RICERCA ITALIANA     

Proteomica funzionale e progressione del ciclo cellulare

Università degli Studi di Genova

Abstract

I microarray di proteine e la spettrometria di massa rappresentano un approccio innovativo e versatile, senza precedenti, per lo studio della struttura e funzione delle proteine. Grazie ai recenti sviluppi si è aperta una nuova sfida alla comprensione della complessità chimica e strutturale del proteoma. In quest’ottica è notevolmente aumentato l’impiego di queste tecniche per studiare l’interazione tra proteine e diverse altre molecole e per identificare potenziali biomarker di malattie soprattutto nella biologia del cancro e nella progressione del ciclo cellulare. Gli sviluppi nella genomica e nella proteomica hanno fatto nascere una domanda per la miniaturizzazione di piattaforme per lo studio su larga scala di proteine utilizzando superfici solide ad alta densita’ spaziale. I microarray di proteine e la spettrometria di massa (insieme alla microscopia a forza atomica utilizzata per acquisire immagini di regioni chiave a livello atomico), hanno queste capacità permettendo ai ricercatori di analizzare migliaia di target simultaneamente. I DNA microarray si sono dimostrati particolarmente utili per l’analisi dell’espressione genica rivelando network di geni co-regolati; comunque l’analisi dell’espressione genica non è in grado di dare informazioni circa la quantità di proteine espresse o la loro funzione. A causa del ruolo centrale che le proteine giocano nella biologia e nella fisiologia c’è necessità di sviluppare metodiche più efficaci nello studio della complessita>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Claudio NICOLINI, Universita' degli Studi di GENOVA

Obiettivo del Finanziamento

Una delle questioni chiave della biologia cellulare è l’analisi dell’espressione genica e la relativa regolazione, sia in termini di geni [1,2] che di proteine[3,4]. Queste informazioni possono essere utilizzate per studiare lo stato della cellula nel suo insieme [5,6]. Le indagini in questo campo hanno coinvolto inizialmente misure dell’espressione dei geni tramite DNA microarrays [7] da cui è possibile ricavare dati sulle interazioni fra i geni e le proteine risultanti. Il progresso nei microarray di proteine ha consentito di analizzare direttamente interazioni multiple proteina-proteina [8], anche se la difficoltà nella purificazione delle proteine ha senza dubbio limitato il numero di studi che coinvolgono i protein microarray funzionali. Una strategia completamente differente, che evita la necessità di purificare in anticipo le proteine, si basa sull’utilizzo di un particolare tipo di autoassemblaggio dei microarray di proteine programmabile (NAPPA). Su questo tipo di matrici la sintesi delle proteine avviene direttamente in superficie grazie all’uso di opportuni reagenti [9] e può essere usato nell’analisi delle interazioni tra la proteina traget e altre molecole, quali farmaci, anticorpi, acidi nucleici, lipidi, o altre proteine. Inoltre, questo tipo di array può essere utilizzato nella ricerca di substrati per determinati enzimi. I NAPPA forniscono un potente strumento nello studio della proteomica funzionale.
Analogamente la spettrometria di massa MALDI TOF che di proteine[3,4]. Queste informazioni possono essere utilizzate per studiare lo stato della cellula nel suo insieme [5,6]. Le indagini in questo campo hanno coinvolto inizialmente misure dell’espressione dei geni tramite DNA microarrays [7] da cui è possibile ricavare dati sulle interazioni fra i geni e le proteine risultanti. Il progresso nei microarray di proteine ha consentito di analizzare direttamente interazioni multiple proteina-proteina [8], anche se la difficoltà nella purificazione delle proteine ha senza dubbio limitato il numero di studi che coinvolgono i protein microarray funzionali. Una strategia completamente differente, che evita la necessità di purificare in anticipo le proteine, si basa sull’utilizzo di un particolare tipo di autoassemblaggio dei microarray di proteine programmabile (NAPPA). Su questo tipo di matrici la sintesi delle proteine avviene direttamente in superficie grazie all’uso di opportuni reagenti [9] e può essere usato nell’analisi delle interazioni tra la proteina traget e altre molecole, quali farmaci, anticorpi, acidi nucleici, lipidi, o altre proteine. Inoltre, questo tipo di array può essere utilizzato nella ricerca di substrati per determinati enzimi. I NAPPA forniscono un potente strumento nello studio della proteomica funzionale.
Analogamente la spettrometria di massa MALDI TOFUna delle questioni chiave della biologia cellulare è l’analisi dell’espressione genica e la relativa regolazione, sia in termini di geni [1,2] che di proteine[3,4]. Queste informazioni possono essere utilizzate per studiare lo stato della cellula nel suo insieme [5,6]. Le indagini in questo campo hanno coinvolto inizialmente misure dell’espressione dei geni tramite DNA microarrays [7] da cui è possibile ricavare dati sulle interazioni fra i geni e le proteine risultanti. Il progresso nei microarray di proteine ha consentito di analizzare direttamente interazioni multiple proteina-proteina [8], anche se la difficoltà nella purificazione delle proteine ha senza dubbio limitato il numero di studi che coinvolgono i protein microarray funzionali. Una strategia completamente differente, che evita la necessità di purificare in anticipo le proteine, si basa sull’utilizzo di un particolare tipo di autoassemblaggio dei microarray di proteine programmabile (NAPPA). Su questo tipo di matrici la sintesi delle proteine avviene direttamente in superficie grazie all’uso di opportuni reagenti [9] e può essere usato nell’analisi delle interazioni tra la proteina traget e altre molecole, quali farmaci, anticorpi, acidi nucleici, lipidi, o altre proteine. Inoltre, questo tipo di array può essere utilizzato nella ricerca di substrati per determinati enzimi. I NAPPA forniscono un potente strumento nello studio della proteomica funzionale.
Analogamente la spettrometria di massa MALDI TOF [10,11] e’ una tecnica analitica che consente lo studio di proteine senza la necessita’ che siano marcate ed e’ particolarmente utile nello studio di campioni complessi e sconosciuti. Questa tecnica impiega l’utilizzo di un impulso laser per vaporizzare la proteina dalla superfice del target, ionizzarla e analizzarne il tempo di volo per determinarne il peso [10]. Dato che la misura della massa avviene sulla superficie del campione e dato che il processo e’ abbastanza delicato da evitare la frammentazione del campione, la tecnica MALDI può fornire informazioni sulla modifica enzimatica del substrato proteico. Tale tecnica puo’, inoltre, essere utilizzata per identificare le proteine che si legano a quelle immobilizzate sul substrato. Un modo per identificare le proteine legate al substrato prevede l’utilizzo di proteasi direttamente sull’array (e quindi sulle proteine legate) e poi l’analisi dei peptidi prodotti per ottenere informazioni sulla sequenza [11].
Le interazioni tra proteine possono essere anche studiate mediante modellazione molecolare [12, 13], che è uno degli obiettivi di questo progetto. Questa tecnica computazionale permette una rapida visualizzazione dell’interazione tra molecole a livello atomico. Nello studio delle proteine di interesse, le interazioni sono complesse e lente da analizzare con l’utilizzo di tecniche sperimentali in grado di risolvere strutture, come la cristallografia o la risonanza magnetica nucleare. Tali metodologie, pur presenti nei nostri laboratori saranno utilizzate solo in alcuni casi scelti.
Il nostro obiettivo principale è l'applicazione parallela della spettrometria di massa MALDI e delle matrici di proteine autoassemblanti, integrate dalla bioinformatica e dalla biologia strutturale (se e dove necessario), alle proteine dei linfociti umani durante le varie fasi del ciclo cellulare (in particolare nella iniziazione delle fasi G1 e S) ed alle proteine di osteoblasti di ratto durante la differenziazione osteogenica. Generalmente come metodi di rivelazione si usano traccianti fluorescenti che possono interferire con l'attività delle proteine; per tale motivo, come metodo di rivelazione per i microarray NAPPA, utilizziamo la spettrometria di massa MALDI al fine di analizzare campioni complessi per identificare simultaneamente senza marcatura le proteine che si legano ad una gran quantità di proteine immobilizzate.
Linfociti stimolati con PHA vengono ottenuti da sangue umano utilizzando gradienti di Ficoll, rappresentando un eccellente modello per illustrare la proliferazione e la quiescenza delle subpopolazioni cellulari per le loro caratteristiche di riproducibilità, significato biologico e mancanza di debris [14].
Inizialmente per identificare i geni importanti nella progressione dei linfociti, intendiamo realizzare una ricerca in banca data articolata. La ricerca intende identificare i geni coinvolti nel ciclo cellulare dei linfociti T umani, includendo quelli codificanti per l’assemblaggio della cromatina e gli switchers del ciclo cellulare o quelli coinvolti nelle interazioni importanti nel ciclo cellulare ma ancora non studiati a sufficienza. Le interazioni previste e i pattern di espressione per diversi geni (come CCNE1, CDK4, MYC, e CCNH) saranno validati dal confronto con i dati sperimentali di espressione genica utilizzando la nostra tecnologia DNAser [15]. Saranno così identificati i geni leader come quelli con il più elevato numero di interazioni adeguatamente pesate dalla combinazione dei punteggi assegnati via software [16].
Per indagare ulteriormente le basi dell’osteogenesi [17]della ricostruzione di fatture e delle osteopatie, saranno inoltre affrontati uno o piu’ dei seguenti obbiettivi specifici connesi allo studio di un modello in fase di sviluppo e di differenziazione:
- definire nuovi elementi nelle interazioni multimolecolari con MMP-14 e il loro significato funzionale per la comprensione degli eventi iniziali, promossi da ECM , che innescano la differenziazione osteogenica e contemporaneamente per lo sviluppo di saggi enzimatici su microchip;
- verificare la possibilità che un microarray di RPP possa essere utilizzato per lo screening di un programma di sviluppo della progressione osteogenica in vitro. Il sistema sarà facilmente implementato per osteoblasti di ratto e, una volta iniziato il lavoro, sarà sviluppato per l’osteogenesi umana. Questo potrebbe diventare rilevante per molte applicazioni cliniche.

Altri obiettivi saranno un ulteriore caratterizzazione a livello atomico di alcune ragioni dei nostri microarray NAPPA utilizzando un AFM in house [18] e una preliminare ottimizzazione della tecnologia di fabbricazione grazie ad una modificazione della tecnologia di Allumina Porosa Anodica (APA) [19]. Una caratteristica particolarmente significativa di mcroarray APA è la naturale possibilità di incanalare la luce emessa, contrariamente a quelli tradizionali usanti molecole fotoattive che emettono luce in tutte le direzioni creando così interferenza con le altre sorgenti vicine. Se l’adattamento al microarray di proteine avesse successo diventerebbe possibile la preparazione di dispositivi ad alta densità riducendo la distanza tra gli spot e la loro interferenza.

[1] M.F. Templin et al, Trends Biotechnol. 20, 160 (2002).
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Durata

36 mesi