RICERCA ITALIANA     

Sistemi di diagnostica molecolare per l'identificazione e l'analisi di determinanti genetici di rilevanza per l'agroindustria, la zootecnica e l'ambiente

Università degli Studi di Milano

Abstract

ABSTRACT
Il Progetto è proposto da UR appartenenti a 4 Atenei, una Fondazione di ricerca, un Istituto per la Cerealicoltura ed è diretto dal Prof. Salamini, Direttore del Max-Planck Inst. di Colonia, del CISI e professore ordinario presso l'UNIMI. LO SCOPO COMUNE DELLE UR È DI COLLABORARE ALLO SFORZO INTERNAZIONALE DI CONOSCENZA DEI MECCANISMI MOLECOLARI CHE CONTROLLANO LO SVILUPPO, LA CRESCITA E LA RISPOSTA ALL'AMBIENTE DI ORGANISMI DI INTERESSE AGRONOMICO avendo quale OBIETTIVO FINALE IL MIGLIORAMENTO DI CARATTERISTICHE LEGATE ALLA QUALITÀ ED ALLA PRODUTTIVITÀ DI SPECIE VEGETALI ED ANIMALI DI INTERESSE AGRICOLO.
Le UR afferenti al Progetto collaboreranno attivamente alla realizzazione della strategia comune mantenendo l'uniformità di distribuzione di compiti scientifici e quote del finanziamento richiesto. La cooperazione tra UR, inoltre, sarà incentrata sulla condivisione ed implementazione delle strutture messe a disposizione dal CISI (Centro Interdisciplinare Studi biomolecolari e applicazioni Industriali). Il CISI rappresenta lo sforzo organizzativo del centro di eccellenza dell'UNIMI, è diretto dal Prof. Salamini e si interessa di diagnostica genetico-molecolare applicata alla medicina umana, veterinaria, chimica combinatoriale ed alle scienze agrarie., gestendo piattaforme tecnologiche ad elevato throughput. Il CISI è anche supportato da imprese private e Fondazioni, tra le quali il Centro Ricerche e Studi Agroalimentari, UR di questo Progetto.
QUESTO PROGETTO PROPONE QUINDI LA IMPLEMENTAZIONE DI UN INNOVATIVO APPROCCIO SCIENTIFICO AL MIGLIORAMENTO DEL GENOMA DI SPECIE DI INTERESSE AGRARIO CON UNA STRUTTURA ORGANIZZATIVA, PRODUTTIVA E SCIENTIFICA DI ECCELLENZA (Grafico 1).
Grafico 1

Per la realizzazione del Progetto le UR, organizzate in work packages, reperiscono le facilities necessarie (Grafico 2), presso enti pubblici e privati, e SONO COORDINATE OPERATIVAMENTE PER LA RAZIONALIZZAZIONE DEGLI OBIETTIVI SCIENTIFICI E DEGLI STRUMENTI UTILIZZABILI PER IL LORO PERSEGUIMENTO, DALLA STRUTTURA ORGANIZZATIVA DEL CISI.
Grafico 2

La integrazione del Progetto con le strutture e le infrastrutture del CISI risulterà nella adozione e messa a punto di tecnologie innovative che saranno utilizzate da tutte le UR. Quindi, questo rapporto RISULTERÀ DA UN LATO NELLA CREAZIONE DI UN NETWORK SCIENTIFICO FACENTE CAPO AL CISI E DALL'ALTRO DALLA CONDIVISIONE DI KNOW-HOW E TECNOLOGIE AVANZATE A BENEFICIO DEGLI SPECIFICI PROGETTI DI RICERCA. Questo approccio facilita lo sviluppo di reti di cooperazione nazionale ed internazionale incentivanti il richiamo di ricercatori italiani, anche attivi all'estero, nonché la mobilità dei ricercatori tra Università, enti pubblici di ricerca, centri di ricerca privati. LA REALIZZABILITÀ DI QUESTI SCOPI DA PARTE DEL PROGETTO È DIMOSTRATA DALLA QUANTITÀ DI CONTRATTI PER GIOVANI RICERCATORI PREVISTI E DALLA PARTECIPAZIONE AL PROGETTO DI UNA FONDAZIONE PRIVATA E DI NUMEROSE SOCIETÀ (dichiarazioni allegate).
I membri partecipanti alle UR esprimono eccellenza scientifica nei settori in cui si propongono per questo Progetto, come provato dai curricula e dalle pubblicazioni che sostengono le attività proposte. In particolare i passaggi logico-sperimentali adottati dalle UR sono riconducibili a 5 Attività di ricerca tra loro integrate (vedi Grafico 3):
Grafico 3

a. potenziamento della piattaforma tecnologica CISI-NAT e bioinformatica
b. resistenza alle malattie e produttività di animali da allevamento studiati associando la variabilità molecolare a quella fenotipica mendeliana e quantitativa (QTL);
c. selezione assistita di varietà di piante poliennali Rosacee con migliorata qualità del frutto ed in vite anche per migliorare qualità nutrizionali;
d. modellizzazione dello sviluppo fogliare come condizionato da geni omeobox; funzione di questi geni nella capacità di light-harvesting;
e. variabilità genetica in generi e famiglie componenti di biotopi alpino-appenninici e derivazione di indici di misura e gestione della biodiversità;
Il Progetto è sviluppato in parte significativa da ricercatori recentemente rientrati in Italia dopo esperienze scientifiche estese nel tempo presso Istituzioni di ricerca degli Stati Uniti, Svezia, Germania, Canada e UK. Le ricerche di base sviluppate dal Progetto verranno utilizzate in collaborazione con Parchi Tecnologici, Associazioni di produttori, ditte private. Più in dettaglio, le attività proposte possono essere riassunte nei seguenti obiettivi:
WP1. gestione automatizzata di colonie batteriche; cloni BAC e YAC; creazione di array per la misura dell'espressione genica; robotizzazione di SNP scanning; preparazione di database per dati fenotipici e molecolari; creazione di software per la gestione di QTL mapping (convenzionale, via LD).
WP 2. studi sulla presenza di riarrangiamenti del DNA nella clonazione bovina; scansione della discontinuità zigotico-somatica; studio di ceppi virali di PRRS dell'apparato respiratorio suino; studio di complessi genici con espressione alterata a seguito di infezione da PRRS; ricerca di resistenze genetiche in popolazioni di suino attraverso studi di LD (via SNP); MAS; SNP specifici per sistemi MCH RfpY in pollo; mappatura di QTL per produzione in bovino.
WP3: produzione di mappe di funzione (EST-SNP) per geni della qualità in pesco, melo e vite; produzione di mappe molecolari dense; sequenziamento di EST in pesco e melo; mappaggio di QTL in collezioni di accessioni e popolazioni sperimentali, tra linee coltivate via LD o mapping convenzionale; preparazione di protocolli MAS per la selezione precoce.
WP4. Filogenesi molecolare delle sequenze omeobox; definizione di gruppi di omologia ortologhi; produzione di vettori di trasformazione per quattro geni omeobox; ottenimento di knock-out in Arabidopsis; espressione genica degli stessi; database di tutti i risultati; formulazione di un modello di evoluzione dei geni omeobox nella funzione di controllo dei primordi fogliari; strategie di trasferimento del modello a specie di interesse agricolo migliorabili per light harvesting.
WP5. Definizione del livello morfologico e molecolare di variabilità genetica in famiglie, generi, specie e popolazioni dei biotopi considerati; dati di distanza genetica tra biotopi; predizione di VG nelle zone ibride; definizione dei contenuti di VG compatibili con la conservazione dei biotopi e dei taxa; norme virtuose basate su dati molecolari per la conservazione della biodiversità; priorità di conservazione, anche sulla base del contributo di geni utili al miglioramento di specie coltivate.

Il progetto include una proposta di creazione di una nuova infrastruttura cofinanziata dall'UNIMI e già prevista all'atto costitutivo del CISI, con caratteristiche specificate al punto 1.12 del presente progetto.

Acronimi usati nel testo
VG: variabilità genetica
MM: marcatori molecolari
MAS: marker assisted selection
SNP: single nucleotide polymorphism
LD: linkage disequilibrium
QTL: quantitative trait loci <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

FRANCESCO SALAMINI, Universita' degli Studi di MILANO

Obiettivo del Finanziamento

Obiettivi generali
Questo Progetto di propone di studiare la variabilità genetica in tutte le sue componenti, dipendenti dall'ereditarietà di caratteri semplici e complessi, dalla natura molecolare e dai profili di espressione dei geni che sostengono i tratti analizzati e dei prodotti proteici da questi codificati, dalla variabilità genomica somatica. La ricerca di base sviluppata sarà la premessa all'applicazione di kit diagnostici al miglioramento genetico di piante ed animali.
L'obiettivo generale del Progetto è articolabile nei seguenti sotto-obiettivi:
a. adozione di tecnologie innovative e di metodologie d'avanguardia nello studio della genomica e della post-genomica applicate a specie animali e vegetali di interesse agrario;
b. utilizzo di metodi di indagine propri della scienza del genoma e del post-genoma per l'ottenimento di varietà e razze migliorate per caratteri legati alla produttività, alla qualità del prodotto ed ad alcune caratteristiche salutistiche;
c. potenziamento e promozione della rete di ricerca organizzata nel Centro di Eccellenza dell'Università di Milano (CISI);
d. integrazione mediante partenariato con imprese operanti nel settore pubblico, con particolare riferimento a quelle operanti nelle tecnologie biologiche applicate alle specie vegetali ed animali di interesse agricolo ed a quelle impegnate nello sviluppo di nuove tecnologie nel settore della diagnostica molecolare;
e. inserimento di giovani ricercatori all'interno delle UR e favorire il rientro in Italia di giovani ricercatori che abbiano completato la propria formazione all'estero.
La struttura organizzativa del Progetto è rappresentata da
a. piattaforma per l'analisi ad alta efficienza di acidi nucleici (NAT) presente presso il CISI potenziata per estenderla alla produzione robotizzata degli elevati volumi richiesti da stime di biodiversità e dalla pratica della selezione assistita da marcatori (MAS), di sequenze EST, SNP, SSR, AFLP, interazioni proteina-proteina;
b. piattaforma bioinformatica specifica per gli scopi di questo Progetto che gestisce sia database relativi a biotopi naturali, sia la modellistica delle associazioni genotipo-fenotipo nelle collezioni di popolazioni sperimentali di specie coltivate;
c. coordinamento presso il CISI di strutture di conservazione di campioni biologici animali e vegetali e presso altre UR di conservazione ex-situ di piante (UR UNIGenova); di conservazioni in situ a cura di UNI-Genova di una zone ibride alpino-appenniniche preliminarmente definite nei parametri di associazioni di specie, generi e famiglie vegetali e della variabilità molecolare presente nelle stesse.
A queste strutture e facilities afferiscono e collaborano le UR componenti il Progetto. La loro attività è organizzata in obiettivi scientifici, di seguito descritti.

Obiettivi scientifici
Il principio che unifica i processi metabolici dei diversi organismi viventi eucariotici è il possesso di una comune struttura cellulare e molecolare. Per questo, è possibile sviluppare appropriati disegni sperimentali volti alla loro conoscenza, descrizione, conservazione, evoluzione ed uso. Nell'era post-genomica, questi parametri vengono costruiti in base all'esistenza di polimorfismi del DNA in regioni genomiche e geniche o di sequenze polipeptidiche, polimorfismi che hanno accertate potenzialità diagnostiche. Questi parametri producono misure precise di diversità genetica che permettono di affrontare con precisione scientifica fino ad oggi impossibile, temi centrali alla biologia di base ed applicata. L'era post-genomica rende cioè attuabile la diagnosi genetica che definisce numericamente l'estensione precisa della diversità entro e tra popolazioni vegetali ed animali spontanee e sperimentali.
Sulla base di questi presupposti, il Progetto può essere articolato in diversi obiettivi scientifici:
1. L'OBIETTIVO SCIENTIFICO GENERALE del progetto si rifà alla osservazione che l'esistenza di varianti genetiche in popolazioni spontanee o sperimentali può essere associata alla variazione morfo-funzionale. Cioè che l'utilizzazione di indici molecolari del DNA permette di:
a. misurare la variabilità genetica e rendere scomponibile quanto più possibile nelle sue componenti semplici caratteri genetici anche di natura complessa;
b. prevedere il grado e l'estensione della variabilità fenotipica nelle popolazioni naturali. Il fine ovvio di questa attività è di descrivere e di conservare la biodiversità in base a parametri misurabili con precisione, ed eventualmente di identificare specie selvatiche che possano contribuire geni utili a quelle coltivate;
c. guidare l'evoluzione sotto controllo antropico delle popolazioni di piante coltivate e di animali allevati utilizzando criteri selettivi assistiti dai marcatori molecolari. Questa ricerca di parametri molecolari e della loro associazione con parametri fenotipici è la premessa per l'applicazione in fasi precoci del ciclo vitale di azioni selettive operate con valori di ereditabilità quanto più approssimati all'unità. L'artificio è quanto mai necessario per piante poliennali che entrano in piena produzione dopo qualche anno dalla loro semina o per caratteri di animali allevati valutabili solo nelle loro progenie;
d. progettare programmi di miglioramento genetico da svilupparsi in tempi più brevi rispetto al miglioramento tradizionale, basandosi sulle informazioni molecolari fornite dai marcatori utilizzati e dal loro linkage a caratteri di interesse per il miglioratore, sia in specie animali che vegetali.
2. GLI OBIETTIVI SPECIFICI del Progetto, oltre a prevedere azioni di potenziamento di una piattaforma NAT attiva presso il CISI (WP1) sono riassumibili in 4 linee di ricerca (Work packages), strettamente integrate tra loro:
a. Work Package 1: potenziamento ed implementazione di una piattaforma tecnologica ed informatica. Le Attività previste si propongono di potenziare la piattaforma CISI-NAT aggiungendole alcune importanti tecnologie. Il potenziamenteo previsto viene schematicamente riportato in Figura.

Le attrezzature richieste in aggiunta a quelle disponibili permetteranno: 1) la gestione robotizzata di librerie di grossi inserti genomici; necessarie per il clonaggio di geni in base alla loro posizione di mappa (melo, pesco, specie zootecniche); 2) la robotizzazione delle operazioni di SNP scanning (DHPLC) per consentire un efficiente mappaggio di polimorfismi SNP, specialmente in pesco; 3) sviluppo di microarrays. La nuova piattaforma NAT sarà comunque disponibile per tutte le UR partecipanti al Progetto. La piattaforma CISI di bioinformatica verrà completata mediante l'implementazione di software che ne consentano l'adeguamento agli scopi del Progetto e consisterà nella produzione di DB per l'analisi fenotipica e molecolare delle popolazioni di organismi studiate, nella gestione di dati della variabilità presente in biotopi e loro uso ai fini della conservazione di VG; nella adozione e modificazione di modelli di filogenesi molecolare; nella gestione delle tecniche DHPLC per il mapping di SNP, nel sequenziamento automatico di cloni BAC.
b. Work Package 2: L'attività di questo Work Package è finalizzata all'indagine delle correlazioni tra variabilità genomica e fenotipica in animali d'allevamento per quel che attiene l'individuazione di caratteri fisio-patologici economicamente importanti. Il fine ultimo del WP2 è la selezione per tratti vantaggiosi e la messa a punto di sistemi economici, automatizzabili ed esportabili di diagnosi del genotipo per caratteri importanti. Inoltre il WP2 affronterà lo studio della variabilità genomica cellulare verificabile anche all'interno dello stesso individuo in animali derivati da processi di clonazione. Particolari sindromi patologiche in animali d'allevamento verranno considerate come modello per lo sviluppo di sistemi diagnostici basati su marcatori molecolari e su studi effettuati su popolazioni commerciale di linkage disequilibrium. Verranno inoltre considerati caratteri genetici coinvolti nella resa produttiva dei bovini da latte.
c. Work Package 3: l'Obiettivo persegue la parametrazione molecolare della variabilità genetica presente in collezioni varietali di piante agrarie Drupacee (pesco), Rosacee (melo) e nella vite, e di loro popolazioni sperimentali. I parametri ottenuti da questa attività di tipizzazione molecolare permettono l'associazione tra genotipo e fenotipo (mediata da marcatori molecolari concatenati come SNP ed AFLP), per caratteri che influenzano la maturazione del frutto e, di riflesso, la sua qualità commerciale. Parte integrante di questo Obiettivo è: 1) lo sviluppo di modelli convenzionali e/o basati su linkage disequilibrium per il mappaggio di QTL; 2) la preparazione di database e relativi modelli di bioinformatica di assistenza alla scelta di geni candidati per un determinato fenotipo e per il clonaggio genico per posizione. I QTL investigati sono importanti per la comprensione dei meccanismi molecolari che determinano la qualità del frutto, sia in termini di caratteristiche organolettiche che di proprietà legate ad aspetti nutrizionali ed allergenici. Obiettivo applicativo del WP3 è la produzione di kit diagnostici di marcatori molecolari per la valutazione precoce (quindi già in semenzale) di caratteristiche importanti per la qualità commerciale del frutto di pesco e di melo. L'individuazione di aplotipi fra i geni o marcatori considerati nelle popolazioni panmittiche renderà più facile sviluppare studi di linkage disequilibrium per caratteri della qualità del frutto.
d. L'Attività del WP4 vuole verificare il fondamento scientifico dell'assunzione secondo la quale studi delle relazioni filogenetiche tra sequenze geniche e delle loro sintenie possono facilitare grandemente i processi di comprensione e dissezione di funzione genetiche complesse comparate in specie molto diversificate. Il modello adottato si basa sulla indagine dei geni alla base dei meccanismi che controllano lo sviluppo precoce della pianta. La foglia sarà al centro dell'analisi del WP4. Questo organo infatti presenta, soprattutto in certi phyla, particolari caratteristiche evolutive ed una anomala "plasticità" genetica. Il WP4 studierà particolarmente una specifica classe di fattori di trascrizione (geni omeobox) e la loro capacità di regolare processi fondamentali quali appunto l'organogenesi. Gli studi si ripromettono chiarire i complessi meccanismi che regolano il passaggio del meristema da fase vegetativa a fase riproduttiva, il grado di determinazione del meristema apicale e la capacità di alcuni organi di riprendere attività meristematica anche in fasi avanzate di sviluppo. In ultima analisi, il controllo di questi meccanismi mediante selezione promette di estendere alle piante agrarie concetti fisiologici utili per l'ottenimento di varietà con caratteristiche agronomiche positive. Si pensi ad esempio ai vantaggi derivanti dal poter controllare il momento della fioritura o dalla possibilità di modificare il light harvesting delle foglie. Gli esiti relativi alla ricerca di base di questo WP saranno altrettanto importanti, poiché l'analisi si spingerà alla valutazione dei fenomeni evolutivi che hanno condotto alla formazione della foglia e delle sue numerose variazioni morfo-fisiologiche.
e. Work package 5: si rivolge all'uso di marcatori discontinui e di sequenze di DNA finalizzato alla filogenesi molecolare ed alla conservazione in situ ed ex situ della VG. I modelli prodotti potrebbero costituire la base di partenza per le Attività di altri WP. Studi di filogenesi molecolare basati su marcatori possono rivelare come nelle associazioni vegetali, specie, generi e famiglie con elevato valore diagnostico possano fornire parametri molecolari di distanza genetica per:
i. definire i contenuti e l'estensione territoriale di zone ibride alpino-appenniniche oggetto di possibile conservazione in situ;
ii. definire lo stato ecologico di un biotopo in base al contenuto di variabilità genetica di specie, generi e famiglie con valore diagnostico;
iii. valutare l'estensione e la composizione di collezioni vive mantenute ex situ presso i giardini dell'UNI-Genova e di collezioni di semi di specie in pericolo di estinzione.
Il WP5 svilupperà una intensa attività di coordinamento tra strutture universitarie sul territorio genovese per la realizzazione, acquisizione ed implementazione di collezioni di germoplasma. Il lavoro di fingerprinting molecolare verrà effettuato grazie alla stretta collaborazione, sia in termini operativi che di supporto tecnico-metodologico, con il WP1 del CISI dell'UNIMI. Questo si completerà con l'acquisizione e l'ottimizzazione di alcune apparecchiature per l'automazione del laboratorio che saranno a disposizione di tutto il Progetto ed in particolare del WP5. Le infrastrutture offerte dal CISI fungeranno in questo senso da valida premessa e linea guida.

Risultati attesi
1. Il Progetto propone la realizzazione di modelli MAS per il miglioramento dei genomi delle piante coltivate e di specie allevate. Il modello è il risultato generale più visibile: rende possibile una guida evolutiva, sotto il controllo antropico, dei genomi di pesco, vite, melo e, tra le specie zootecniche, bovini, suini e polli. Nella pratica del miglioramento genetico, questo corrisponde alla preparazione di protocolli basati su MM, con i quali selezionare varietà e razze superiori. Gli organismi considerati hanno un ruolo centrale nella produzione di derrate agroalimentari in Italia, in parte largamente esportate.
2. Un secondo risultato è lo sviluppo e l'uso di metodi di misura della VG basati sui MM. Questo permette di 1) proporre metodi scientifici di conservazione di biotopi di rilevanza ecologica; 2) valutare in base alla VG presente, il grado di degenerazione di un biotopo; 3) caratterizzare flore locali anche con l'obiettivo di individuare geni utili al miglioramento di specie agrarie; 4) contribuire a comprendere la rilevanza delle modalità di sviluppo della foglia dai suoi primordi ai fini di definire regole di light harvesting per le piante coltivate; 5) fornire strumenti molecolari per la comprensione dei caratteri genetici alla base di resistenze a patologie e produttività in specie zootecniche.
3. Il Progetto potenzia le piattaforme NAT e bioinformatica del CISI, amplificandone lo spettro e rendendole più adatte alle necessità del progetto ed in generale all'offerta di tecnologia NA alla comunità scientifica e produttiva, attive in Italia nel settore. E' qui rilevante sottolineare che già collaborano con il CISI molte compagnie biotecnologiche private e che questo Progetto ha il sostegno convinto di Istituzioni pubbliche, private ed Associazioni di produttori interessate a trasformare la tecnologia di base prodotta dal progetto in mezzi di produzione agricola.
4. Diversi UR che sviluppano questo Progetto sono guidati da personale che ha frequentato per un lungo periodo Istituzioni di ricerca in USA, Canada, Svezia e Germania. Uno dei risultati sarà l'interazione di questi ed altri ricercatori senior con giovani laureati per i quali viene sviluppato un programma di training presso il CISI, delegati comunque a svolgere attività di ricerca anche nell'ambito di questo Progetto.
I risultati specifici per ogni WP ed UR sono elencati in dettaglio nei capitoli ad essi dedicati.<<<

Durata

36 mesi