RICERCA ITALIANA     

MICRO-SISTEMI PER DIAGNOSTICA GENETICA

Politecnico di Milano

Abstract

Il Progetto intende sviluppare sistemi analitici di piccole dimensioni e alta versatilita' per diagnostica genetica, arrivando a validarli in effettive applicazioni di diagnostica medica e ponendo le basi per la loro evoluzione verso prodotti industriali a basso costo. Intende infatti mettere a disposizione i risultati innovativi ottenuti per trasferimento tecnologico all'industria e tutelarne la proprieta' intellettuale mediante brevetti ove applicabile.

Lo spettro di competenze e attivita' necessarie e' bene coperto dalle unita' di ricerca partecipanti: POLIMI per microelettronica, optoelettronica, strumentazione di misura; LAMEL per microdispositivi, microsistemi e relative tecnologie di fabbricazione; CSMDR per microsistemi fluidico-meccanici e relative tecnologie di microlavorazione in vetro e silicio; IBRM per la chimica dei polimeri applicati in tecniche microanalitiche; TIGEM e HSR per la diagnostica di diversi gruppi di malattie genetiche effettuata con le due principali tecnologie di DNA-microarrays attualmente affermatesi (tecnologie Affymetrix e Nanogen).

L'attivita' proposta riguarda i due tipi di microsistemi analitici sui quali a livello internazionale e' attualmente orientato lo sviluppo in questo campo: i DNA-microarrays e i chip per elettroforesi capillare (CE-microchip). Principali elementi innovativi del progetto sono: (i) una nuova testa microelettronica per la rivelazione ad elevata sensibilita' della fluorescenza dei frammenti di DNA marcati; (ii) nuovi chip di elettroforesi capillare; (iii) nuove tecnologie chimiche per legare oligonucleotidi e DNA alla superficie del vetro; (iv) nuove tecnologie chimiche per la separazione elettroforetica dei frammenti in microcanali.

La pressante tendenza a effettuare le analisi utilizzando quantita' di materiale sempre piu' ridotte e in tempi piu' brevi pone l'esigenza primaria di rivelare e misurare con elevata sensibilita' la fluorescenza dei frammenti di DNA marcati, sia lavorando con DNA-microarrays che con CE-microchip. Si intende progettare e realizzare specificamente per questa applicazione dispositivi microelettronici in silicio rivelatori di singoli fotoni SPAD (Single-Photon Avalanche Diodes), potendo basarsi sulla riconosciuta leadership di POLIMI nel loro sviluppo. Occorre realizzare SPAD con area sensibile adeguata (diametro almeno 40 micron), basso rumore ed elevata efficienza di rivelazione, e con essi miniaturizzare la testa di rivelazione ottica superando le limitazioni poste dai rivelatori ad alta sensibilita' finora utilizzati (tubi a vuoto fotomoltiplicatori PMT).

Per i DNA-microarrays, il Progetto intende sviluppare nuovi metodi per l'immobilizzazione di molecole biologiche (acidi nucleici, peptidi o proteine) sulla superficie del supporto solido dei DNA-microarrays in materiale vetroso, sfruttando la capacità di polimeri a base acrilammidica, opportunamente derivatizzati, di adsorbirsi sulla superficie del vetro.

Per elettroforesi capillare in microchip, il Progetto intende sviluppare e realizzare un apparato capace di effettuare analisi rapide ed automatizzate utilizzando quantita' ridotte di materiale in tempi brevi, superando i limiti delle tecniche attualmente impiegate che richiedono forte intervento manuale e quantita' notevoli di materiale (nel caso di separazione elettroforetica in slab gels) o strumentazione di costo elevato (nel caso di elettroforesi in capillari). A tale scopo si vuole sviluppare: (a) nuovi chip di flusso in vetro (e in vetro-silicio) con caratteristiche adatte al riempimento e ricambio rapido di fasi polimeriche e all'accessibilita' ottica per le misure di fluorescenza; (b) nuovi polimeri acrilici per un rivestimento della parete del canale stabile nel tempo e facilmente rinnovabile e che riduca il flusso elettrosmotico e l'interazione analita-parete; (c) nuovi co-polimeri di acrilamide e allil-monosaccaridi per la separazione dei frammenti di DNA dotati di eccellente azione setacciante e bassa viscosita'.

La validazione della strumentazione e delle metodiche sviluppate nel progetto sara' effettuata confrontandosi in termini di riproducibilità, rapidità, facilità di esecuzione e costo delle analisi con gli apparati per analisi genetiche piu' avanzati attualmente disponibili in produzione industriale. Va sottolineato che i due laboratori interessati lavorano con i due apparati piu' avanzati attualmente in uso, un sistema Affymetrix al TIGEM e un sistema Nanogen allo HSR. Lavorando con DNA-microarrays verranno confrontati i risultati ottenuti con gli apparati attuali e con la nuova testa microelettronica di rivelazione ottica. Una estesa sperimentazione nella diagnostica di varie patologie genetiche frequenti e di disordini della coagulazione verra' effettuata per la validazione. L'utilizzazione di più modelli genetici risulta importante per poter rilevare l'efficacia con diversi tipi di mutazioni, per poter considerare approcci diagnostici differenti, per poter meglio valutare l'affidabilità del sistema e per derivare criteri utili per la progettazione dei microchips. I laboratori detti sono tra i pochi al mondo in grado di valersi efficacemente della tecnica SNE (Single Nucleotide Extension) per l'identificazione delle mutazioni presenti nei campioni sotto esame. I campioni biologici preparati con la SNE verranno analizzati in elettroforesi capillare con il nuovo sistema a CE-microchip sviluppato nel progetto e i dati ottenuti saranno confrontati con quelli ottenuti con i sistemi a DNA-microarray, nei quali la reazione di SNE viene condotta in fase solida (ibridazione su vetrino). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

SERGIO COVA, Politecnico di MILANO

Obiettivo del Finanziamento

Scopo di fondo del Progetto Microsistemi per Analisi Genetica è sviluppare sistemi analitici caratterizzati da piccole dimensioni, alta versatilita' e prestazioni elevate, che siano adeguati ad applicazioni in diagnostica genetica e che rappresentino una base concreta per successive realizzazioni industriali di apparati analitici per uso corrente, suscettibili anche di evolvere verso produzioni a basso costo. Insieme a unita' di ricerca con competenze e attivita' in tecnologie biochimiche, micromeccaniche, microelettroniche e optoelettroniche, risulta percio' essenziale nel progetto la presenza di unita' di ricerca che lavorino sulle applicazioni finali in diagnostica genetica. Questa presenza contribuira' nella prima fase a una corretta definizione delle specifiche e nelle fasi successive permettera' di collaudare in condizioni di impiego finale gli sviluppi tecnologici ottenuti, valutandone obiettivamente la portata e validandone l'effettiva utilita'.

Gli obiettivi scientifici centrali del progetto riguardano i due tipi di microsistemi analitici sui quali attualmente a livello internazionale sono focalizzate le prospettive di sviluppo in questo campo: i DNA microarrays e i microchip per elettroforesi capillare.
Per DNA microarrays, il Progetto intende sviluppare nuovi metodi di attacco di DNA a superfici di vetro e nuova strumentazione optoelettronica ad alta sensibilita' per analisi con tecniche di fluorescenza. I principali risultati attesi sono la riduzione della quantita' di materiale richiesto per l'analisi e del tempo necessario per completarla.
Per elettroforesi capillare in microchip, il Progetto intende sviluppare e realizzare un apparato con caratteristiche adatte ad eseguire analisi rapide ed automatizzate utilizzando quantita' ridotte di materiale. Questa strumentazione, compatta e di facile uso, è destinata ad integrare il massimo delle funzioni all'interno del microchip. Inoltre si intende inserire questo strumento per elettroforesi capillare in un sistema del tipo Lab-on-a-chip, nel quale verranno eseguite in un apparato miniaturizzato anche le fasi di preparazione del campione. Il risultato atteso principale e' il superamento dei limiti delle tecniche attualmente impiegate che richiedono forte intervento manuale e quantita' notevoli di materiale (nel caso di separazione elettroforetica in slab gels) o strumentazione di costo elevato (nel caso di elettroforesi in capillari).

Principali elementi innovativi del progetto proposto sono: una nuova testa microelettronica di rivelazione della fluorescenza dei frammenti di DNA marcati con elevata sensibilita'; nuove tecnologie chimiche di attacco di DNA a superfici di vetro; nuove tecnologie chimiche di separazione elettroforetica dei frammenti in microcanali; nuovi chip di elettroforesi capillare (CE).

Si intende realizzare dispositivi microelettronici in silicio rivelatori di singoli fotoni (SPAD Single-Photon Avalanche Diodes) ad elevata efficienza di rivelazione, basso rumore ed area adeguata (diametro almeno 40 micron) e con essi miniaturizzare la testa di rivelazione ottica, superando cosi' le limitazioni dei rivelatori finora utilizzati (tubi a vuoto fotomoltiplicatori PMT).

Si intende sviluppare un metodo per l'immobilizzazione di molecole biologiche, quali acidi nucleici, peptidi o proteine, sulla superficie del supporto solido dei DNA arrays in materiale vetroso o plastico. Il metodo intende sfruttare la capacità di certi polimeri a base acrilammidica, opportunamente derivatizzati, di adsorbirsi sulla superficie del vetro fornendo così una matrice di rivestimento altamente idrofila cui possono essere covalentemente legate le molecole biologiche.

Si intende sviluppare nuovi polimeri acrilici, che realizzino in modo semplice un rivestimento della parete del canale di elettroforesi che sia stabile nel tempo e facilmente rinnovabile e che riduca il flusso elettrosmotico e l'interazione analita-parete, e nuovi co-polimeri di acrilamide e allil-monosaccaridi, in grado di fornire eccellente azione setacciante e bassa viscosità per la separazione dei frammenti di DNA.

In connessione allo sviluppo dei polimeri sopra detti, si intende realizzare nuovi chip di flusso CE in vetro e in vetro-silicio, progettati con caratteristiche adatte al riempimento e ricambio rapido di fasi polimeriche e all'accessibilita' ottica per le misure.

Gli sviluppi tecnologici e la strumentazione realizzata verranno sperimentati e validati nella diagnostica di alcune patologie genetiche più o meno frequenti nella popolazione quali la sordità da connessina 26 , l'emocromatosi ereditaria , il deficit di 21-idrossilasi, la beta-talassemia, la distrofia maculare di Stargardt ed alcuni disordini della coagulazione (deficit del fattore II e V). L'introduzione di microchips in laboratori diagnostici permetterà di incrementare il numero dei tests effettuati e l'efficienza diagnostica delle malattie ereditarie incluse nel presente progetto. Questo tipo di innovazione tecnologica apre nuove prospettive nel settore della prevenzione di queste patologie rendendo possibili programmi di screening su larga scala nella popolazione generale. L'utilizzo di più modelli genetici è importante da un lato per poter osservare l'applicazione con diversi tipi di mutazioni, e dall'altro per avere approcci diagnostici differenti e poter meglio valutare l'affidabilità del sistema. Alcune malattie (emocromatosi, deficit di fattore II e V, sordità da connessina 26) sono geneticamente caratterizzate da poche mutazioni frequenti, e necessitano quindi di tests semplici; mentre altre malattie (distrofia maculare di Stargardt) sono geneticamente complesse e necessitano di analisi estese su un'ampia parte del gene. E' importante quindi avere modelli genetici differenti per il disegno di microchips; in altre parole è possibile in questo modo analizzare più pazienti per poche mutazioni o pochi pazienti per un ampio spettro di mutazioni.

Per l'esecuzione dei test genetici, ovvero l'identificazione delle mutazioni presenti nei campioni sotto esame, si utilizzerà la tecnica dell'SNE (Single Nucleotide Extension). Oligoprimers sense e antisense disegnati in modo da fermarsi un base prima di quella che deve essere studiata verranno ibridati a frammenti di PCR singola elica ottenuti da DNA genomico, incubati con un set di quattro ddNTP marcati ciascuno con un fluorocromo diverso ed estesi con una DNA polimerasi. I campioni biologici così preparati verranno poi analizzati mediante elettroforesi capillare e la presenza dei diversi alleli rivelata con il sistema SPAD sopra descritto. In particolare, i soggetti omozigoti per un allele presenteranno un segnale di un unico tipo (colore) mentre agli eterozigoti corrisponderà una rivelazione con due colori. I dati ottenuti verranno confrontati con i dati gia' ottenuti su sistemi del tipo microarray in cui la reazione di SNE e' stata condotta in fase solida (ibridazione su vetrino). Inoltre questo sistema verrà confrontato con alcuni tra I più comuni sistemi di diagnostica miniaturizzata disponibili commercialmete (Affymetrix, Nanogen, etc.).

Il progetto di ricerca proposto puo' essere adeguatamente affrontato solo basandosi su una stretta integrazione interdisciplinare di varie competenze, complementari ed essenziali al fine di raggiungere gli obiettivi. Caratteristica essenziale della proposta e' infatti di costituire una retedi ricerca interdisciplinare che sostiene una attiva cooperazione tra laboratori dell'Universita', del CNR e di enti di ricerca privati dotati di competenze, know-how e attrezzature diversificate che coprono adeguatamente tutti i settori scientifico-tecnologici interessati dal progetto. Il LAMEL-CNR, Bologna, e' uno dei pochissimi laboratori di ricerca italiani dotati di attrezzature proprie per fabbricazione microelettronica in silicio ed ha in questo ampio know-how e consolidate competenze. Nello sviluppo dei nuovi rivelatori microelettronici collaborera' con il gruppo del Politecnico di Milano (POLIMI), che ha una posizione di leadership riconosciuta internazionalmente riguardo agli SPAD e consolidate competenze in microelettronica, optoelettronica e strumentazione di misura. Lo IBRM-CNR, Milano, è internazionalmente noto per sviluppi di metodiche elettroforetiche e sintesi di polimeri lineari idrofili per rivestimenti dinamici di superfici di vetro e matrici setaccianti per elettroforesi capillare di DNA e proteine. Il Centro di Studio su Metodi e Dispositivi per Radiotrasmissioni del CNR presso l'Universita' di Pisa (CNR-CSMDR) opera con il laboratorio di tecnologie microelettroniche dell'Universita', che ha attrezzature e competenze per microlavorazione del silicio e del vetro ed e' da vari anni attivo in ricerche su sensori chimici e fisici e sistemi microlettromeccanici in silicio. Per l'esecuzione dei test genetici ci si avvarà dell'esperienza dell'Istituto TIGEM di Napoli (Paolo Gasparini) in cui sono stati messi gia' a punto protocolli di mutation detection su microarray (emocromatosi e sordita') e dell'IRCCS-Ospedale "San Raffaele" di Milano (Maurizio Ferrari), il cui laboratorio ha una esperienza pluriennale nello sviluppo e validazione di tecniche molecolari per la diagnostica delle malattie genetiche. Inoltre si è recentemente dotato della Molecular Biology Workstation Nanogen per lo sviluppo di sistemi analitici completamente automatizzati basati sulla tecnologia microchip elettronici per l'identificazione e polimorfismi su larga scala, che verrà utilizzata per la validazione dei CE microchip applicati a diverse patologie genetiche quali beta-talassemia, distrofia maculare di Stargardt e disordini della coagulazione (deficit di fattore II e V).

Nel progetto e' previsto un consistente apporto di attivita' di giovani ricercatori, sia attraverso contratti sia attraverso la partecipazione di allievi di dottorato di ricerca in diversi settori e di diverse istituzioni, configurando cosi' una efficace integrazione di attivita' di ricerca e di alta formazione.<<<

Durata

36 mesi