RICERCA ITALIANA     

Le tossine dell'antrace ed il loro ruolo nella patogenesi della malattia

Università degli Studi di Padova

Abstract

L’antrace è una malattia causata da un’infezione con ceppi patogeni di Bacillus anthracis. Tale batterio è largamente diffuso nell’ambiente in forma di spore altamente resistenti ad agenti chimici e fisici. Le spore penetrano nel corpo attraverso abrasioni nella pelle o tramite inalazione od ingestione e vengono, in misura minore o maggiore,ingerite dai fagociti dove esse germinano e divengono batteri vegetativi. Questi bacilli si moltiplicano rapidamente e producono un complesso letale tripartito di tossine composto da antigene protettivo (PA), fattore letale (LF) e fattore edematoso (EF). Questi tre componenti si combinano per formare due tossine binarie, la tossina letale (LT = PA + LF) e la tossina edematosa (ET = PA + EF). Evidenze recenti indicano che queste due tossine possono colpire diverse cellule nei diversi stadi della patogenesi. All’inizio dell’infezione esse svolgono un’attività immunosoppressiva che aiuta il batterio ad evadere il controllo del sistema immunitario. In qualche caso il batterio riesce a raggiungere il sistema linfatico e la circolazione sanguigna dove esso causa una diffusa batteremia con produzione di grandi quantità di tossine che si causano una diffusa intossicazione che coinvolge diversi tipi cellulari. Tale generalizzata batteremia e tossinemia porta a morte causata principalmente da un edema emorragico diffuso.
EF ed LF sono in grado di entrare in diversi tipi cellulari dove esse colpiscono vie di segnalazione intracellulare e>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Cesare MONTECUCCO, Universita' degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Finanziamento

La patogenesi dell’antrace inizia con l’entrata nel corpo di spore di B. anthracis o, più raramente, del batterio stesso, attraverso abrasioni della pelle o per inalazione o ingestione. Le spore inalate vengono fagocitate dai macrofagi e trasportate ai linfonodi regionali. Dentro ai macrofagi le spore germinano diventando batteri vegetativi, che vengono rilasciati e che si moltiplicano nel sistema linfatico da dove possono entrare nella circolazione sanguigna causando una massiccia batteremia e tossinemia. L’infezione sistemica ha una mortalità molto alta sebbene B. anthracis sia sensibile agli antibiotici, perché i sintomi sono molto blandi finchè non viene raggiunta una diffusa batteremia. Le manifestazioni della patologia allo stato avanzato, incluso lo shock e la morte improvvisa, vengono attribuite all’azione delle tossine e perciò è molto importante identificare inibitori delle tossine da usare insieme alla terapia antibiotica [1,2]. L’antrace cutaneo è meno pericoloso perché l’infezione viene mantenuta sotto controllo dalla risposta immunitaria locale e dopo un tempo prolungato usualmente si risolve grazie ad una risposta immunitaria adattativa.
I maggiori fattori di virulenza di B. anthracis sono una capsula di acido poli_D-glutammico, avente un’attività antifagocitica, e i tre componenti delle tossine che si combinano per formare due tossine binarie: la tossina letale (LT = PA + LF) e la tossina edematosa (ET = PA + EF). PA si lega a diversi recettori piuttosto. L’antrace cutaneo è meno pericoloso perché l’infezione viene mantenuta sotto controllo dalla risposta immunitaria locale e dopo un tempo prolungato usualmente si risolve grazie ad una risposta immunitaria adattativa.
I maggiori fattori di virulenza di B. anthracis sono una capsula di acido poli_D-glutammico, avente un’attività antifagocitica, e i tre componenti delle tossine che si combinano per formare due tossine binarie: la tossina letale (LT = PA + LF) e la tossina edematosa (ET = PA + EF). PA si lega a diversi recettori piuttostoLa patogenesi dell’antrace inizia con l’entrata nel corpo di spore di B. anthracis o, più raramente, del batterio stesso, attraverso abrasioni della pelle o per inalazione o ingestione. Le spore inalate vengono fagocitate dai macrofagi e trasportate ai linfonodi regionali. Dentro ai macrofagi le spore germinano diventando batteri vegetativi, che vengono rilasciati e che si moltiplicano nel sistema linfatico da dove possono entrare nella circolazione sanguigna causando una massiccia batteremia e tossinemia. L’infezione sistemica ha una mortalità molto alta sebbene B. anthracis sia sensibile agli antibiotici, perché i sintomi sono molto blandi finchè non viene raggiunta una diffusa batteremia. Le manifestazioni della patologia allo stato avanzato, incluso lo shock e la morte improvvisa, vengono attribuite all’azione delle tossine e perciò è molto importante identificare inibitori delle tossine da usare insieme alla terapia antibiotica [1,2]. L’antrace cutaneo è meno pericoloso perché l’infezione viene mantenuta sotto controllo dalla risposta immunitaria locale e dopo un tempo prolungato usualmente si risolve grazie ad una risposta immunitaria adattativa.
I maggiori fattori di virulenza di B. anthracis sono una capsula di acido poli_D-glutammico, avente un’attività antifagocitica, e i tre componenti delle tossine che si combinano per formare due tossine binarie: la tossina letale (LT = PA + LF) e la tossina edematosa (ET = PA + EF). PA si lega a diversi recettori piuttosto ubiquitari [3]. LF è una zinco metalloproteasi che agisce all’interno della cellula inattivando le proteine MAPKK (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase) alterando una delle maggiori vie di signalling [2,4], causando indebolimento della risposta immunitaria e morte dei macrofagi sensibili [5]. EF è una adenil-ciclasi calmodulina dipendente che causa accumulo di c-AMP ed una varietà di effetti che dipendono dal tipo cellulare, ed includono sbilanci osmotici ed inibizione della risposta immunitaria. [6]. Le tossine dell’antrace sembrano giocare un ruolo maggiore in due diversi stadi della patogenesi della malattia: a) all’inizio dell’infezione agendo sulle cellule immunitarie e b) dopo la setticemia causando una intossicazione generale. L’antrace è particolarmente pericoloso poiché esso è asintomatico finchè il batterio non raggiunge il sistema linfatico e la circolazione sanguigna. Sebbene B. anthracis sia sensibile a molti antibiotici, l’intervento è spesso troppo tardivo perché questa terapia sia efficace. In questo contesto, è essenziale sviluppare terapie antitossina da usare sia come farmaci preventivi che come terapeutici, da soli o in combinazione con antibiotici.
B. anthracis adotta molte strategie per sfuggire al sistema immunitario. La sua capsula di acido poli-D-glutammico inibisce la fagocitosi dei bacilli vegetativi e le sue tossine attaccano macrofagi, neutrofili, cellule dendritiche ed linfociti T [5]. Fino a poco tempo fa, si è praticamente studiato solo LF mentre EF è stato in qualche modo trascurato. Comunque, recentemente, si è visto che sia LF che EF inibiscono attivazione policlonale e proliferazione delle cellule T umane periferiche [7] ed il rilascio di citochine dalle cellule dendritiche attivate [8], con EF mostratosi più potente di LF. Di particolare rilevanza è stata la scoperta che queste due tossine insieme mostrano un notevole sinergismo. Alcuni di questi risultati sono stati ottenuti grazie agli sforzi combinati di due delle unità italiane presentanti questa proposta [7]. Questi dati hanno evidenziato per la prima volta che EF, in aggiunta a LF, gioca una parte importante nella strategia dell’evasione immunitaria di B. anthracis indebolendo componenti cellulari chiave dell’immunità adattativa. Si può anticipare che le due tossine agiscono in concerto anche su altri tipi cellulari e che non è più giustificabile un’attenzione concentrata solo su LF.
Alcuni aspetti dei processi biochimici coinvolti nell’entrata di EF e LF nel citosol della cellula sono stati chiariti e il laboratorio del partner internazionale di questo progetto ha contribuito in modo determinante [2]. PA si lega ai suoi recettori, viene attivato da uno specifico e selettivo taglio proteolitico ed il PA tagliato oligomerizza in eptameri in grado di legare LF e EF. Tale legame stimola l’endocitosi che procede finchè il complesso recettore-tossina raggiunge compartimenti endosomiali tardivi da dove LF trasloca nel citosol. Il pH acido presente nel lume di questi compartimenti causa un cambiamentoi strutturale di PA che forma canali transmembrana e trasloca LF nel citosol. Comunque, alcuni aspetti di questo processo di entrata sono poco conosciuti, gli aspetti cinetici sono sconosciuti, ed, in particolare, l’entrata cellulare di EF non è stata ancora studiata.
Gli obiettivi specifici del presente progetto sono:
a) studiare il processo di legame ed entrata di EF e LF nelle cellule T, nei macrofagi e nelle cellule epiteliali.
b) Studiare l’effetto di LT e ET, da sole ed in combinazione, sui processi cellulari coinvolti nella formazione delle sinapsi immunologiche.
c) Studiare l’effetto di LT ed ET nell’attivazione delle cellule B.
d) Studiare l’alterazione nell’espressione genica indotta da LT e ET nelle cellule dendritiche e nei macrofagi umani stimolati da B. anthracis
e) Identificare nuovi inibitori del legame di LF e EF al PA
f) Saggiare l’efficacia terapeutica di questi inibitori in modelli animali di antrace.

Questi obiettivi riguardano aspetti sia di base che applicativi dello studio dell’antrace e sono parte di uno sforzo mondiale per prevenire le conseguenze deleterie di un attacco con spore di antrace. Nello stesso tempo, ci proponiamo di contribuire alla comprensione dell’antrace cutaneo che è caratterizzato da un lungo periodo prima della comparsa di una adeguata risposta immunitaria che ne appare essere il fattore risolvente.

Referenze
1. M. Mock, A. Fouet, Anthrax, Annu Rev Microbiol 55 (2001) 647-71.
2. R.J. Collier, J.A. Young, Anthrax toxin, Annu Rev Cell Dev Biol 19 (2003) 45-70.
3. H.M. Scobie, J.A. Young, Interactions between anthrax toxin receptors and protective antigen, Curr Opin Microbiol 8 (2005) 106-12.
4. P. Ascenzi, P. Visca, G. Ippolito, A. Spallarossa, M. Bolognesi, C. Montecucco, Anthrax toxin: a tripartite lethal combination, FEBS Lett 531 (2002) 384-8.
5. T. Fukao, Immune system paralysis by anthrax lethal toxin: the roles of innate and adaptive immunity, Lancet Infect Dis 4 (2004) 166-70.
6. M. Moayeri, S.H. Leppla, The roles of anthrax toxin in pathogenesis, Curr Opin Microbiol 7 (2004) 19-24.
7. S.R. Paccani, F. Tonello, R. Ghittoni, M. Natale, L. Muraro, M.M. D'Elios, W.J. Tang, C. Montecucco, C.T. Baldari, Anthrax toxins suppress T lymphocyte activation by disrupting antigen receptor signaling, J Exp Med 201 (2005) 325-31.
8 J.N. Tournier, A. Quesnel-Hellmann, J. Mathieu, C. Montecucco, W.J. Tang, M. Mock, D.R. Vidal, P.L. Goossens, Anthrax edema toxin cooperates with lethal toxin to impair cytokine secretion during infection of dendritic cells, J Immunol 174 (2005) 4934-41.
9. L. Abrami, N. Reig, F.G. van der Goot, Anthrax toxin: the long and winding road that leads to the kill. Trends Microbiol. 13 (2005) 72-8.]>>>

Durata

36 mesi