RICERCA ITALIANA     

Geni murini, fenotipi e malattie umane - MousePHD

Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)

Abstract

Il progetto si basa sullo sviluppo e l'applicazione delle tecnologie di ‘gene-targeting' per la produzione di ceppi mutanti costitutivi e condizionali di topo, modelli di malattie umane. L' applicazione di metodi standard per la caratterizzazione fenotipica dei ceppi mutanti modello prodotti, costituisce la base per lo studio delle relazioni tra geni specifici e corrispondenti patologie. Tali ceppi possono essere inoltre utilizzati per lo studio in vivo di meccanismi di base dell'espressione genica, precedentemente analizzati in vitro. Vengono progettate e prodotte specifiche risorse bioinformatiche (banche dati e portali web) dedicate alla descrizione genotipica e fenotipica dei ceppi mutanti, mentre collaborazioni ad hoc consentono l'archiviazione, la criopreservazione e la distribuzione dei ceppi mutanti. Specifiche attività di formazione sono realizzate al fine di una più ampia comunità di esperti nel ‘gene-targeting' nel topo, nella analisi fenotipica dei mutanti e nella fisiologia, patologia e farmacologia molecolare. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

GLAUCO TOCCHINI-VALENTINI, Consiglio nazionale delle ricerche (CNR)

Obiettivo del Finanziamento

L'obiettivo del WP1 (UR TOCCHINI-VALENTINI) consiste nel coordinamento gestionale ed amministrativo della rete operativa del presente progetto, comprendente le interazioni con e tra le diverse UR partecipanti e con i gruppi di EMBL Mouse Biology Programme e Center for Blood Research-Boston a Monterotondo, ed i rapporti con il committente (MIUR) e le altre Istituzioni nazionali ed internazionali pertinenti al progetto, con particolare riguardo alle interazioni con il network EMMA.

Nell'ambito del WP2 la UR TOCCHINI-VALENTINI ha come obiettivi: produzione e allevamento di mutanti di topo, modelli del parkinsonismo e di altre malattie neurodegenerative, mediante inattivazione condizionale nel cervello in toto ed in regioni specifiche del cervello di specifici geni codificanti recettori peptidergici e recettori orfani, accoppiati a G-proteine (GPCR), quali i recettori del tipo GPR37; analisi fisiologiche e comportamentali dei mutanti di topo ed analisi comparativa dei profili di espressione genica di organi e tessuti cerebrali di topi mutanti e wild-type di controllo, la definizione di geni, con alterata trascrizione e regolazione, codificanti specifici neuropeptidi, recettori, e altri componenti della catena di trasduzione del segnale, potenziali bersagli molecolari da poter essere utilizzati per lo sviluppo di farmaci innovativi e nuove modalita' terapeutiche per il trattamento parkinsonismo e di altre malattie neurodegenerative.

L'obiettivo della UR BERTUZZI nell'ambito del WP2 e' lo studio dello sviluppo del sistema visivo nei vertebrati ed alla funzione di una nuova classe di geni chiamati Vax, un acronimo di "ventral anterior homeobox". Il fine e' capire i meccanismi e l'identita' del network genetico controllato dai geni Vax. A questo scopo saranno utilizzate due tecniche, lo ‘yeast two hybrid system' di lievito e lo ‘screening' a livello di proteoma. L'altro scopo della ricerca consiste nella generazione di un KO condizionale, in cui il gene Vax1 viene inattivato esclusivamente nelle cellule gliali del nervo ottico, mediante prevede l'utilizzo del sistema cre-lox, che e' il sistema piu' sperimentato per la generazione di topi mutati in modo condizionale, cioe' topi in cui l'attivita' del gene interessato viene eliminata solo in alcuni tessuti in cui il gene e' normalmente espresso.

Gli obiettivi del WP3 (UR BARALLE) consistono nella produzione e caratterizzazione fenotipica e funzionale dei seguenti modelli mutanti:
1. Modello murino per lo studio delle forme monosintomatiche di CF. Rimpiazzeremo l'esone 9 e le regioni introniche prossimali del gene CFTR murino con le sequenze umane corrispondenti contenenti l'esone 9 ed il tratto polimorfico (TG)nTm nell'introne 8. Questa regione sarà affiancata da sequenze lox per studiare le conseguenze dello splicing alternativo dell'esone 9 modulandone l'esclusione dall'mRNA in maniera tessuto-specifica. Inoltre, il modello murino potrà essere utilizzato per valutare l'efficacia dell'inibizione dell'espressione di TDP-43 ai fini di sviluppare un possibile approccio teraputico nei casi di forme monosintomatiche di CF.
2. Modello murino per lo studio del difetto di splicing del gene ATM: Rimpiazzaremo le sequenze dell'introne 20 del gene ATM murino con il frammento del gene ATM umano che contiene le sequenze considerate importanti per l'attivazione dell'esone criptico. Inseriremo sequenze lox al fine di produrre ceppi murini differenti per regolare l'inclusione dell'esone criptico nella proteina ATM in forma tessuto specifica. Il modello murino ci consentirà di studiare in vivo questo nuovo meccanismo di splicing e di valutare la possibilità di ripristinare il fenotipo wild-type attraverso l'espressione di una forma di snRNP U1 mutante che complementi la mutazione dell'ISPE.
3. Modello murino per lo studio dello splicing alterato nel gene CBS e la patogenesi dell'omocistinuria: Rimpiazzeremo le sequenze del gene CBS murino che includono la regione genomica a cavallo della giunzione tra introne 7/esone 8 con il frammento genomico umano con l'inserzione di 68bp. Questo modello animale ci consentirà di caratterizzare in vivo i meccanismi di "splicing enhancing" mediati dalle sequenze G4 ed inoltre potrà essere utilizzato, attraverso un sistema Cre-lox adeguato, per lo chiarire il ruolo dell'omocistinuria nella patogenesi delle malattie cardiovascolari.

Gli obiettivi del WP4 per la UR GRANUCCI comprendono lo studio dei meccanismi molecolari delle risposte dell'ospite alle infezioni microbiche, che è essenziale per prevenire malattie e danni tissutali come risultato di risposte infiammatorie e autoimmuni. Sarà studiato in particolare il ruolo dell'IL-2 prodotta dalle DC nel regolare le risposte delle cellule T e NK. A questo proposito, animali deficienti per la produzione di IL-2 esclusivamente a livello delle DC saranno prodotti mediante la tecnica del gene targeting condizionale. La capacità delle DC IL-2-/- di attivare risposte T in vivo sarà saggiata e comparata alle DC wild type. Per fare questo si valuterà la capacità di tali cellule di attivare linfociti T transgenici per un TCR che riconosce un peptide ‘self' in seguito ad infezioni con virus o batteri che presentano antigeni cross-riconosciuti dai linfociti T transgenici.
Sempre nell'ambito del WP4 la UR GARLANDA avrà come obiettivo principale lo studio di meccanismi dell'immunità innata, utilizzando tecniche molecolari per l'identificazione e la caratterizzazione di nuove molecole. In particolare verranno generati animali geneticamente modificati per un recettore per chemochine tuttora orfano che potrebbe avere una funzione decoy. Tale recettore è caratterizzato da un pattern peculiare di espressione in cellule dell'immunità innata, in particolare in monociti e in cellule dendritiche. Saranno studiati anche due recettori appartenenti alla superfamiglia dei recettori di IL-1: a) un recettore orfano con caratteristiche uniche e peculiari appartenente alla superfamiglia, provvisoriamente chiamato TIR8, il cui pattern di espressione suggerisce la possibilità di un suo coinvolgimento nella fisiopatologia di organi specifici. b) il recettore di tipo II di IL-1 (IL-1RII), per il quale il gruppo ha per primo ipotizzato una funzione di decoy. Le ipotesi circa la funzione della pentraxina PTX3 verranno studiate utilizzando reagenti originali e anche utilizzando animali knock-out per PTX3. Infine, verranno estesi questi studi a nuovi membri della famiglia delle pentraxine lunghe espressi in cellule dell'immunità innata.

Nell'ambito del WP5 la UR COCEANI avra' come obiettivi principali:
la definizione del contributo di vari agenti ai normali mutamenti del circolo polmonare nel periodo perinatale, nonché agli adattamenti dello stesso in caso di ipossia. e l'accertamento del grado di importanza di diversi meccanismi vasoregolatori sia nel mantenimento delle pervietà del dotto arterioso che nella chiusura dello stesso alla nascita. Queste conoscenze potranno facilitare la messa a punto di migliori strategie terapeutiche nel trattamento di neonati con ipertensione polmonare. Nuovi dati saranno anche ottenuti sulla funzione del sensore per l'ossigeno. Queste conoscenze potranno facilitare la messa a punto di migliori strategie terapeutiche nel trattamento di neonati con malformazioni cardiache congenite dotto-dipendenti ovvero di prematuri con dotto pervio.

Obiettivo principale della UR LEVI nel WP6 sarà comprendere la funzione e la regolazione di geni coinvolti nel controllo del differenziamento osseo grazie a tecniche di inattivazione genica in vivo.La presisposizione a molte malattie dell' osso come l'osteoporosi dipende una forte componente genetica individuale.
Anche se alcuni dei geni importanti per il controllo dello sviluppo osseo sono noti, quelli importanti per la patofisiologia dell'osteoporosi restano ancora da scoprire. L'analisi genetica della malattia nell'uomo non è semplice in quanto richiede una documentazione dettagliata di famiglie ad alto rischio che è raramente disponibile. Lo sviluppo di modelli animali che riflettano aspetti morfologici e/o molecolari della malattia è prerequisito essenziale per identificare i geni all'origine dell'osteoporosi nell'uomo. In questo rispetto il topo costituisce il modello animale migliore per l'analisi di lesioni genetiche nei mammiferi.
L'Unità di Ricerca IST/MMOL ha sviluppato negli ultimi anni una radicata esperienza nella generazione di modelli murini di malattie dell'osso. Nell'ambito di questo programma intendiamo generare ed analizzare alcuni nuovi modelli in cui geni chiave per il differenziamento osseo quali Cbfa1 abbiano subito una "mutazione condizionale" cioè una mutazione attivabile solo in certi tessuti e/o solo in momenti specifici della vita. Questo permetterà di comprendere i meccanismi di regolazione tardiva dell'osteogenesi e dell'omeostasi ossea.

Gli obiettivi del WP7 (UR TOCCHINI-VALENTINI) sono la creazione del sito web del progetto MousePHD e la produzione di risorse informatiche (banche dati e portali web) che permettano l'accesso sia interno sia alla comunità scientifica e al pubblico, alle informazioni sui fenotipi e le applicazioni medico/farmacologiche dei ceppi mutanti di topo modelli delle malattie umane. Verranno inoltre svolte attività di formazione con programmi e corsi periodici, teorici e pratici, rivolti a giovani membri delle UR e a ricercatori e tecnici esterni<<<

Durata

36 mesi