RICERCA ITALIANA     

FOLDING E AGGREGAZIONE DI PROTEINE: METALLI E BIOMOLECOLE NELLE MALATTIE CONFORMAZIONALI

Università degli Studi di Catania

Abstract

In questo progetto verrà studiata la competizione esistente tra il folding e l'aggregazione delle proteine per mezzo di un approccio multidisciplinare che coinvolge aspetti chimici, biochimici, di biologia molecolare, di biofisica e farmacologici. Nel fare questo tecniche sperimentali sono utilizzate insieme a metodi teorici di simulazioni molecolari per la interpretazione dei risultati. L'uso di appropriati modelli in vivo e in vitro ci aiuterà a comprendere quali aspetti molecolari possono essere di rilevanza biologica nel controllare il folding delle proteine e/o la loro aggregazione. Questo non soltanto contribuisce ad accrescere le nostre conoscenze circa i fattori intrinseci e ambientali coinvolti nella regolazione del folding delle proteine, ma anche a comprendere l'origine di processi potenzialmente dannosi che sono causa di patologie a lento decorso e invalidanti facilitando lo sviluppo di trattamenti che riducano il loro stato patologico, ritardandone il loro insorgere o bloccando la loro progressione. L'esperienza dei partecipanti include la chimica dei peptidi e delle proteine nonché aspetti di biologia molecolare e della cellula. I singoli gruppi hanno nel passato condiviso molti progetti lavorando insieme come documentato da numerosi lavori pubblicati negli ultimi anni, dando luogo ad una rete di ricerca interdisciplinare.
Sono state individuate 5 diverse attività:

1. Folding di proteine e aggregazione
2. Fattori ambientali che influenzano il folding di proteine
3. Stress ossidativi nel folding proteico
4. Stati conformazionali e tossicità in vitro e in vivo.
5. Controllo della integrità conformazionale per mezzo di molecole esogene ed endogene.

I processi elementari come la formazione di strutture secondarie, di loop, ed il collasso della catena polipeptidica saranno investigati con particolare attenzione ai fattori ambientali che possono influenzare questi processi. Saranno adottati modelli semplificati per interpretare i risultati e delineare la chimica che accompagna questi processi. Ci si aspetta che risultati sperimentali ed i modelli teorici forniscano gli elementi chiave per avere un quadro dettagliato della sequenza di eventi che porta una catena polipeptidica ad assumere la conformazione nativa. Sistemi di colture cellulari saranno anche utilizzati per modellare le condizioni ambientali in cui può avvenire l'aggregazione proteica. Gli esperimenti saranno condotti prendendo in considerazione la diversa sensibilità delle cellule alle diverse proteine responsabili delle malattie conformazionali (PCD) e le sinergie negative che si innescano tra il misfolding proteico ed alcune condizioni specifiche delle patologie, (ad esempio l'alterata omeostasi dei metalli, disfunzioni mitocondriali, e citotossicità da glutammato). Ci si attende dei risultati che forniscano dettagli su come la degenerazione cellulare sia legata alla natura ed alla grandezza degli aggregati proteici. Modelli di animali transgenici sia di Alzheimer che di Sclerosi Laterale Amiotrofica saranno utilizzati per esplorare la dinamica dell' aggregazione proteica endogena, in particolare modificando la concentrazione di metalli. Saranno sviluppati nuovi approcci farmacologici indirizzati a limitare il misfolding proteico ed a prevenire la degenerazione cellulare. Molecole candidate promosse dai test chimici saranno provate sia in colture cellulari che in modelli animali per identificare agenti di interesse terapeutico. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Enrico RIZZARELLI, Universita' degli Studi di CATANIA

Obiettivo del Finanziamento

Il seguente progetto ha permesso di costituire un gruppo composto da chimici con differenti specializzazioni, biochimici, farmacologi e medici, con il comune obiettivo di studiare un argomento di elevata rilevanza scientifica e di grande impatto sociale. Inoltre consentirà a giovani laureati e studenti di dottorato, di compiere ricerche scientifiche ad alto livello mediante l'istituzione di corsi di dottorato internazionali e la collaborazione con istituti di ricerca privati e industrie come Whyeth-Lederle, Serono e Tecnogen. Un esempio di questa collaborazione è fornito dal corso di dottorato in Neurobiologia dell'Università di Catania, già attivato e finanziato dal MIUR. L'attività scientifica proposta è rivolta alla caratterizzazione dei meccanismi molecolari del folding/misfolding delle proteine, utilizzando una molteplicità di metodologie biochimiche, chimico-fisiche e biologiche, in accordo con un tipo di approccio multidisciplinare per la risoluzione di uno specifico problema. Lo scopo principale della ricerca è quello di capire in dettaglio come le interazioni tra residui amminoacidici appartenenti ad una data catena polipeptidica, e fattori esterni come molecole chaperone, metalli, membrane e pH, possano controllare cineticamente e termodinamicamente il folding delle proteine. E' essenziale investigare le differenti interazioni che avvengono tra i gruppi coinvolti nei processi di legame e verificare gli effetti di queste reazioni sulla cooperatività e la dinamica delle proteine, allo scopo di ottenere una comprensione esaustiva del riconoscimento molecolare e quindi la progettazione razionale ed efficiente dei leganti sia per scopi terapeutici che biotecnologici. Infatti la comprensione delle leggi che governano il riconoscimento molecolare è di importanza cruciale per la progettazione razionale dei farmaci. I sistemi specifici presi in esame dai nostri laboratori sono: beta amiloide, alfa-sinucleina, prione, amilina, insieme con altre proteine modello e frammenti peptidici ad essi correlati. Gli obiettivi specifici delle differenti attività, perseguiti utilizzando metodi chimico-fisici, colture cellulari, cavie animali e materiali clinici, sono riassunte di seguito:

1) Studio del folding delle proteine e dei loro processi di aggregazione.
Lo scopo è quello di contribuire alla risoluzione del difficile problema del folding delle proteine. L’identificazione e quantificazione delle proteine amiloidogeniche misfolded, come potenziali marker biologici, potrebbe permettere la diagnosi precoce di malattie neurodegenerative (es. AD e PD). Lo studio del percorso di refolding di proteine mutate può contribuire ad evidenziare le basi molecolari della malattia. E' stato pianificato di ottenere sufficienti quantità di proteine ricombinanti WT e mutate, così come loro frammenti per poter effettuare uno studio dettagliato dei loro aspetti strutturali.

2) Valutazione dei fattori esterni che condizionano il folding delle proteine.
Lo scopo è quello di studiare il ruolo svolto dagli ioni metallici, membrane, altre proteine e variazioni di pH, nei processi di misfolding delle proteine amiloidogeniche, e quale rilevanza possa avere da un punto di vista biologico.

3) Determinare il ruolo dello stress ossidativo nei processi di degradazione e aggregazione delle proteine.
Lo studio dei frammenti proteici originati dagli agenti ossidativi (ROS), può chiarire l'attività protettiva svolta da nuovi bioconiugati in grado di complessare ioni metallici e di svolgere una attività antiossidante. Inoltre questi studi potranno permettere di ricercare quale sia il ruolo svolto, nei processi di aggregazione delle proteine amiloidi, dai complessi delle proteine con gli ioni metallici che si accumulano durante l’invecchiamento. In questa ottica verrà sviluppato un modello cellulare per studiare il processo di invecchiamento e la sua correlazione con i processi neurodegenerativi.


4) L'effetto degli stati conformazionali sulla tossicità in vitro ed in vivo.
Lo scopo è quello di stabilire se la formazione di complessi tra gli ioni metallici e le proteine possa indurre il misfolding, l'aggregazione e la morte dei neuroni, in colture cellulari ed in cavie animali. Lo studio di modelli cellulari con una espressione alterata delle proteine implicate nel metabolismo del ferro, potrebbe fornire significative evidenze sul ruolo del metallo nella tossicità e nei processi neurodegenerativi, e cosa ancora più importante di esaminare in dettaglio le proteine coinvolte nei differenti stadi coinvolti nella della citoprotezione. Determinati i fattori in grado di indurre variazioni conformazionali, è possibile stabilire una relazione tra tali fattori e la tossicità cellulare. In particolare, ci aspettiamo di poter chiarire il ruolo del metallo e/o AGE nell'indurre il misfolding proteico nella degenerazione cellulare e di chiarire se la tossicità di specie proteiche aggregate segue un meccanismo comune anche in differenti tipi di cellule. Relativamente alla malattia di AD, gli esperimenti da effettuare sui topi 3XTG-AD forniranno una migliore comprensione del ciclo vizioso per il quale l'aggregazione della proteina beta-amiloide potrebbe innescare lo stress ossidativi inibire il riassorbimento del glutammato aumentare la concentrazione di ioni calcio e zinco nel citosol e nei mitocondri, ed inoltre promuovere la propria aggregazione in quelle condizioni sperimentali che mimano i processi degenerativi che avvengono in vivo. In relazione all'argomento ALS, gli esperimenti proposti da effettuare sui topi transgenici SOD1G93A, contribuiranno a chiarire il ruolo degli ioni metallici Cu e Zn sui meccanismi implicati nella formazione degli aggregati proteici nei motoneuroni. Variando la concentrazione di questi ioni, ci aspettiamo di interferire con la tossicità della SOD1 mutata nei topi transeginici che la esprimono. Complessivamente i risultati ottenuti contribuiranno a comprendere meglio gli effetti micro-ambientali sul misfolding delle proteine, e quindi a verificare le attuali ipotesi sui meccanismi patogenici delle PCD. Saranno controllate le differenze nei recettori del glutammato nelle colture neuronali 3XGT-AD e campioni cerebrali, mediante Ca e Zn imaging. Gli effetti del Ca e dello Zn sulla funzione mitocondriale saranno studiati tramite sonde fluorescenti e registrazioni elettrofisiologiche nei mitoplasti. Inoltre verrà testata la resistenza delle colture cellulari ottenute dai topi 3XGT-AD, alla neurotossicità indotta dal glutammato (e dal Ca e/o Zn). In questo modo ci proponiamo di comprendere il ciclo continuo di autoproduzione dei ROS, il rilascio di glutammato, la sovrastimolazione dei recettori del glutammato e la disfunzione nella omeostasi dei cationi, che portano alla aggregazione del beta-amiloide ed alla morte neuronale.Utilizzando sia colture cellulari che campioni di cervello, speriamo di colmare la differenza esistente tra i risultati ottenuti in vivo e in vitro, e di identificare i fattori chiave che contribuiscono allo sviluppo dell’ AD e di altre malattie neurodegenerative. Infine ci aspettiamo di evidenziare il ruolo benefico della modulazione farmacologia dei livelli di Ca e Zn, nella protezione dei danni neuronali e nella formazione dei depositi di aggregati beta-amiloidi.

5 Controllo della integrità conformazionale per mezzo di molecole endogene ed esogene: sviluppo di nuovi farmaci.
Esistono buone prospettive che una terapia basata sulla chelazione degli ioni metallici possa prevenire la formazione degli aggregati amiloidi. Le interazioni di piccole molecole contenenti specifiche sequenze delle proteine in esame, potrebbero competere con quelle che stabilizzano le fibrille. Tra le molecole progettate e sintetizzate dal gruppo di chimica, ci aspettiamo di identificare una tipologia di derivati in grado di svolgere attività farmacologia in uno o più PCDs.<<<

Durata

36 mesi