e trasfezioni cellulari con la tecnica del gene-gun in retine espiantate. In tale modello, si analizzera' lo sviluppo funzionale e i meccanismi di controllo del processo di esocitosi, si effettuera' un'analisi biochimica della maturazione sinaptica ed, infine, si definiranno gli effetti sull'attivita'spontanea retinica conseguenti a manipolazioni sperimentali del rilascio di neurotrasmettitore.


RISULTATI ATTESI
Prevediamo che i risultati di tali studi forniscano un know-how tecnologico per lo studio funzionale della sinapsi. In particolare, ci aspettiamo di ottenere applicazioni tecnologiche innovative per lo studio della sinapsi, tra cui: Fluorescence Resonance Energy Transfer applicata allo studio dell'interazione proteina-proteina alla sinapsi; produzione e caratterizzazione di anticorpi specifici per proteine sinaptiche fosforilate; saggi ottici per lo studio del riciclo delle vescicole sinaptiche; paradigmi sperimentali per l'uso di tossine che bloccano il riciclo delle vescicole sinaptiche in vitro e in vivo; tecniche di perfusione intracellulare di peptidi o anticorpi in singoli neuroni che formano autapsi; metodiche di trasfezione di neuroni e astrociti in retine espiantate tramite la tecnica del gene gun; tecnica del doppio patch da neuroni e astrociti; analisi combinate di imaging per il calcio ed elettrofisiologia da singoli neuroni o astrociti; analisi proteomica durante la sinaptogenesi e la LTP. Ci aspettiamo allo stesso tempo di ottenere un quadro molecolare dei processi di sinaptogenesi e plasticita' sinaptica. A livello presinaptico, ci aspettiamo di identificare complessi multimolecolari di proteine delle vescicole sinaptiche e della membrana plasmatica, che modulano il rilascio di neurotrasmettitore. Ci aspettiamo inoltre di definire lo stato di attivazione di protein chinasi selezionate in vari stadi di sviluppo neuronale, e di chiarire quali sono gli effetti funzionali delle fosforilazioni di substrati vescicolari sulla modulazione dell'interazione proteina-proteina e sul ciclo eso-endocitotico delle vescicole sinaptiche. Prevediamo inoltre di definire in che misura una segnalazione retrograda dal bersaglio postsinaptico sia in grado di modulare la formazione di complessi multiproteici e l'attivazione di specifiche vie di trasduzione del segnale nel terminale presinaptico. Ci aspettiamo poi di ottenere importanti informazioni sui meccanismi che regolano l'espressione e la localizzazione di canali ionici SK e dei recettori nicotinici in diversi distretti subcellulari, e sul loro ruolo nel regolare l'attivita' eso-endocitotica nel corso dello sviluppo e di LTP. Mediante gli studi di regolazione della trascrizione ci aspettiamo in particolare di ottenere informazioni circa i meccanismi genetici che governano l' espressione neuro-specifica delle proteine. Tramite analisi proteomica, ci aspettiamo di generare mappe di riferimento delle proteine citosoliche e sinaptiche su gel bidimensionali, in condizioni di controllo e in varie condizioni sperimentali, ottenendo cosi' un profilo biochimico completo del neurone durante lo sviluppo e durante fenomeni di plasticita' a lungo termine. Prevediamo inoltre di definire i meccanismi di rilascio di glutammato e di altre sostanze neuroattive dagli astrociti, e di ottenere informazioni riguardo alla modulazione di tale rilascio da parte di neuroni durante la maturazione funzionale della sinapsi. Ci aspettiamo infine di ottenere la convalida della maggior parte dei risultati ottenuti in modelli in vivo.<<<

Durata

36 mesi