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SCHEDA FIRB
italiano - english
Unità di Ricerca
- ISTITUTO EUROPEO DI ONCOLOGIA
DIPARTIMENTO DI ONCOLOGIA SPERIMENTALE , MILANO (MI) - ISTITUTO EUROPEO DI ONCOLOGIA
Oncologia Sperimentale , MILANO (MI) - IRBM P. ANGELETTI
Dipartimento Biochimica , ROMA (RM) - Universita' degli Studi di ROMA "La Sapienza"
Dip. ISTOLOGIA ED EMBRIOLOGIA MEDICA , ROMA (RM) - ISTITUTO "MARIO NEGRI",MILANO
Laboratorio di Biologia Molecolare , MILANO (MI) - ISTITUTO EUROPEO DI ONCOLOGIA
Dipartimento di Oncologia Sperimentale , MILANO (MI) - ISTITUTO FIRC DI ONCOLOGIA MOLECOLARE (IFOM)
Laboratorio Microarray , MILANO (MI) - ISTITUTO EUROPEO DI ONCOLOGIA
DIPARTIMENTO ONCOLOGIA SPERIMENTALE , MILANO (MI) - ISTITUTO FIRC DI ONCOLOGIA MOLECOLARE (IFOM)
Settore Bioinformatico , MILANO (MI)
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- 9 - Modelli transgenici per malattie ad eziologia complessa
- 10 - Modulazione razionale dell'attività antitumorale di farmaci "classici" tramite intervento selettivo su specifiche cascate regolatorie
Classificazione scientifico-disciplinare
- Area scientifico disciplinare: Scienze biologiche
- Area scientifico disciplinare: Scienze mediche
Classificazione brevettuale
- CHEMISTRY; METALLURGY
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES OR MICRO-ORGANISMS (immunoassay G01N33/53); COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- MICRO-ORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF (biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, containing micro-organisms, viruses, microbial fungi, enzymes, fermentates or substances produced by or extracted from micro-organisms or animal material A01N63/00; food compositions A21, A23; medicinal preparations A61K; chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings, absorbent pads or surgical articles A61L; fertilisers C05); PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICRO-ORGANISMS (preservation of living parts of humans or animals A01N1/02); MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA (micro-biological testing media C12Q)
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
Classificazione geografica
- Regione: Lombardia
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Parole Chiave
Istone deacetilasi; cromatina; cancro; invecchiamento; nuovi farmaci; trattamenti differenziativiUn approccio di Genomica Funzionale per la identificazione di istone-deacetilasi quali bersagli molecolari per lo sviluppo di nuovi farmaci
Istituto Europeo di OncologiaAbstract
I livelli di acetilazione degli istoni nelle regioni promotrici correlano con l'attivita' trascrizionale dei geni corrispondenti: livelli elevati di acetilazione si osservano nei promotori di geni trascrizionalmente attivi, mentre l'ipoacetilazione e' caratteristica dei geni silenti. Infatti, molti dei co-regolatori trascrizionali noti possiedono attivita' istone acetiltransferasica (HAT) o istone deacetilasica (HDAC).Le HDAC sono state implicate nella patogenesi dei tumori e nel processo d'invecchiamento. La prima dimostrazione del ruolo diretto delle HDAC nel cancro e' venuta dallo studio della funzione della proteina di fusione PML-RAR nella leucemia acuta promielocitica (LAP). E' stato infatti dimostrato che il potenziale leuchemogenico di PML-RAR dipende dalla sua capacita' di reclutare HDAC ai promotori bersaglio. Il trattamento di blasti LAP (nonche' di pazienti) con Acido Retinoico (il ligando naturale di RAR) induce il rilascio del complesso PML-RAR-HDAC, la conversione di PML-RAR in attivatore trascrizionale e l'induzione del differenziamento dei blasti (con remissione clinica dei pazienti). Molteplici evidenze indicano un ruolo cruciale delle HDAC anche nei piu' comuni tumori solidi. Infatti: i) i geni oncosoppressori sono spesso inattivati in cellule tumorali attraverso un meccanismo di metilazione del DNA (che porta a repressione trascrizionale attraverso reclutamento di HDAC); ii) la cromatina e' globalmente ipoacetilata nei tumori epiteliali; iii) inibitori dell'attivita' HDAC hanno proprieta' anti-tumorali in vitro. Per quanto riguarda il ruolo delle HDAC nell'invecchiamento, studi recenti hanno dimostrato che la sovraespressione di specifiche HDAC (Sir2) risulta in aumento della durata della vita in lievito e C.Elegans. Nei mammiferi, l'omologo di sir2 regola negativamente p53, la cui attivita' e' anche soppressa in un ceppo mutante di topi iperlongevi (p66Shc-/-).
Lo scopo di questa proposta di ricerca e' di definire il ruolo delle HDAC nella patogenesi dei tumori e nell'invecchiamento, e di identificare specifiche HDAC coinvolte in questi processi. L'obiettivo a lungo termine e' l'utilizzo delle HDAC come bersagli molecolari per lo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento dei tumori e/o delle malattie associate all'invecchiamento.
Il piano sperimentale di questo progetto si basa su una piattaforma di genomica funzionale che comprende: i) l'identificazione di tutte le HDAC umane (o di regolatori delle HDAC) mediante ricerca di banche dati publiche e private (bioinformatica) e analisi di molteplici complessi HDAC (proteomica); ii) l'analisi sistematica di tutte le HDAC identificate mediante un numero limitato di saggi biologici e biochimici. Questi esperimenti consentiranno l'assegnazione preliminare di livelli di priorita' nell'identificazione di HDAC coinvolte nella tumorigenesi e nell'invecchiamento. La priorita' verra' data alle HDAC che presentano: i) aumentata espressione in tumori; ii) capacita' di indurre ipoacetilazione cromatinica globale dopo sovraespressione in cellule in coltura; iii) ruolo nella proliferazione o sopravvivenza cellulare; iv) regolazione da parte di E2F o p53; v) espressione regolata durante l'invecchiamento, vi) capacita' di modificare la risposta cellulare allo stress ossidativo dopo sovraespressione o inattivazione funzionale. Successivamente, le HDAC scelte verranno validate studiando direttamente il loro ruolo nella trasformazione e nell'invecchiamento in modelli animali. Le HDAC validate saranno caratterizzate per struttura (cristallografia e NMR) e i dati risultanti saranno utilizzati per disegnare nuovi inibitori delle HDAC. In uno sforzo parallelo, tenteremo di valutare la efficacia terapeutica di inibitori delle HDAC (da soli o in combinazione con altri farmaci) e agenti demetilanti su blasti di pazienti leucemici e disegneremo protocolli di differenziamento per trials clinici. <<<
Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
PIER GIUSEPPE PELICCI, ISTITUTO EUROPEO DI ONCOLOGIAObiettivo del Finanziamento
L'obiettivo a medio termine di questo progetto è di fornire nuovi, convalidati bersagli di tumori e di malattie associate all'età. L'approccio sperimentale prevede la definizione del ruolo delle HDACs nella patogenesi dei tumori e nell'invecchiamento e, piu' in dettaglio, l'identificazione di specifiche HDAC o di regolatori dell'attività HDAC coinvolti in questi processi. L'obiettivo a lungo termine è la scoperta di inibitori di HDAC che possano risultare utili nel trattamento di tumori umani e/o in malattie associate all'invecchiamento.Organizzazione generale del progetto.
L'idea generale di questo progetto è evidenziata nello schema riportato sotto, che indica le fasi principali del Progetto e la sua distribuzione in WorkPackages. Progettiamo di identificare tutte le HDAC umane, mediante ricerca in banche dati di sequenza pubbliche e private. Uno screening preliminare di banche dati private (Celera) ha indicato una dimensione della famiglia delle HDAC umane di almeno 30 membri e alcune di esse sono nuove HDAC (e.g. non presenti in domini pubblici). Progettiamo di identificare tutte le HDAC umane mediante approcci bioinformatici e biochimici, e di selezionare una frazione di esse per ulteriore investigazione. Sarà data priorita' alle nuove HDAC, per aumentare la probabilità di ottenere informazioni brevettabili. Selezionate HDAC saranno ulteriormente caratterizzate mediante una serie di saggi biologici e biochimici (high throughput screening). Una particolare enfasi sarà data ai saggi che permetteranno di determinare i loro effetti sulla crescita e sopravvivenza cellulare, sulla regolazione di fattori la cui attività è collegata alla crescita e alla sopravvivenza, sull'espressione in campioni tumorali e in correlazione con i processi di invecchiamento. Un limitato numero di HDAC o regolatori delle HDAC (da ora in poi designati come HDAC selezionate) saranno ulteriormente validati biologicamente e saranno prioritari per la caratterizzazione biochimica delle loro attività enzimatiche e per studi strutturali (cristallografia a raggi X e Risonanza Magnetica Nucleare) con lo scopo di creare un razionale per il disegno di farmaci. Le HDAC-selezionate saranno caratterizzate mediante: i) studi del profilo di espressione genica globale, per identificare tutti i bersagli delle HDAC; ii) un approccio scientifico piu' tradizionale (in opposizione all'approccio high throughput), includente la generazione di animali knock-out per identificare la rilevanza delle HDAC selezionate nella determinazione del fenotipo neoplastico e nei processi di senescenza. In questo contesto, la comprensione delle funzioni fisiologiche delle HDAC selezionate è un criterio cruciale di priorità per il disegno di inibitori/modulatori di appropriati bersagli biologici. Tali informazioni saranno anche finalizzate a stabilire modelli di trattamento basati sulla combinazione di inibitori HDAC con agenti cito-tossici e cito-differenzianti già disponibili, per investigare eventuali sinergie e per gettare le basi per il disegno di protocolli per la terapia dei tumori.
La seguente e' una lista di tutte le attivita' incluse in questo progetto e, per ciascuna, i risultati attesi.
1. Identificazione delle HDAC umane e dei regolatori delle HDAC
1.1. Ricerca bioinformatica delle HDAC e dei regolatori delle HDAC.
- Ricerca di HDAC e regolatori di HDAC: analisi di banche dati genomiche.
Risultati attesi: identificazione in silico di nuove HDAC e regolatori di HDAC.
- Ricerca di HDAC e regolatori di HDAC: analisi di banche dati di EST/cDNA.
Risultati attesi: identificazione in silico di nuove HDAC e regolatori di HDAC.
- Ricerca di HDAC e regolatori di HDAC sulla base della ricerca di domini funzionali.
Risultati attesi: identificazione in silico di nuove HDAC e regolatori di HDAC, o di proteine aventi in comune domini o motif funzionali con HDAC e regolatori di HDAC.
- Classificazione e consultazione delle informazioni disponibili: "data mining", ed archiviazione.
Risultati attesi: generazione di strumenti software che possano automatizzare la consultazione di database locali o disponibili su internet. Disegno di database (PostgreSQL o MySQL) relazionali centralizzati per la raccolta, consultazione ed organizzazione di tutte le informazioni concernenti il Progetto.
- Predizione di interazione proteina-proteina.
Risultati attesi: Predizione di nuovi interattori di HDAC e regolatori di HDAC.
- Analisi filogenetica e predizione di proteine HDAC e coregolatori di HDAC.
Risultati attesi: Identificazione di nuove HDAC/regolatori di HDAC, o di geni funzionalmente correlati, in specie differenti (dal batterio all'uomo).
- Analisi dei promotori.
Risultati attesi: Identificazione di circuiti di regolazione coinvolti nella regolazione di geni bersaglio di specifiche HDAC.
- Generazione di sequenze "full-length".
Risultati attesi: Acquisizione in silico e sperimentale dei cDNA "full length" di tutte le HDAC e regolatori di HDAC identificati. Produzione di vettori di espressione per successivi studi funzionali. Produzione di anticorpi per HDAC e regolatori di HDAC.
1.2. Identificazione dei regolatori delle HDAC attraverso la risoluzione dei complessi .
- Caratterizzazione dei complessi di MTA-1 e Sirt-1.
Risultati attesi: Identificazione di proteine presenti nei complessi di MTA-1 e di Sirt-1.
- Identificazione e caratterizzazione di proteine in grado di interagire con HDAC : approccio con HDAC ricombinanti, o isolamento di complessi contenenti HDAC endogene.
Risultati attesi: Identificazione di un numero e di un tipo imprecisato di proteine interagenti con membri prototipici delle HDAC di classe I, II, III. Validazione dell'interazione. Identificazione di nuovi bersagli proteici di rilevanza farmacologica.
- Identificazione di nuovi bersagli molecolari di rilevanza per l'attività farmacologica e la tossicità degli inibitori di HDAC.
Risultati attesi: Identificazione di un numero e di un tipo imprecisato di proteine interagenti con uno o piu' tipi di inibitori di HDAC. Validazione dell'interazione. Identificazione di nuovi bersagli proteici di rilevanza farmacologica o tossicologica per gli inibitori di HDAC.
2. Selezione di HDAC coinvolte nei processi tumorali e/o dell'invecchiamento.
- Espressione delle varie HDAC e regolatori di HDAC nel tessuto neoplastico di tumori solidi
Risultati attesi: Preselezione delle HDAC sovraespresse nei campioni tumorali. Pattern di espressione delle singole HDAC nel tessuto normale.
- Effetto di HDAC o di regolatori di HDAC sul fenomeno di ipo-acetilazione globale degli istoni
Risultati attesi: Identificazione delle singole HDAC o regolatori di HDAC che inducono ipoacetilazione globale della cromatina dopo sovraespressione in cellule normali.
- Regolazione di HDAC o di regolatori HDAC da parte di E2F e p53
Risultati attesi: Identificazione di HDAC o regolatori di HDAC la cui espressione è regolata da p53 o E2F.
- Acetilazione della cromatina ed espressione delle diverse HDAC e regolatori di HDAC durante il processo di invecchiamento
Risultati attesi: Informazioni concernenti: i) i livelli di acetilazione degli istoni durante lo sviluppo e nella vita adulta nei vari tessuti; ii) l'espressione delle HDACs e dei regolatori delle HDACs durante lo sviluppo e nella vita adulta nei vari tessuti; iii) eventuale correlazione, in tessuti o organi specifici, fra i livelli di acetilazione degli istoni e l'espressione delle HDACs e dei regolatori delle HDACs.
3. Validazione biologica delle HDAC prioritarie utilizzando modelli sperimentali e cellulari selezionati.
- Generazione di strumenti per la sovraespressione, o l'inattivazione funzionale di HDAC o regolatori di HDAC.
Risultati attesi: generazione di strumenti (vettori, oligonucleotidi per RNAi) per la sovraespressione, o l'inattivazione funzionale di HDAC/regolatori di HDAC selezionati. Generazione di tipi cellulari contenenti le varie HDACs precedentemente isolate e i regolatori delle HDCAs.
- Messa a punto di protocolli standardizzati per l'isolamento e la coltivazione a lungo termine di cellule epiteliali normali e tumorali di mammella da campioni chirurgici.
Risultati attesi: Isolamento, purificazione e coltura a lungo termine di cellule epiteliali mammarie primarie normali e neoplastiche da campioni chirurgici, e di linee cellulari epiteliali mammarie immortalizzate e/o trasformate in condizioni di coltura altamente standardizzate.
- Sovraespressione o inattivazione funzionale di selezionati regolatori di HDACs/HDAC in cellule primarie.
Risultati attesi: Ruolo dei regolatori di HDACs/HDAC in relazione ad eventi cellulari quali la proliferazione, la differenziazione, la risposta allo stress e l'insorgenza del fenotipo tumorale.
- Ruolo delle varie HDACs nella regolazione del promotore di p21.
Risultati attesi: Identificazione di sottotipi di HDAC coinvolti nella proliferazione cellulare.
- Identificazione di geni bersaglio di HDAC (mediante uso di inibitori specifici di HDAC).
Risultati attesi: Identificazione di geni la cui espressione e' sostenuto da livelli basali di attivita' HDAC.
Identificazione di geni bersaglio di HDAC (mediante l'uso di linee cellulari geneticamente modificate).
Risultati attesi: Identificazione di tutti I geni la cui espressione e' regolata da HDAC o da molecole regolatrici di HDAC.
- Ruolo delle varie HDACs e regolatori delle HDACs nella risposta cellulare allo stress ossidativo
Risultati attesi: Identificazione di tutte le HDACs e i regolatori delle HDCAs coinvolti nella regolazione di p53 e nelle altre risposte cellulari allo stress ossidativo.
- Valutazione del ruolo di HDAC e regolatori di HDAC nella integrazione del DNA mitocondriale nel genoma nucleare .
Risultati attesi: Frequenza di integrazioni di DNA mitocondriale nel genoma nucleare in funzione dell'espressione di HDAC.
- Produzione di topi knock-out.
Risultati attesi: Ci aspettiamo di ottenere da banche disponibili o di generare in casa numerosi topi che portano mutazioni omozigoti di selezionate HDAC o di regolatori HDAC. Questi topi saranno utilizzati per investigare la funzione fisiologica di HDAC o regolatori di HDAC prioritari e (mediante incroci con i modelli murini di tumori/senescenza disponibili) di determinare la relazione tra HDAC/regolatori di HDAC con i già noti meccanismi di regolazione della crescita cellulare e della senescenza.
4. Caratterizzazione strutturale delle HDAC validate e disegno di nuovi inibitori delle HDAC
- Espressione in Baculovirus di selezionate HDAC o regolatori di HDAC.
Risultati attesi: Produzione di milligrammi di HDAC purificate ed enzimaticamente attive.
- Saggi enzimatici su HDAC purificate.
Risultati attesi: Messa a punto di un saggio di attività per HDAC usando peptidi sintetici. Determinazione della substrato-specificità di HDAC sotto esame. Analisi del meccansimo catalitico di HDAC mediante tecniche di miscelazione rapida.
- Inibizione di HDAC da parte di GAM-1.
Risultati attesi: Comprensione dei meccanismi molecolari alla base della inibizione della attivita' HDAC da parte di GAM-1.
- Espressione in batteri o baculovirus e purificazione di domini selettivi di HDAC.
Risultati attesi: Espressione ricombinante, purificazione e caratterizzazione biochimica-biofisica di 4-5 domini catalitici delle HDAC.
- Cristallizzazione e determinazione della struttura di domini catalitici selettivi o selezionati di HDAC.
Risultati attesi: Cristallizzazione e determinazione della struttura di al meno 2-3 domini di interesse, preferibilmente in presenza di Sodio n-butirrato, Tricostatina o Trapoxin A.
- Identificazione di composti base (lead compounds) per lo sviluppo di farmaci.
Risultati attesi: Costruzione di librerie combinatoriali basate sulla struttura di 2 o piu' strutture di HDAC.
5. Valutazione dell'efficacia degli inibitori delle HDAC (proof-of-principle)
- Effetti biologici di HDACi (butirrati, TSA, VPA) e di agenti demetilanti in blasti da pazienti AML e sindromi mielodisplastiche .
Risultati attesi: Determinazione di: i) efficacia dei trattamenti con RA/HDACi/5-azacitidina, ii) frequenza di casi responsivi; iii) grado di differenziamento; iv) correlazione con le caratteristiche dei diversi sottotipi leucemici (maturazione fenotipica di cellule leucemiche e/o presenza di proteine di fusione) v) razionale per il disegno di protocolli differenziativi che prevedano l'utilizzazione di variabili combinazioni di agenti per i diversi sottotipi AML e MDS.
- Identificazione di promotori e geni bersaglio coinvolti nel differenziamento mieloide normale e patologico.
Risultati attesi: Caratterizzazione dei meccanismi molecolari alla base del blocco differenziativo indotto da aberrante attività HDAC in AML e MDS. Identificazione di geni riattivati in modo specifico durante il differenziamento mielode in blasti leucemici. Ruolo delle proteine di fusione in tali eventi.
- Nuove combinazioni tra inibitori delle HDAC ed altri agenti cito-tossici e cito-differenzianti
Risultati attesi: Identificazione di combinazioni innovative e clinicamente utili tra inibitori delle HDAC ed agenti cito-tossici. Identificazione di combinazioni innovative e clinicamente utili tra inibitori delle HDAC ed agenti cito-differenzianti.
Informazioni riguardanti le interazioni molecolari tra inibitori delle HDAC ed agenti cito-tossici e/o cito-differenzianti.<<<
