RICERCA ITALIANA     

Studio del ruolo degli zuccheri nella eziologia della sclerosi multipla

Università degli Studi di Firenze

Abstract

Questo progetto di ricerca presenta un approccio multidisciplinare finalizzato allo studio del ruolo delle modificazioni post-traduzionali (MPT) nella patogenesi della Sclerosi Multipla (SM) ed è focalizzato a generare strumenti diagnostici/prognostici per uso clinico.
In particolare, ci proponiamo di studiare in dettaglio il ruolo della glicosilazione e della glicazione come strumenti diagnostici per rivelare, monitorare e valutare il trattamento della SM. I nostri studi forniranno un’ulteriore prova dei principali meccanismi di questa malattia.

Il gruppo di R. Livi (Università di Firenze) effettuerà studi di dinamica molecolare per l’identificazione di putative sequenze missenso nelle glicoproteine della mielina che possono generare nuovi antigeni (Ag) riconosciuti da autoanticorpi.

M. Chorev e N. Tarragona (Harvard Medical School) analizzeranno campioni di sieri e liquido cerebrospinale (CSF) di pazienti affetti da SM raccolti da L. Battistini (IRCCS S. Lucia, Rome) e dal gruppo di A.M. Papini (Università di Firenze) con il set di anticorpi contro proteine CD59 non specificamente glicate e CD59 glicate per identificare le diverse isoforme presenti nei biofluidi.

Il gruppo di P. Traldi (CNR Padova) effettuerà le analisi proteomiche per le proteine N-glicosilate della mielina nel siero e nel FCS di pazienti affetti da SM in diversi stadi della malattia e del trattamento, a confronto con soggetti sani. Inoltre P. Traldi analizzerà anche precedentemente purificati del gruppo di A.M. Papini.]>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Anna Maria PAPINI, Universita' degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Finanziamento

Molte malattie autoimmuni sono state associate a modificazioni post-traduzionali (MPT), che sembrano alterare la funzione e l’immunogenicità di antigeni proteici. Il mascheramento di antigeni tramite MPT rende difficile l’identificazione degli antigeni coinvolti nei meccanismi patogenetici delle malattie autoimmuni. La glicosilazione è la più importante MPT delle proteine e riveste un ruolo cruciale nella risposta immunitaria [1]. A causa dell’eterogeneità dei putativi siti specifici di glicosilazione e della diversità degli enzimi coinvolti nella glicosilazione delle proteine (glicosiltransferasi e glicosidasi), risulta importante studiare il ruolo degli zuccheri. Inoltre, la glicosilazione è coinvolta nei processi di riconoscimento cellula-cellula. A livello molecolare le MPT sono in grado di modificare la conformazione di glicoproteine e quindi influenzare le interazioni proteina-proteina. Si pensa perciò che gli zuccheri mascherino gli epitopi discontinui impedendone il riconoscimento da parte del sistema immunitario come antigeni self, scatenando una risposta autoimmune. L’antigenicità di epitopi che coinvolgono siti di glicosilazione può dipendere dalla conformazione indotta dalla porzione saccaridica e/o da una diretta partecipazione dello zucchero nel ricoscimento antigene-anticorpo. Ultimamente il ruolo degli anticorpi nelle malattie autoimmuni è stato rivalutato. E’ oramai accettato che una distinta forma di sclerosi multipla (SM) possa coinvolgere una. A causa dell’eterogeneità dei putativi siti specifici di glicosilazione e della diversità degli enzimi coinvolti nella glicosilazione delle proteine (glicosiltransferasi e glicosidasi), risulta importante studiare il ruolo degli zuccheri. Inoltre, la glicosilazione è coinvolta nei processi di riconoscimento cellula-cellula. A livello molecolare le MPT sono in grado di modificare la conformazione di glicoproteine e quindi influenzare le interazioni proteina-proteina. Si pensa perciò che gli zuccheri mascherino gli epitopi discontinui impedendone il riconoscimento da parte del sistema immunitario come antigeni self, scatenando una risposta autoimmune. L’antigenicità di epitopi che coinvolgono siti di glicosilazione può dipendere dalla conformazione indotta dalla porzione saccaridica e/o da una diretta partecipazione dello zucchero nel ricoscimento antigene-anticorpo. Ultimamente il ruolo degli anticorpi nelle malattie autoimmuni è stato rivalutato. E’ oramai accettato che una distinta forma di sclerosi multipla (SM) possa coinvolgere unaMolte malattie autoimmuni sono state associate a modificazioni post-traduzionali (MPT), che sembrano alterare la funzione e l’immunogenicità di antigeni proteici. Il mascheramento di antigeni tramite MPT rende difficile l’identificazione degli antigeni coinvolti nei meccanismi patogenetici delle malattie autoimmuni. La glicosilazione è la più importante MPT delle proteine e riveste un ruolo cruciale nella risposta immunitaria [1]. A causa dell’eterogeneità dei putativi siti specifici di glicosilazione e della diversità degli enzimi coinvolti nella glicosilazione delle proteine (glicosiltransferasi e glicosidasi), risulta importante studiare il ruolo degli zuccheri. Inoltre, la glicosilazione è coinvolta nei processi di riconoscimento cellula-cellula. A livello molecolare le MPT sono in grado di modificare la conformazione di glicoproteine e quindi influenzare le interazioni proteina-proteina. Si pensa perciò che gli zuccheri mascherino gli epitopi discontinui impedendone il riconoscimento da parte del sistema immunitario come antigeni self, scatenando una risposta autoimmune. L’antigenicità di epitopi che coinvolgono siti di glicosilazione può dipendere dalla conformazione indotta dalla porzione saccaridica e/o da una diretta partecipazione dello zucchero nel ricoscimento antigene-anticorpo. Ultimamente il ruolo degli anticorpi nelle malattie autoimmuni è stato rivalutato. E’ oramai accettato che una distinta forma di sclerosi multipla (SM) possa coinvolgere una demielinizzazione mediata da anticorpi [2]. Nel Laboratorio della Prof. Papini una ricerca multidisciplinare ha portato allo sviluppo di uno specifico probe antigenico, CSF114(Glc) [3,4], un glicopeptide in grado di rivelare, isolare e caratterizzare specifici auto-anticorpi presenti nel siero di un significativo numero di pazienti affetti da SM [5]. CSF114(Glc) è il primo strumento efficiente ed affidabile in grado di mostrare che una N-glucosilazione aberrante è fondamentale nel riconoscimento anticorpale nella SM. CSF114(Glc) è caratterizzato da un beta-harpin con l’epitopo minimo Asn(Glc) in posizione i+1 di un beta turn di tipo I’, opportunamente esposto per il riconoscimento anticorpale. Poiché questo glicopeptide potrebbe essere un mimetico di tutte le proteine mieliniche glucosilate aberrantemente che scatenano l’autoimmunità, ci proponiamo di indagare il meccanismo molecolare di una forma di malattia in cui la demielinizzazione è mediata da anticorpi.
In parallelo alla determinazione sperimentale sarà sviluppato un modello di docking per uno screening virtuale delle proteine mieliniche allo scopo di identificare i piu' probabili obbiettivi dell'attacco anticorpale [6].
Oltre alla glicosilazione che è una MPT enzimatica, la glicazione, una modificazione delle proteine non enzimatica, è in grado di influire sulla loro attività biologica. Precedenti studi svolti alla Harvard Medical School hanno dimostrato che l’iperglicemia in pazienti diabetici, porta, tramite glicazione, ad una specifica inattivazione della proteina CD59 regolatoria del complemento [7]. La glicazione di CD59 in uno specifico sito costituito da K41 e H44 presenti nel dominio attivo, permette una lisi accelerata delle cellule endoteliali. Questa lisi è indotta dal complesso di attacco della membrana (MAC) che porta al rilascio di fattori di crescita, di citochine proinfiammatorie e protrombotiche, che causano infiammazioni, crescita cellulare e trombosi, tutti sintomi delle complicazioni vascolari del diabete. L’antigene glicato è stato disegnato e sintetizzato; un anticorpo
specifico verso la proteina CD59 umana glicata (hCD59) e' stato prodotto e caratterizzato. Mediante questo anticorpo il Prof. Chorev ha dimostrato la colocalizzazione del MAC e di CD59 glicato nei reni e nei nervi dei pazienti diabetici, ma non negli stessi organi dei soggetti sani. Inoltre è stata osservata un’attività significativamente ridotta di hCD59 negli eritrociti dei soggetti diabetici [8]. Grazie a questo anticorpo anti CD59 glicato è stato sviluppato un saggio basato sul test ELISA per misurare, nei fluidi corporei di pazienti diabetici, il CD59 glicato. L’attivazione del complemento ben rappresentato nel sistema nervoso centrale, è coinvolta nella patogenesi di numerose malattie neurodegenerative quali Alzheimer, Parkinson e SM [9]. Vari gruppi hanno riportato aumentati livelli dei prodotti di attivazione del complemento nel fluido cerebro spinale [10] e la localizzazione dei complessi terminali del complemento nelle pareti venose di pazienti affetti da SM [11], così come il deposito di immunoglobuline e di componenti del complemento nelle lesioni attive della mielina [12]. L’inibizione dell’attivazione del complemento è protettiva nell’encefalite allergica sperimentale (EAS), modello animale della SM [13]. In particolare, il passaggio finale denominato MAC è implicato nell’indurre la demielinizzazione nella SM e nell’EAS. In topi carenti di CD59a, il maggiore inibitore della formazione di MAC, l’incidenza e la gravità della EAS indotta per immunizzazione, sono significativamente aumentate e le zone demielinizzate e il danno assonale sono quindi associati con depositi di MAC che lo rendono causa del danno osservato [14]. Anticorpi contro CD46 e CD59, due molecole che regolano il complemento, espresse nella membrana cellulare umana, sono presenti nel siero di pazienti affetti da SM remittente-recidivante nella fase acuta e sono responsabili di un meccanismo mediante il quale le cellule del sistema nervoso possono essere danneggiate in una maniera dipendente dal complemento [15]. La forte sottoespressione di CD59 negli astrociti reattivi nei pazienti SM suggerisce un ruolo di CD59 nella normale mielinizzazione umana [16]. CD59 è presente sulle cellule di Schwann, neuroni e cellule endoteliali del sistema nervoso periferico (SNP) e in prevalenza sulle cellule endoteliali del SNC. CD59 è stata osservata nel fluido cerebrospinale di individui sani. CD59 è legata nel SNP e nel SNC come glicosil-fosfatidilinositolo. La presenza di CD59 in varie cellule del sistema nervoso e nel FCS suggerisce che l’attivazione della regolazione del complemento mediante questa proteina, è importante nei meccanismi di difesa neurologica naturale [17]. L’inattivazione di CD59 mediante PTM evocati nei pazienti affetti da SM può essere la causa principale di perdita di protezione contro la formazione di MAC e della conseguente lisi cellulare che porta al rilascio di agenti infiammatori demielinizzanti. In questo progetto di ricerca ci proponiamo di studiare in dettaglio il ruolo della glicosilazione e della glicazione come strumenti diagnostici per rivelare, monitorare e valutare il trattamento della SM. I nostri studi forniranno un’ulteriore prova dei principali meccanismi di questa malattia.

Referenze
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[2] Lucchinetti, C., et al. Ann. Neurol. 47, 707-717 (2000).
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[17] Vedeler, C. et al. Immunology 82, 542-7 (1994).]>>>

Durata

36 mesi