RICERCA ITALIANA     

Interazione tra segnali di Ca++ extracellulari, intracellulari e subcellulari: un approccio di proteomica e genomica funzionale

Università degli Studi di Bari

Abstract

Lo ione Ca2+ e' un secondo messaggero ubiquitario e altamente versatile, in grado di controllare processi svariati: dall'espressione genica alla contrazione muscolare, dal metabolismo alla secrezione. Un aspetto che e` stato tuttavia sottovalutato e' la funzione che esso svolge nell'ambiente extracellulare.
Studi recenti, eseguiti dai gruppi di Brown, Hofer e Caroppo, hanno dimostrato che anche il calcio extracellulare (Ca2+ext) puo' funzionare da molecola segnale attraverso sensori come il recettore di membrana sensibile al Ca2+ esterno (CaR).
Il CaR e' un recettore accoppiato a proteine G ubiquitariamente espresso nel corpo umano ( ghiandole, apparato digerente, rene, sistema nervoso centrale e periferico). In tali cellule, le fluttuazioni fisiologiche della [Ca2]ext sono di frequente tradotte dal CaR in complessi segnali di Ca2+ intracellulari.

I mitocondri, oltre ad essere direttamente coinvolti nella regolazione fine dei segnali di Ca2+int, ne sono a loro volta significativamente influenzati.
A tal proposito e' di notevole rilievo la recente identificazione, da parte del gruppo di Palmieri, di nuovi trasportatori mitocondriali contententi motivi “EF hand”, attivati direttamente da Ca2+ citosolico. I mitocondri interagiscono attivamente con il reticolo endoplasmatico (ER) e sono in grado di “controllare” i livelli di Ca2+ nel lume di questi organuli. Tali interazioni possono influenzare eventi post-traduzionali (es. il ripiegamento delle

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Maria SVELTO, Universita' degli Studi di BARI

Obiettivo del Finanziamento

Il Ca2+ e' un versatile messaggero in grado di agire a livello intracellulare e subcellulare. Studi recenti (Brown, Hofer e Caroppo) hanno rivelato che, grazie a sensori come il recettore di membrana sensibile al Ca2+ esterno (CaR), anche il calcio extracellulare (Ca2+ext) puo' funzionare da molecola segnale. Le variazioni fisiologiche della [Ca2]ext sono generalmente convertite all'interno della cellula, via CaR, in complessi segnali di Ca2+.
I mitocondri, oltre ad essere direttamente coinvolti nella regolazione fine dei segnali di Ca2+int, ne sono a loro volta significativamente influenzati.
A tal proposito è da rilevare la recente identificazione (Palmieri), di nuovi trasportatori mitocondriali contententi motivi “EF hand”, attivati direttamente da Ca2+ citosolico.
Il presente progetto si propone di esaminare le interazioni integrate dei segnali di Ca2+ extra-, intra- e subcellulari. Tale obiettivo richiede la creazione di una rete multidisciplinare in cui l'approccio proteomico e genomico (Palmieri, Wohlrab e Svelto,) sara' affiancato dall'uso di tecniche molecolari/biochimiche (Svelto) e fisiologiche (Svelto, Caroppo, Hofer, Brown). I collaboratori americani coinvolti includono AM Hofer, esperta a livello internazionale nel campo della trasduzione del segnale e del CaR, EM Brown, il primo a clonare il CaR e nota autorita' sull'argomento, e H. Wohlrab, noto esperto nel campo della struttura e funzione dei trasportatori mitocondriali

1ext sono generalmente convertite all'interno della cellula, via CaR, in complessi segnali di Ca2+.
I mitocondri, oltre ad essere direttamente coinvolti nella regolazione fine dei segnali di Ca2+int, ne sono a loro volta significativamente influenzati.
A tal proposito è da rilevare la recente identificazione (Palmieri), di nuovi trasportatori mitocondriali contententi motivi “EF hand”, attivati direttamente da Ca2+ citosolico.
Il presente progetto si propone di esaminare le interazioni integrate dei segnali di Ca2+ extra-, intra- e subcellulari. Tale obiettivo richiede la creazione di una rete multidisciplinare in cui l'approccio proteomico e genomico (Palmieri, Wohlrab e Svelto,) sara' affiancato dall'uso di tecniche molecolari/biochimiche (Svelto) e fisiologiche (Svelto, Caroppo, Hofer, Brown). I collaboratori americani coinvolti includono AM Hofer, esperta a livello internazionale nel campo della trasduzione del segnale e del CaR, EM Brown, il primo a clonare il CaR e nota autorita' sull'argomento, e H. Wohlrab, noto esperto nel campo della struttura e funzione dei trasportatori mitocondriali

1Il Ca2+ e' un versatile messaggero in grado di agire a livello intracellulare e subcellulare. Studi recenti (Brown, Hofer e Caroppo) hanno rivelato che, grazie a sensori come il recettore di membrana sensibile al Ca2+ esterno (CaR), anche il calcio extracellulare (Ca2+ext) puo' funzionare da molecola segnale. Le variazioni fisiologiche della [Ca2]ext sono generalmente convertite all'interno della cellula, via CaR, in complessi segnali di Ca2+.
I mitocondri, oltre ad essere direttamente coinvolti nella regolazione fine dei segnali di Ca2+int, ne sono a loro volta significativamente influenzati.
A tal proposito è da rilevare la recente identificazione (Palmieri), di nuovi trasportatori mitocondriali contententi motivi “EF hand”, attivati direttamente da Ca2+ citosolico.
Il presente progetto si propone di esaminare le interazioni integrate dei segnali di Ca2+ extra-, intra- e subcellulari. Tale obiettivo richiede la creazione di una rete multidisciplinare in cui l'approccio proteomico e genomico (Palmieri, Wohlrab e Svelto,) sara' affiancato dall'uso di tecniche molecolari/biochimiche (Svelto) e fisiologiche (Svelto, Caroppo, Hofer, Brown). I collaboratori americani coinvolti includono AM Hofer, esperta a livello internazionale nel campo della trasduzione del segnale e del CaR, EM Brown, il primo a clonare il CaR e nota autorita' sull'argomento, e H. Wohlrab, noto esperto nel campo della struttura e funzione dei trasportatori mitocondriali

1) Interazione tra segnali di Ca2+ e trasportatori mitocondriali

- Il ruolo dei carrier mitocondriali dell'aspartato/glutamato (AGC) e dell'ATP-Mg/Pi (APC) sarà analizzato in cellule in coltura in cui l'espressione di questi due carrier, con o senza i loro siti di legame per il Ca2+, è stata indotta o repressa . AGC e APC sono nuovi effettori mitocondriali, Ca2+-regolati, della trasmissione del segnale Ca2+ dal citosol ai mitocondri. Gli effetti prodotti dal rilascio di Ca2+ nel citosol saranno valutati misurando i livelli di metaboliti e di cofattori nei mitocondri e nel citosol.
-Saranno identificati nuovi membri della famiglia dei carrier mitocondriali. Questo significa associare ad un dato gene ed al suo prodotto una specifica funzione di trasporto di uno specifico metabolita dal citosol ai mitocondri e viceversa (genomica funzionale e proteomica). A tale scopo, trasportatori mitocondriali di funzione incognita saranno prodotti in cellule ospiti procariotiche od eucariotiche, purificati, ricostituiti nei liposomi e testati per la loro capacità di trasportare metaboliti. Questi studi consentiranno l'identificazione di nuovi trasportatori Ca2+-regolati e di nuovi carriers. I metaboliti trasportati da questi carrier rappresentano un segnale per le vie metaboliche in cui essi sono coinvolti, nei mitocondri e nel citosol, ed inoltre, il loro trasporto potrebbe essere regolato dal Ca2+.
-Saranno studiate le proprietà strutturali e le relazioni struttura-funzione delle proteine di trasporto mitocondriali. Questi studi chiariranno il meccanismo del trasporto, e la sua regolazione da parte del Ca2+. Sarà effettuata la mutagenesi sito-diretta di specifici residui in regioni critiche dei trasportatori. Inoltre, saranno effettuati tentativi di cristallizzazione bidimensionale (microscopia elettronica) e tridimensionale (diffrazione ai raggi X) di alcuni trasportatori mitocondriali.

2) Ruolo del CaR

Grazie ad un approccio integrato di proteomica e genomica, affiancato da analisi di immagine su singola cellula con nuovi biosensori basati su GFP, si affrontera' uno studio multidisciplinare su diversi modelli cellulari.

A- CaR in astrociti

Il CaR è espresso in distretti che non appartengono al sistema di regolazione dell'omeostasi del Ca2+, quali il cervello, dove il suo ruolo è sconosciuto. I nostri obiettivi sono:
- studiare il ruolo funzionale del CaR nell'aumento della concentrazione di Ca2+ intracellulare in colture primarie di astrociti. La tecnica dell'interferenza dell'RNA sarà utilizzata per ottenere astrociti KD per il CaR. Tecniche di mutagenesi saranno utilizzate per studiare le basi molecolari dell'attività del CaR e individuarne i domini funzionali.
- effettuare studi di proteomica e di cDNA arrays su astrociti in cui il CaR è stato silenziato (KD) mediante RNAi, per esaminare le variazioni del profilo di espressione proteica e genica indotte dal KD del CaR.
- studiare il ruolo del CaR e del canale per l'acqua, AQP4, nella regolazione dei canali al K+ attivati dal Ca2+ (CAKC). E' noto che gli agonisti del CaR stimolano i CAKC in astrociti in coltura e che i CAKC (rSlo) colocalizzano con AQP4 a livello dei processi degli astrociti dove probabilmente svolgono un ruolo nell'omeostasi del volume e del K+. Studieremo se il trasporto di acqua mediato da AQP4 è necessario per l'attivazione funzionale dei CAKC e/o per un'efficiente clearance del K+.

B- CaR in cellule polarizzate

a-Cellule B-Pancreatiche insulino-secernenti
L'insulina, immagazzinata all'interno di granuli secretori, viene rilasciata per esocitosi in risposta a stimoli nutritivi o ormonali. Squires ha suggerito che l'attivazione del CaR da parte del Ca2+ contenuto in tali granuli possa modulare negativamente il processo di secrezione dell'insulina.
In collaborazione con A.Hofer, ci si propone di chiarire il ruolo fisiopatologico del CaR in tale processo secretorio attraverso “real time imaging” e biosensori fluorescenti ricombinanti.
Per identificare le proteine coinvolte nella trasduzione degli effetti mediati dal CaR, si analizzeranno le variazioni dei profili di espressione genica prima e dopo attivazione, silenziamento o overespressione del recettore.

b-Cellule renali
I difetti di concentrazione delle urine e la poliuria sono tipiche manifestazioni renali dell'ipercalciuria, alterazione frequente nei paesi sviluppati, fattore di rischio per l'insorgenza di calcoli renali. La poliuria sembra essere in parte dovuta all'attivazione del CaR nel dotto collettore renale e all'inibizione della traslocazione delle vescicole contenenti il canale per l'acqua, AQP2, nella membrana in risposta alla vasopressina.
Ci proponiamo di:
-Studiare la via di trasduzione che lega l'ipercalciuria all'espressione e al traffico intracellulare dell'AQP2 nel dotto collettore e il coinvolgimento funzionale del CaR in questi eventi.
-Analizzare, mediante proteomica mirata, le alterazioni dell'AQP2 nell'ipercalciuria familiare e in pazienti ipercalciurici portatori di mutazioni del CaR. Si procedera' anche all'espressione funzionale delle mutazioni del CaR in cellule renali.

c-Cellule gastriche
Nella mucosa gastrica, le variazioni dinamiche della [Ca2+]ext, via CaR e altri sensori del Ca2+ non identificati, regolano la secrezione di HCO3- e pepsinogeno. In questo lavoro cercheremo di correlare questi nuovi segnali di Ca2+ con eventuali variazioni funzionali (analizzate con tecniche biochimiche ed elettrofisiologiche) e dell'espressione genica, al fine di identificare i sensori, i segnali intracellulari e le proteine di membrana (es. trasportatori di HCO3-) sensibili alle fluttuazioni fisiologiche del [Ca2+]ext.

d-Cellule respiratorio
Nell'epitelio respiratorio la proteina CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) è responsabile della secrezione del Cl-.
La mutazione piu diffusa del gene codificante per CFTR ( Delta F508) da' luogo ad una proteina non “ripiegata” che è trattenuta dalle proteine chaperone del reticolo endoplasmico (ER) con conseguente alterazione della secrezione del Cl-.
Le proteine chaperone Ca-dipendenti residenti nell'ER svolgono un ruolo chiave nella maturazione e nella regolazione del CFTR.
Le cellule bronchiolari di pazienti affetti da fibrosi cistica (CF) hanno segnali intracellulari di Ca2+ alterati. Abbiamo osservato una diversa espressione del CaR in cellule respiratorie “sane” e CF per cui analizzeremo l'effetto dell'attivazione del CaR sulla maturazione e sul traffico del CFTR nei due tipi cellulari.]>>>

Durata

36 mesi