RICERCA ITALIANA     

Costruzione di un Laboratorio Nazionale per lo studio delle resistenze batteriche agli antibiotici

Per capire in 10 righe

Il Laboratorio in costruzione si propone di raggiungere una molteplicità di obiettivi specifici, in sequenza logica e miranti a raggiungere una conoscenza ampia, di tipo non localistico o parziale, del fenomeno dell’antibiotico-resistenza nel nostro Paese e precisamente : nei suoi fattori microbiologici , epidemiologici e clinici; nei meccanismi della sua diffusione; nei determinanti genetici che ne caratterizzano il tipo ed il suo significato clinico, e ne prospettano l’evoluzione; per alcuni suoi riflessi per la fitness e la virulenza della specie batterica. Questa conoscenza è basilare ad ogni strategia di controllo efficace del fenomeno e pone le basi anche per nuovi approcci terapeutici basati sull’integrazione e la sostituzione dell’uso degli antibiotici stessi. Per raggiungere questi obiettivi sono state programmate le seguenti attività , in connessione logica ed integrata:

1.Costruzione ed espansione di una robusta ceppoteca idonea a rappresentare l'attuale stato della patologia infettiva batterica nel nostro Paese, sufficientemente rappresentativa della circolazione dei maggiori agenti di patologie batteriche gravi sia in ambito comunitario che nosocomiale e che possa essere continuamente aggiornata , consultabile ed adoperata per lo studio dei determinanti fenotipici e genotipici della resistenza, degli elementi genetici che la caratterizzano e ne determinano l’evoluzione, nonché per implementare procedure diagnostiche, in particolare quelle trasferibili al laboratori di microbiologia clinica di 1° e 2° livello, per fare biotipizzazione molecolare in cluster epidemici, od anche fare screening da parte di chi intende ,fra i proponenti del Laboratorio e fuori di esso, contribuire alla generazione di nuovi farmaci antinfettivi e/o nuovi bersagli terapeutici. La costruzione ed espansione della ceppoteca sarà eseguita attraverso l'attività di durata triennale di 60 Centri di Microbiologia Clinica ospedalieri od universitari, distribuiti uniformemmente su tutto il territorio nazionale, che raccoglieranno e diagnosticheranno , da tutti i campioni biologici per i quali è richiesta dal medico curante una diagnosi batteriologica in un paziente ricoverato per una infezione grave quale ad esempio sepsi , setticemia, polmonite,meningiti,endocarditi, ascessi profondi etc, acquisita in comunità o in ospedale, gli isolati batterici, eseguendo tests di suscettibilità agli antibiotici di ognuno di essi e riportando i risultati, insieme ad informazioni anagrafiche e cliniche ( questionario standard approvato dal Comitato Guida del progetto)al Centro di Coordinamento presso la UO 1 ( responsabile del Progetto) ed a 3 laboratori di riferimento ( scelti fra i 60 attraverso dei proficiency tests e guidati dai Proff. Nicoletti, Schito e Fadda delle Università di Catania, Genova e Roma-Cattolica, rispettivamente) che confermeranno la diagnosi microbiologica. La suddetta rete è già operante ed è stata saggiata nella sua efficienza durante l'anno in corso, con ottenimento di circa 5000 isolati batterici e circa 1000 ceppi antibiotico-resistenti. Il profilo di suscettibilità fenotipica tramite determinazione della concentrazione minima inibente sarà determinato per tutti i ceppi da un laboratorio internazionale certificato. Il database che accompagna la costruzione della ceppoteca ( vedi appresso) viene sottoposto a verifiche e controllo per la mancamza/non conformità delle informazioni, da ricercatori della U.O.1 del responsabile del Progetto, che allo scopo riunisce ogni 4 mesi i responsabili dei tre Laboratori di riferimento per un esame della situazione e la correzione di eventuali non conformità ai protocolli o nelle attività dei laboratori periferici. 'E prevista in proposito l'esclusione di un dato Laboratorio, sostituito da un altro afferente a struttura territorialmente e per numero di letti equivalente, quando non sia possibile correggere le non-conformità.
Questa ceppoteca sarà accessibile su richiesta motivata per tutte le attività di ricerca ritenute valide dal Comitato Guida, incluso lo screening di nuovi prodotti antibatterici e comprenderà un database eletronico contenente specifiche informazioni sul paziente, tipo di patologia, , sulla natura e tipologia del reparto e sulla suscettibilità di ogni isolato agli antibiotici esistenti. . Tutte le sopradette attività sono svolte dalla Unità Operativa 1 coordinata dal responsabile Scientifico del progetto e sono sostenute da un network di laboratori di Microbiologia clinica distribuiti al Nord, Centro e Sud-Isole( già costituito e funzionale da 2 anni), da 3 laboratori di riferimento microbiologico (Nord, Centro e Sud) e da un centro gestionale costituito presso il Dipartimento MIPI dell’ISS, come sopra indicato. Questo network è integrato da reti di laboratorio ed epidemiologiche su specifiche tematiche e microrganismi( quali Enternet ed altre) già attive e coordinate dal gruppo della U.O. 1.

2. sarà costruita una banca dati nazionale per la registrazione e validazione esterna dei ceppi microbici resistenti agli antibiotici isolati in Italia, utilizzando una piattaforma operativa on line, aggiornabile e consultabile via internet da gruppi di utenti ben definiti , ed implementabile per lo sviluppo di metodologie “user friendly”, trasferibili a laboratori di microbiologia clinica di 1° e 2° livello territoriale, e da questi utilizzabile per la diagnostica microbiologica rapida nonché la rapida determinazione di tratti genetici di resistenza agli antibiotici. Anche questa attività è a carico della UO 1 del responsabile della ricerca.

3. Per la messa a punto e l'utilizzazione di piattaforme tecnologiche che consentano lo studio accurato e comprensivo della natura ed evoluzione dei determinanti di resistenza agli antibiotici in selezionate categorie di batteri su cui l’evidenza clinica ed epidemiologica nazionale ed internazionale indicherà la necessità di questi particolari approfondimenti ai fini del controllo della resistenza stessa, saranno svolte le seguenti attività:
3.1. generazione di sequenze di interi genomi batterici e successiva annotazione bioinformatica, seguita da analisi comparativa atta ad identificare tutti i potenziali determinanti genetici associati alla resistenza nonché le loro regioni regolatorie. Questa attività sarà a carico della UO 2 (responsabile Gianluca de Bellis , ITB/CNR Milano)e sarà svolta tramite l'adozione della tecnologia di sequenziamento ultramassivo 454 della Life Sciences che permette di analizzare interi genomi in tempi rapidissimi (pochi giorni) ed a costi sostenibili all’interno di questo progetto. Detta attività e la relativa piattaforma saranno ulteriormente sviluppate grazie alle collaborazioni in atto nel progetto con gruppi accademici operanti nel settore delle nano-biotecnologie (NNL-Lecce e gruppi industriali di microelettronica di riconosciuta leadership internazionale, quale la ST-Microelectronics). Le informazioni ottenute dall’adozione di questa piattaforma tecnologica, di ovvio straordinario valore per tutti gli aspetti della fisiologia e patologia dei ceppi antibiotico-resistenti, si integreranno con l’adozione di altre tecnologie molecolari comprensive , a carico sia della UO 2 che della UO3 industriale, nonchè disponibili presso gruppi accademici particolarmente qualificati nel settore della farmaco-resistenza e che collaboreranno a pieno titolo ed attraverso sub-contratti alle attività delle tre UO del progetto, come segue :
3.2 Il DNA verrà estratto da stock batterici utilizzando un stazione robotica che lavora come uno strumento di estrazione di aciddi nucleici completamente automatizzato. Fino a 32 campioni saranno processati in parallelo . La preparazione dei campioni tramite questo robot è la chiave per qualsiasi approccio high-throughput. Esso sarà fatto funzionare in maniera tale da avere una capacità di processing costante per un lungo periodo di tempo.
Tutti i campioni saranno sottoposti a reazione PCR automatizzata, preparata in formato a 96 pozzetti. La real time PCR, effettuata con 3 set di primer, sarà eseguita su tutti i campioni immediatamente dopo l' estrazione del DNA. Questo screening sarà il primo filtro per l' analisi dei campioni batterici raccolti. I geni bersaglio dei primer della PCR real time saranno selezionati in funzione dei campioni processati. Esempi potrebbero essere i set di primer per mefA, ermB e tetM per gli streptococci o vanA, mecA, e ermC per gli staphylococci, blaTEM, blaSHV e blaCTX-M per Escherichia coli, ecc.. Poiché la messa a punto della real time PCR viene realizzata con un sistema automatico, ulteriori sets di primer potranno essere disegnati per ogni gruppo di specie batteriche al fine di aumentare il potere discriminatorio di questo strumento di analisi utilizzato in prima battuta. Questo ciclo di screening permetterà di raggruppare i diversi stipiti in base ad un numero noto di determinanti di resistenza. Uno screening high-throughput che porterà ad una prima grezza classificazione o raggruppamento dei diversi ceppi, è necessario poiché esso guiderà la scelta dei ceppi da sottoporre ad analisi con microarray ed eventuale sequenziamento completo del genoma. Le attività in questa linea saranno svolte dai gruppi di ricerca dei Proff. Pozzi e Rossolini dell'Università di Siena in stretta attraverso sub-contratto con la UO 1.Infine, ed in collaborazione con la U.O. 1 del progetto, collaboratori esterni accademici tradurranno nell'analisi dei determinanti genetici di resistenza algoritmi ed analisi matematiche già da loro messe a punto per l'analisi bioinformatica nell'evoluzione delle sequenze retrovirali e dei meccanismi di resistenza ai farmaci antiretrovirali. Questa attività sarà in particolare svolta dal gruppo dei Proff.Perno e Di Francesco, in subcontratto con la U.O. 1.





3) Sviluppo e validazione di metodologie di seconda generazione adatte al technology transfer a laboratori di microbologia clinica per l'identificazione dei patogeni e la rilevazione dei markers di resistenza antibiotica

L'approccio globale descritto nella proposta e' diretto all' identificazione di pannelli di sonde da utilizzare per costruire un test diagnostico in vitro, non basato su tecnologie costose e sofisticate come i DNA Microarrays classici o la Real-time PCR, in quanto un trasferimento di queste tecnologie ad un laboratorio che esegue diagnostica clinica di routine non e' attuabile. Verranno invece valutate metodologie alternative come la tecnologia di ibridazione colorimetrica di prodotti di PCR in formato ELISA, o la tecnologia dei DNA-chip a rilevazione non basata sulla fluorescenza. Queste tecnologie sono state immesse sul mercato da piccole e medie industrie specializzate in biotecnologia e sono, tra i nuovi strumenti destinati all'uso in laboratori clinici, quelli più promettenti ma al tempo stesso pratici e semplici da usare.

Il contributo fornito da questo lavoro deriverà da una estensiva analisi epidemiologica sulla ceppoteca in costruzione e consisterà principalmente nella definizione di diverse serie di sonde da utilizzare per la caratterizazione molecolare di determinate specie batteriche o anche di generi. Ogni serie di sonde includerà approssimativamente da 3 a 10 sonde specie-specifiche e da 10 a 20 sonde per individuare i determinanti di resistenza agli antibiotici. Queste serie di circa 20 sonde ognuna saranno dirette verso un gruppi selezionati di batteri come ad esempio stafilococchi, streptococchi ed enterobatteri. Un tale approccio, confrontabile con i test biochimici e con i test fenotipici di resistenza, dovrebbe garantire in contemporanea l'identificazione a livello di specie e la caratterizzazine molecolare del profilo di resistenza agli antibiotici. Il ristretto numero di sonde presenti nei test rende necessaria una accurata e puntuale valutazione epidemiologica dell'ambiente clinico e microbiologico nell'ambito del quale saranno usati. I test così sviluppati potranno dunque essere utilizzati come strumenti disegnati su misura per le esigenze degli Ospedali Italiani e del Sistema Sanitario Italiano



4-Analisi dei determinanti di resistenza attraverso recenti tecnologie di analisi molecolare quali i microarray genomici, compresi gli arrays universali recentemente sviluppati.Consideriamo l’approccio dei microarrays particolarmente utile e necessario da sviluppare in questo progetto perché si presta magnificamente ad identificare in saggi unici i numerosi e diversificati determinanti genetici di resistenza che si possono ritrovare in campioni clinici di soggetti con patologie gravi, spesso trattati con più antibiotici ed in cui gli agenti infettanti sono quindi sottoposti a forte selezione positiva per il trasferimento e l’accumulo di numerosi tratti di resistenza, difficilmente ed assai laboriosamente identificabili con tecniche non comprensive. Queste analisi daranno peraltro informazioni critiche per la scelta dei batteri su cui sequenziare l’intero genoma, e la loro effettuazione sarà a carico di una coordinata attività sia della U.O.1 che della U.O.2. Integrata con i punti 1 e 2 sopra, una ulteriore attività è lo studio dell’impatto che particolari mutazioni per l’antibiotico resistenza esercitano sulla fitness e la patogenicità del microrganismo. Per questo obiettivo saranno applicati particolari modelli di analisi matematica , del tipo mixed linear” o di “ generalized estimating equations” adoperati con successo da partecipanti alla U.O.1 nella determinazione del ruolo delle mutazioni per le resistenze agli antivirali, in particolare ai farmaci anti-HIV. Un algoritmo particolarmente sensibile è stato sviluppato per le correlazioni fra clusters di co-mutazioni ed impatto nella terapia. Infine, si prevede nel corso del progetto la sperimentazione di algoritmi delle “reti neurali” per correlare i dati di antibiotico-resistenza ai dati clinici e terapeutici. In questo approccio, saranno inserite alcune speciali ricerche puntiformi circa l’impatto dell’acquisizione di resistenze multiple sulla formazione di biofilm e sulla virulenza in alcuni microrganismi.

Abstract

Alle emergenze infettivologiche reali o seriamente ipotizzate, di cui ultimi esempi sono la SARS e l’assai temuta nuova pandemia influenzale, ormai ben note anche al comune cittadino, la nostra era aggiunge un sempre più preoccupante aumento delle resistenze agli antibiotici, che per alcuni batteri e classi di antibiotici ha raggiunto una diffusione allarmante, ed ha fatto prospettare alle maggiori autorità internazionali il rischio di un ritorno all’era pre-antibiotica. A questa ulteriore emergenza, fa da contraltare la scarsità di impegno e di investimenti, quindi di risultati, proprio in questo settore da parte della grande industria internazionale, non totalmente giustificata dai riconosciuti ostacoli normativi e brevettuali cui essa va incontro. Il controllo dell'antibiotico-resistenza è una sfida importante per la Sanità Pubblica e per questo noi crediamo che per vincere questa sfida sia richiesto un rinnovato impegno pubblico di grandi Istituzioni nazionali che possiedono massa critica, competenze e piattaforme applicative di pronta utilizzazione, e che possano anche promuovere uno sforzo collaborativo delle forze scientifiche pubbliche e private maggiormente attive nel settore. Questa è la missione del nuovo Laboratorio Nazionale per lo studio delle resistenze batteriche agli antibiotici che qui proponiamo di costruire. Il Laboratorio si caratterizza per la presenza di competenze scientifiche di riconosciuto alto livello internazionale nel settore della>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

ANTONIO CASSONE, ISS

Obiettivo del Finanziamento

Il Laboratorio in costruzione si propone di raggiungere una molteplicità di obiettivi specifici, in sequenza logica e miranti a raggiungere una conoscenza ampia, di tipo non localistico o parziale, del fenomeno dell’antibiotico-resistenza nel nostro Paese e precisamente: nei suoi fattori microbiologici, epidemiologici e clinici; nei meccanismi della sua diffusione; nei determinanti genetici che ne caratterizzano il tipo ed il suo significato clinico, e ne prospettano l’evoluzione; per alcuni suoi riflessi per la fitness e la virulenza della specie batterica. Questa conoscenza è basilare ad ogni strategia di controllo efficace del fenomeno e pone le basi anche per nuovi approcci terapeutici basati sull’integrazione e la sostituzione dell’uso degli antibiotici stessi.

OBIETTIVO 1. Si tratta della costruzione di una robusta ceppoteca idonea a rappresentare l'attuale stato della patologia infettiva batterica nel nostro paese, sufficientemente rappresentativa della circolazione dei maggiori agenti di patologie batteriche gravi sia in ambito comunitario che nosocomiali e che possa essere continuamente aggiornata, consultabile ed adoperata per lo studio dei determinanti fenotipici e genotipici della resistenza, degli elementi genetici che la caratterizzano e ne determinano l’evoluzione, nonché per implementare procedure diagnostiche, in particolare quelle trasferibili al laboratori di microbiologia clinica di 1° e 2° livello, per fare biotipizzazione molecolare in>>>

Durata

36 mesi