RICERCA ITALIANA     

Misfolding di proteine e patologie umane: studio della conversione patologica di proteine globulari in aggregati fibrillari e sviluppo di farmaci che inibiscano i processi di misfolding e aggregazione

Università degli Studi di Udine

Abstract

Una categoria di malattie unificate da una comune caratteristica patologica, la deposizione nei tessuti di aggregati fibrillari di proteine, sembra essere causata da un anormale processo di folding delle stesse proteine. Mutazioni puntuali di aminoacidi o condizioni ambientali possono facilitare la fibrillogenesi di determinate
proteine. In queste condizioni esse perdono la loro funzione fisiologica e le fibrille costituite danneggiano il tessuto bersaglio attraverso una sostituzione del parenchima funzionale ed effetti citotossici specifici. Il progetto triennale mira a studiare il meccanismo molecolare di conversione di proteine globulari in fibrille. L'obiettivo finale è la identificazione di bersagli molecolari lungo il percorso di misfolding di un set di proteine che dovrebbero diventare importanti come substrato attaccabile per il trattamento e la terapia delle patologie specifiche. Per accertare questa rilevanza, verrà saggiata la possibilità di prevenire o ritardare la formazione di intermedi patologici e la formazione di fibrille amiloidi, o anche distruggere gli aggregati prima della precipitazione, attraverso due strategie complementari: i) una ricerca ed ottimizzazione di ligandi in grado di complessare stabilmente le proteine di interesse o i loro oligomeri protofibrillari, per stabilizzarne la conformazione ed impedire la trasformazione amiloidogena. Oltre all'ulteriore miglioramento di molecole con note la capacità leganti, una rilevante parte del lavoro sarà basata sull'impiego di una vasta libreria di composti guida per la ricerca sistematica di ligandi, incluso il lavoro di supporto necessario per lo sviluppo di protocolli di saggio convenienti ed affidabili; ii) una attività parallela tesa allo sviluppo di anticorpi
antiamiloide capaci di riconoscere gli intermedi di misfolding o i loro oligomeri e di vaccini basati sulla fusione dei determinanti antigenici di strutture amiloidogene con opportuni carrier fagici non tossici, in grado di stimolare una risposta immunitaria. antiamoiloidogena.
Il punto di partenza scientifico del presente progetto è la attività clinica e gli argomenti generali relativi nella patologia amiloide causata da depositi fibrillari intra ed extracellulari ed in particolari malattie amiloidi che rappresentano l'esempio clinico più rilevante di questa patologia. Il Lavoro del Centro per lo Studio e la Cura delle amiloidosi al Policlinico dell'Università di Pavia permetterà la raccolta e la valutazione di informazioni cliniche da un grande numero di pazienti, come pure la archiviazione di materiali biologici rari (cellule, tessuti, campioni diplasma e liquidi biologici contenenti proteine patologiche) per la successiva caratterizzazione, biologica, biochimica o biofisica. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

PAOLO VIGLINO, Universita' degli Studi di UDINE

Obiettivo del Finanziamento

1. Dalla patologia clinica alla patologia molecolare delle amiloidosi
Verrà effettuata una indagine clinica sull'incidenza delle amiloidosi in pazienti sottoposti a trattamento di emodialisiu cronica, insieme con la diagnosi ed il follow-up di pazienti affetti da altri tipi di amiloidosi sistemica (ApoA1, immunoglobuline, etc) o tessuto specifica. Verrà affrontato un problema specifico, cioè la localizzazione di depositi amiloidi di b2-m e della catena leggera delle immnoglobuline. Inoltre verrà investigata l'entità patologica di deposizione di IgA nel mesangio, che condivide con le malattie amiloidi il problema dl riconoscimento selettivo di un tessuto bertsaglio, ma differisce per quanto riguarda la conversione strutturale. E' programmato il campionamento di materiale amiloide per procedure diagnostiche e l'estrazione e l'immagazzinamento di fibrille per fornire materiale biologico per la caratterizzazione biofisica e biologica. Verrà affrontata l'interazione di ApoA1 con fosfolipidi in vivo utilizzando un modello transgenico, per indagare il ruolo dei lipidi nel percorso amilodogenico della proteina. La specificità della localizzazione tissutale della patologia amiloide verrà studiata nel mesangio renale per determinare il ruolo molecolare dell'emilina-1 e di altre proteine fibrose mesangiali nel legame con proteine amiloidi.

Obiettivo 1: Indagine clinica ed isolamento di fibrille e proteine amiloidi. Studi di patologia molecolare delle amilodosi di apoA1 e da immunoglobuline con selettivo interessamento d'organo.

II. Caratterizzazione strutturale degli interrmedi che innescano la formazione di fibrille
Lo studio di quattro proteine: b2-microglobulina (b2-m), apolipoproteina A1 (apoA1), huntingtina, e la proteina del prione (PrPc), che formano fibrille, ciascuna delle quali possiede una sua peculiare struttura e funzione, intende stabilire l'estensione dei cambi conformazionali che devono essere subiti dalle differenti molecole per formare un intermedio di oligomerizzazione in protofilamenti fibrillari. La valutazione dei cambiamenti nell'energia libera e nel percorso di folding, insieme con i dettagli conformazionali di intermedi ed oligomeri, dovrebbe fornire l'informazione necessaria a progettare strumenti farmacologici e strategie intese a prevenire la fibrillogenesi e rimuovere gli aggregati fibrillari. Verrà affrontata inoltre l'interazione di apoA1 con fosfolipidi in vitro con i classici metodi biochimici, per investigare il ruolo dei lipidi nel percorso amiloidogenico della proteina. Verranno ottenute informazioni strutturali direttamente dagli intermedi e dagli oligomeri attraverso tecniche CD, fluorescenza, spettrometria di massa ed NMR, come sulle fibrille formate dalla microscopia elettronica ed a forza atomica e dai raggio X a basso angolo.

Obiettivo 2: Comprendere gli aspetti strutturali del misfolding degli intermedi proteici per una razionale progettazione di farmaci antifibrillogenici ed il trattamento delle amiloidosi

III. Identificazione di ligandi delle proteine amilodogeniche
Questo compito implica lo screening di una grossa libreria (fino a 100.000 composti sintetici) per isolare in prima istanza ligandi per la b2-m da usare per lo sviluppo di nuovi farmaci. La b2-m è selezionata come primo bersaglio per i ligandi per tre motivi: 1) la notevole quantità di informazioni disponibili sulle proprietà strutturali e di dinamica di folding per questa proteina. 2) L'alto costo sociale della malattia causata dalla amiloidosi da b2-m ed il possibile sfruttamento industriale della scoperta di ligandi della b2-m 3) la possibilità di usare i ligandi per la b2-m non solo come farmaci di una terapia in vivo, ma come assorbenti potenziali della conformazione tossica nella procedura dialitica.
La selezione del ligando ottimale verrà realizzata con una combinazione di nuove tecniche per lo screening veloce di composti capaci di stabilizzare la struttura della proteina, tecniche classiche di chimica analitica farmaceutica e miglioramento dei parametri di legame guidati dalla modellistica basata sulla caratterizzazione strutturale dei complessi. Lo screening verrà accelerato dall'uso di un apparato BIACORE recentemente acquisito da una delle unità. L'approccio verrà quindi esteso alle altre proteine amiloidogeniche studiate.

Obiettivo 3: Identificazione di ligandi delle proteine amilodogeniche idonei per essere usati come farmaci per prevenire la formazione di fibrille

IV. Produzione e caratterizzazione funzionale di anticorpi antiamiloide potenzialmente utili nella produzione di vaccini.
Verranno prodotti anticorpi monoclonali (mAb) e policlonali (pAb) contro le proteine in esame a differenti stadi lungo il loro percorso di conversione amiloide. Molti ibridomi che producono anticorpi monoclonali murini contro la b2-m (Stoppini et al, 1997) e la apoA1 sono gia disponibili in due delle unità (Pavia e Milano). Essi verranno provati nella loro capacità di evitare la precipitazione in vitro e ritardare la tossicità in idonee culture cellulari modello. L'identificazione di pAb e mAb funzionali che interferiscano con il processo di formazione amiloide mira a porre le basi per la progettazione di vaccini preventivi o terapeutici contro le malattie degenerative amilodi. Oltre alla caratterizzazione di sequenze appropriate capaci di stimolare la risposta immunitaria, verrà provato l'uso di particelle fagiche come vettore idoneo in considerazione della facilità di costruzione e produzione e della mancanza di effetti secondari tossici per l'uomo. Il sito di legame di anticorpi funzionalmente convenienti verrà clonato in un frammento a singola catena (scFv) e trsfettato in sistemi idonei utilizzando un vettore eucariotico; in alternativa scFv verrà isolato da una libreria di fagi esprimenti scFv. Quindi l'anticorpo scFv verrà ingegnerizzato con l'addizione di domini appropriati con funzioni specifiche e verrà impiegato per monitorare il meccanismo del danno amiloide.

Obiettivo 4: Produzione e caratterizzazione di anticorpi monoclonali e policlonali, capaci di interferire sul processo di misfolding e di fibrillogenesi, prototipi di trattamenti immunoterapeutici

V. Studi funzionali e biochimici delle proteine prioniche PrPc e Doppel
Questa parte del progetto mira a realizzare la caratterizzazione ed il monitoraggio in singole cellule vive di due proteine prioniche, la amiloidogenica PrPc e la non amiloidogenica Doppel, espresse in linee di cellule neuronali o colture primarie cerebellari o di astrociti. Basati su costrutti di fusione con la proteina verde fluorescente (GFP), applicata con successo al monitoraggio del prione nelle cellule viventi (CHO, HeLA ed N2A), verranno studiate le varianti umane di PrPc e Dpl, espresse come chimere fluorescenti in linee cellulari SK-N-BE o colture primarie adatte. Ciascuna proteina sarà inoltre analizzata secondo parametri generali standard per caratterizzare la biochimica ed il posizionamento cellulare, cioe il tipo di glicosilazione, la associazione con microdomini della membrana ad alto contenuto in colesterolo e glicosfingolipidi, la corretta posizione rispetto alla membrana plasmatica. I dati raccolti renderanno possibile il confronto fra il comportamento cellulare di di PrPc e Dpl per valutare, insieme con dati strutturali ottenuti da studi NMR ed a raggi X, il ruolo che viene giocato dal dominio N-terminale di di PrPc , con repeats ricchi in His e Gly e che viene perso nella sequenza Dpl, e dal ponte disolfuro addizionale presente in Dpl, come pure il danno determinato da quest'ultimo sia molto simile a quello che si ottiene dalla conversione PrPc -PrPSc. Così, questa attivita, con l'analisi dei meccanismi neuro degenerativi causati dalle proteine prioniche, darà informazioni sugli aspetti strutturale e meccanicistici della amiloidogenesi prionica di importanza sia specifica che generale per lo studio del fenomeno.


Obiettivo 5: Caratterizzazione della biochimica dello smistamento cellulare e delle relazioni fisiopatologiche incrociate di due proteine prioniche con differenti capacità amiloidogeniche e simili modelli neurodegenerativi

VI. Studio del meccanismo della tossicità cellulare indotta da proteine amilodogeniche
Studiando il meccanismo di tossicità cellulare indotto da aggregati fibrillari delle proteine patogeniche selezionate, verranno identificati aspetti comuni o proteino specifici ed usati per elaborare regole generali per il trattamento farmacologico del danno cellulare amiloide. I protocolli ed i sistemi per questa indagine saranno simili a quelli già impiegati per studiare la tossicità del peptide A-beta nell'Alzheimer. Questo lavoro rappresenterà una componente chiave dell'intero progetto perchè tutte le molecole (anticorpi o composti sintetici) riconosciuti come ligandi delle proteine bersaglio verranno utilizzati in tentativi di inibire la tossicità cellulare.

Obiettivo 6: Elaborazione di principi generali per il trattamento del danno cellulare dovuto alle amiloidosi<<<

Durata

36 mesi