RICERCA ITALIANA     

GENOCOR LAB: Laboratorio di mapping genetico per la valutazione del rischio cardiovascolare

Per capire in 10 righe

INTRODUZIONE

Il progetto si articola in 6 workpackages (WP):
WP1: Identificazione dei pazienti e caratterizzazione biologica
WP2: Screening multigenico di singoli SNP
WP3: Screening genome wide
WP4: Analisi di proteomica
WP5: Profilo di espressione genica
WP6: Sviluppo di kit diagnostici

Nella figura seguente è riportato uno schema a blocchi che delinea le interazioni tra le attività e le applicazioni delle metodologie.


L’arruolamento della popolazione cronica sarà effettuato da IFC-CNR, a partire dal database clinico IMAGE. L’arruolamento della popolazione acuta sarà effettuato da IFC-CNR e UHSR, includendo consecutivamente i pazienti che si presenteranno per infarto miocardico acuto ed indicazione all’angioplastica primaria presso IFC-CNR (sedi di Pisa e di Massa) e con diagnosi di sindrome coronarica acuta presso l’UHSR. I gruppi di controllo sani (confrontabili ai pazienti per età e sesso) saranno anch’essi arruolati sia da IFC-CNR che UHSR.
Le popolazioni così arruolate saranno caratterizzate per ciò che riguarda il fenotipo clinico, strumentale e bioumorale presso le stesse unità. Ogni paziente sarà sottoposto a campionamento biologico allo scopo di ottenere campioni di DNA, siero e cellule circolanti.

I campioni di DNA saranno esaminati dall’unità DiaSorin per l’analisi di SNP di geni candidati noti mediante real time PCR e dall’unità ITB-CNR per l’analisi “genome wide” mediante microarray per l’identificazione di nuovi SNP. I campioni di siero saranno esaminati per l’analisi di espressione proteica (proteomica) dall’unità IFC-CNR mediante HPLC multidimensionale e Spettrometria di Massa, e dall’unità UHSR mediante Search Light Proteome Array. Cellule di sangue periferico verranno analizzate a cura dell’unità UHSR per l’espressione genica mediante differential display e dall’unità IFC-CNR per l’analisi proteomica su cellule. L’unità IFC-CNR eseguirà un'analisi di proteomica in campioni di sangue contenenti frammenti di placca e trombi, rimossi per tromboaspirazione in pazienti con infarto acuto. L’unità UHSR eseguirà analisi di espressione su campioni tissutali di placca rimossi durante endoarterectomia in pazienti con ACS.

I dati provenienti dall’analisi proteomica e di espressione genica saranno utilizzati per analisi di sequenziamento dalle unità USHR e ITB-CNR come guida all’identificazione di nuovi SNP da indicare all’unità DiaSorin per la realizzazione di nuovi kit.


WP1. IDENTIFICAZIONE DEI PAZIENTI E CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA

In sintesi, l’attività del WP1 includerà la caratterizzazione fenotipica, l’arruolamento dei pazienti e dei controlli, la raccolta e la preparazione dei campioni biologici. Questo obiettivo verrà perseguito dalle Unità UHSR e IFC-CNR.
Verranno selezionati gruppi omogenei di pazienti con IHD in fase acuta e in fase cronica, ad evoluzione favorevole o sfavorevole. I campioni biologici ottenuti in questi gruppi, processati e depositati in banche dati dedicate, rappresentano la base delle analisi che saranno condotte nell’ambito del progetto.
I pazienti in fase cronica, con profili evolutivi diversi, saranno reclutati dal database cardiologico disponibile in IFC-CNR e relativo all’ultimo decennio, e richiamati per effettuare un controllo clinico, la verifica del trattamento farmacologico pregresso ed in corso ed il prelievo ematico.
Nei pazienti selezionati per lo studio di fase acuta, campioni di sangue saranno prelevati anche a 3 mesi dalla dimissione, ad avvenuta remissione del quadro di acuzie. Inoltre in pazienti selezionati del gruppo acuto e sottoposti ad angioplastica primaria e/o endoarterectomia coronarica saranno ottenuti campioni tissutali della placca escissa. Il protocollo di arruolamento prevede l’autorizzazione preliminare del Garante Nazionale sulla Privacy, il permesso del comitato etico locale e la firma del consenso informato allo studio genetico.

CONSIDERAZIONI STATISTICHE
Per gli studi di associazione caso-controllo, la numerosità del campione è stata definita al fine di rilevare significative associazioni tra singole varianti polimorfiche e presenza di malattia, con una potenza minima dell’80% (alfa=0.05) calcolata sulla base dei dati presenti in letteratura e in funzione delle frequenze alleliche più basse dei geni inclusi. Ad esempio, è stato calcolato un arruolamento di 1000 pazienti con IHD e 1000 controlli al fine di ottenere una potenza dello studio pari al 90% per la definizione di una significativa associazione tra IHD e il genotipo epsilon 4 dell’apoliproteina E, considerando le frequenze genotipiche precedemente descritte (Tobin, Eur Heart Journal, 2004). Per gli studi di associazione genotipo-fenotipo, all’interno delle popolazioni di affetti, la numerosità dei campioni è stata calcolata al fine di rilevare un aumento del rischio di evoluzione sfavorevole di 2 volte con una potenza dello studio pari all’80%. Su questa base è stato calcolato l’arruolamento di un campione di 800 pazienti con disfunzione ventricolare al fine di ottenere una potenza dello studio pari al 90% per documentare un rischio relativo di 1.5 volte di evoluzione sfavorevole associato alla variante allelica Asp del gene dell’ossido nitrico sintetasi endoteliale, considerando le frequenze alleliche precedemente descritte (Mcnamara, Circulation 2003).

WP1A. POPOLAZIONI AFFERENTI ALLO STUDIO E RACCOLTA CAMPIONI BIOLOGICI

POPOLAZIONE AFFERENTE ALLO STUDIO DI FASE CRONICA
Si tratta di pazienti ricoverati in modo consecutivo in IFC a partire dal 1995 fino ad oggi e afferenti ad un programma di follow-up sistematico della durata individuale di 10 anni. L’anno di inizio 1995 garantisce che l’intera popolazione così selezionata sia tuttora aderente al programma di follow-up. Nella figura seguente è schematizzato l'andamento dell'arruolamento dei pazienti.


Tipologia dei pazienti: diagnosi alla dimissione di cardiopatia ischemica (angina, infarto, scompenso postischemico) e con anatomia coronarica nota.
Numerosità di partenza della popolazione: 2000 pazienti (circa 200 per anno).
Della popolazione iniziale di 2000 pazienti sono ad oggi sopravvissuti, e quindi potenziali candidati allo studio, 1600 pazienti (mortalità totale intorno al 20%). Questi costituiscono una popolazione affetta da cardiopatia ischemica ad evoluzione sin qui non fatale.
A scopo indicativo questa popolazione contiene due subpopolazioni di 500 e 1280 pazienti, rispettivamente con primo infarto ad un’età < 50 anni o > 60 anni, la cui mortalità (cardiaca e non) registrata ad oggi è rispettivamente del 16% e del 23%.
Al momento dell’arruolamento nello studio i pazienti verranno sottoposti ad una rivalutazione clinica mentre, nei sottogruppi di pazienti già sottoposti a caratterizzazione specifica mediante metodiche di alto imaging, la rivalutazione clinica sarà associata a rivalutazione mediante SPET, PET e/o MRI (dove appropriate) per definire la potenziale evoluzione dei patterns funzionali, microcircolatori e metabolici. Dai risultati della nuova caratterizzazione clinica e strumentale nei sopravvissuti e dai pattern ricavabili dai dati in archivio nei deceduti, verranno identificati gruppi fenotipici in base alla combinazione delle seguenti caratteristiche:
1. età di comparsa della malattia (<50 o >60 anni);
2. modalità di presentazione (angina o infarto come prima manifestazione);
3. modalità di evoluzione in senso sfavorevole o favorevole (morte cardiaca precoce, morte cardiaca tardiva, disfunzione ventricolare progressiva, scompenso e sopravvivenza in stato funzionale soddisfacente).
Dopo l’arruolamento, l’intera popolazione sarà sottoposta a follow-up per i 3 anni successivi di durata dello studio, indipendentemente dalla scadenza del follow-up programmata negli anni precedenti. Il follow up prevederà altresì l’annotazione del regime terapeutico seguito.
Per ciascun paziente di questa popolazione ricoverato dall’anno 2000, è disponibile una aliquota di plasma che, con il consenso del paziente stesso al momento dell’arruolamento, verrà utilizzato per l’analisi proteomica, la quale verrà ripetuta alla scadenza di 3 anni dal prelievo iniziale. La coorte di pazienti ad oggi deceduta (10% circa) di cui è disponibile il siero rappresenta ovviamente un campione della popolazione iniziale con malattia ad esito fatale nell’arco del follow-up programmato.
Per i pazienti appartenenti agli anni antecedenti al 2000, di cui non è disponibile il plasma relativo al momento del ricovero, l’indagine proteomica sarà effettuata all’arruolamento nello studio e ripetuta dopo 3 anni, al termine dello studio.
Oltre al confronto tra pazienti con IHD e quadri diversi di presentazione e di evoluzione è previsto uno studio caso/controllo.
Il trattamento dei campioni di sangue dei pazienti e dei controlli arruolati negli studi, che consiste nella raccolta di siero, di cellule del sangue circolante linfo-monociti e piastrine, nell’estrazione del DNA e nella preparazione della piastra relativa, nella catalogazione, crioconservazione e trasferimento alle Unità di interesse, verrà eseguito nei laboratori IFC di Genetica Clinica e Dislipidemie e Aterosclerosi. Gli stessi laboratori si occuperanno della gestione della Banca Biologica IFC in via di ultimazione con organizzazione identica a quella della banca biologica dell’unità UHSR di seguito descritta.

POPOLAZIONE AFFERENTE ALLO STUDIO DI FASE ACUTA (SINDROMI CORONARICHE ACUTE)
La selezione di fenotipi paradigmatici che avverrà presso UHSR e IFC-CNR, avrà due obiettivi specifici:
1. Lo studio dei meccanismi dell’instabilità coronarica persistente che si sviluppa su un substrato aterosclerotico coronarico di gravità variabile.
2. Lo studio dei meccanismi predisponenti, precipitanti ed eventualmente protettivi dell’infarto miocardico acuto che si sviluppano in presenza o assenza di marker infiammatori circolanti elevati.
Questo approccio fenotipico è dettato dalle più recenti linee di evidenza clinica, che convergono nell’indicare la presenza di specifiche caratteristiche fenotipiche distintive, in pazienti con ACS.
Allo scopo di raggiungere questi obiettivi saranno studiate tre popolazioni fenotipiche oltre ai controlli:
1) Pazienti con instabilità coronarica persistente come prima manifestazione di coronaropatia, distinti tra coloro che sviluppano un infarto miocardico nell’arco di due mesi e coloro che non lo sviluppano.
2) Pazienti con sindrome coronarica acuta e storia di angina cronica stabile da più di un anno e severa aterosclerosi coronarica, ma senza evidenza di pregresso infarto o angina instabile e con normale funzione ventricolare ed ECG basale normale.
3) Pazienti con infarto acuto come prima manifestazione di coronaropatia, ricoverati in unità coronarica entro 6 ore dall’esordio dei sintomi. Questi pazienti saranno suddivisi tra coloro in cui l’infarto è stato preceduto da angina instabile e quelli in cui l’infarto è stato completamente senza prodromi.
I pazienti con angina instabile saranno studiati in tre momenti: all’ingresso in unità coronarica, alla dimissione e dopo 90 giorni, ad avvenuta remissione della fase acuta. I pazienti con infarto miocardico acuto, preceduto o meno da angina instabile, saranno studiati in due momenti: all’ingresso in unità coronarica e dopo 90 giorni.
Per la popolazione di fase acuta il trattamento dei campioni di sangue periferico dei pazienti arruolati verrà eseguito nei laboratori di Biologia Clinica Cardiovascolare dell’UHSR e nei laboratori di IFC-CNR. La raccolta ed il trattamento di questi campioni, come anche estrazione del DNA, preparazione, catalogazione e crioconservazione verrà fatta dalle Banche Biologiche delle due unità.
La Banca Biologica UHSR è una struttura operativa per la raccolta, conservazione e gestione di campioni biologici (sangue, siero, plasma, cellule, tessuti,DNA, RNA, biopsie etc.), con procedure di campionatura standardizzata, anonima con codice a barre. Un apposito database gestisce applicazioni per la sistemazione ed il recupero delle aliquote nella serie di congelatori a –80°C, monitorizzati centralmente mediante un sistema computerizzato in grado di inviare lo stato di ogni singolo congelatore sulla rete intranet dell’Istituto.
Infine, in pazienti selezionati del gruppo acuto sottoposti ad endoarterectomia presso l’unità UHSR saranno ottenuti campioni tissutali della placca escissa. In pazienti selezionati del gruppo acuto sottoposti ad angioplastica primaria presso l’unità IFC-CNR saranno ottenuti per tromboaspirazione campioni di sangue contenenti trombi e frammenti di placca.

POPOLAZIONE DI CONTROLLO
Per il reclutamento della popolazione di controllo si prevede di utilizzare la banca di campioni biologici organizzata presso l’IFC nell’ambito del Progetto CNR-ENEL che ha arruolato un largo campione della popolazione generale italiana e un numero adeguato di soggetti sani di controllo raccolti all’UHSR appaiati per età e sesso. La popolazione è caratterizzata dal punto di vista demografico, delle abitudini di vita, condizioni sociali, fattori di rischio e stato di salute.

WP1B. IDENTIFICAZIONE DI FENOTIPI SPECIFICI MEDIANTE CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA

Il WP1b riguarda attività che verranno fatte quasi esclusivamente in pazienti con ACS in quanto l’interazione tra le componenti infiammatoria, immunologica e coagulativa sembrano giocare un ruolo precipitante di eventi acuti. Questa caratterizzazione sarà utile nell’evidenziare profili di espressione di proteine di fase acuta, distintivi di sottopopolazioni di pazienti, un aspetto essenziale per la generazione di specifici geni marcatori.
In particolare gli obiettivi specifici di questa attività saranno:
Obiettivo A): definizione di profili immunobiologico e coagulativo plasmatico.
A questo scopo verrà utilizzata la tecnologia SearchLight Proteome Array per studiare segnali proinfiammatori, fattori antinfiammatori, chemochine e altri biomarkers circolanti.
Obiettivo B): definizione dei profili immunobiologico e coagulativo dei leucociti e loro sottopopolazioni.
Mediante citofluorimetria a flusso su sangue intero determineremo markers su neutrofili, monociti e linfociti.
Obiettivo C): definizione dei profili immunobiologico e coagulativo piastrinici.
Su piastrine purificate verranno caratterizzati gli effetti modulatori di fattori presenti nel plasma.
Obiettivo D): valutazione del ruolo di eventi infettivi come fattore precipitante di eventi acuti.
A questo scopo verranno effettuate analisi PCR per ricerca di sequenze di adenovirus, parvovirus B19, polyomavirus umano, herpes virus, enterovirus, coronavirus and paramyxovirus. Questo obiettivo si affiancherà al lavoro che studierà l’espressione genica di agenti infettivi nelle cellule che infiltrano le placche coronariche.


WP2. SCREENING MULTIGENICO DI SINGOLI SNP

L'obiettivo del WP2 sarà lo screening delle varianti presenti nei geni candidati selezionati e verrà perseguito congiuntamente dalle Unità DiaSorin e IFC-CNR.
Lo screening “high throughput” sarà condotto su singoli SNP e aplotipi genici noti in geni candidati nei sistemi coinvolti nella patogenesi della cardiopatia ischemica (infiammazione, immunità, coagulazione, lipoproteine, controllo neuroormonale, funzione endoteliale, metabolismo miocardio, sistema redox ed altri) e su eventuali altri geni individuati.
Lo screening sarà eseguito utilizzando il sistema di Real Time PCR, ABI Prism 7900HT SDS che è una tecnologia ""high throughput"", dotata di una piastra di 384 pozzetti, che consente l'analisi simultanea di circa 100 SNP in 4 pazienti per singola PCR. In particolare, il DNA sarà genotipizzato impiegando un sistema multicolore di saggi per SNP basati sulle sonde TaqMan MGB (Minor Groove Binder). Le molecole MGB si legano al solco minore (minor groove) dell’elica di DNA stabilizzando il complesso sonda-MGB/templato. Questa stabilizzazione permette l’utilizzo di sonde corte (13 basi) migliorando la discriminazione allelica in saggi basati sull’ibridizzazione. Il segnale è generato dalla digestione esonucleasica in 5’ di un fluoroforo allele-specifico.
Il sistema comprende un software che utilizza un algoritmo a più componenti per calcolare i distinti contributi allele/marker al segnale a partire dalle misure di fluorescenza nei singoli pozzetti durante la lettura. La funzione di determinazione automatica dello SNP permette di attribuire automaticamente il genotipo e generare un cluster plot. Questa attività è strategica per il simultaneo sviluppo di tecnologie di diagnostica genomica basate sulla tecnica proprietaria della DiaSorin di cui si propone la commercializzazione tramite la sua rete europea.


WP3. SCREENING “GENOME WIDE”

Questo obiettivo, che sarà sviluppato dall’ Unità ITB, consisterà nello screening “genome wide” finalizzato all’identificazione di nuovi geni coinvolti nella patogenesi dei fenotipi clinici selezionati.
Sarà utilizzato un approccio sistematico, cieco, che non prevede la selezione di geni sulla base della loro funzione biologica al fine di identificare geni e varianti geniche che influenzano il rischio di contrarre infarto del miocardio e cardiopatie. Questo approccio è possibile grazie alla disponibilità di una piattaforma tecnologica Affymetrix e di chips che hanno una capacità di 100K , ossia che contengono 100.000 polimorfismi o SNP.
Sulla base dei prelievi di sangue disponibili da pazienti con IHD, verranno selezionati i campioni provenienti dai soggetti con un quadro di patologia conclamata e con un grado elevato di familiarità per patologia cardiaca. I pazienti verranno confrontati dal punto di vista genetico con un adeguato gruppo di controlli a loro volta selezionati sulla base dell’area geografica di provenienza, che dovrà essere corrispondente.
Lo studio, definito di tipo caso-controllo, prevede tre gruppi di casi e tre gruppi di controlli. Il primo gruppo verrà analizzato con i chip 100K; si adotterà un criterio di significatività di p<=0.01, secondo il quale circa 1000 SNP passeranno alla fase 2, dove un secondo gruppo di pazienti (possibilmente più ampio) verrà genotipizzato con il ABI Prism 7900HT. In questa fase, il criterio di significatività sarà p<=0.05, per cui circa 50 SNP identificheranno alcune aree di interesse, che saranno oggetto di ulteriore analisi in alcuni pazienti di una quantità di SNPs più alta (ABI Prism 7900HT) e di sequenziamento (sequenziatori di ultima generazione) alla ricerca di nuovi SNP. L’obiettivo principale di questa seconda fase consiste nella ricostruzione degli aplotipi (gruppi di SNP interdipendenti o in Linkage Disequilibrium interrotti da eventi di ricombinazione) e successiva ridefinizione dell’area d’ interesse. La ricerca di SNP causativi, ovvero di geni candidati per l’etiologia della IHD, si baserà sul significato biologico che sottende alla variazione genica.
L’ultima fase dello studio include la trasmissione alle altre unità dei risultati conseguiti più rilevanti, al fine di progettare nuovi kit per diagnostica predittiva, come previsto negli obiettivi generali del progetto. Parallelamente, si prenderà in considerazione la creazione di modelli di topo geneticamente modificati al fine di creare un modello di studio in cui sperimentare l’efficacia di farmaci mirati.


WP4. ANALISI DI PROTEOMICA

Questo obiettivo, che verrà perseguito dall’ Unità IFC-CNR, consisterà nell’evidenziare marcatori proteici di nuova generazione caratteristici dei profili di espressione della patologia.
Poiché le proteine sono gli esecutori del programma contenuto nell’informazione genetica della cellula, fotografare lo stato di tutte le proteine espresse in un determinato momento da una cellula o da un tessuto d’interesse clinico potrebbe dare un fondamentale aiuto alla conoscenza della rete di relazioni tra funzioni geniche diverse e fornire un valore diagnostico e terapeutico a nuovi fattori proteici (marker discovery, target discovery).
La proteomica è una tecnologia analitica ad ampio spettro che si prefigge di affrontare in questa chiave lo studio delle proteine espresse in cellule e tessuti, e l’approccio di tipo proteomico a studi clinici è una prospettiva di sviluppo tecnologico emergente che si pone all’avanguardia nel panorama della post-genomica, specie da quando sono state introdotte nuove apparecchiature ad alta capacità di analisi (multi-dimensional capillary chromatography, Tandem mass-mass spectrometers) accoppiate a sofisticati ed altrettanto potenti strumenti bioinformatici.
L’IFC-CNR ha sviluppato da alcuni anni la messa a punto di metodi di analisi proteomica applicandoli a cellule della parete vascolare di coronaria. Indagini proteomiche di reperti provenienti da sangue circolante, analizzati mediante spettrometria di massa, consentiranno di evidenziare marcatori proteici di nuova generazione, caratteristici dei profili di espressione della patologia.
Per lo studio di proteomica, sarà utilizzato uno spettrometro di massa di ultima generazione, “Applied Biosystems - 4700 Proteomics Discovery System”, in grado di analizzare simultaneamente fino a 1500 campioni diversi, di identificare peptidi e proteine, di sequenziare frammenti proteici opportunamente prodotti e, interfacciato a banche dati internazionali, di produrre analisi comparative sia a livello proteico che genico.
Lo studio delle proteine circolanti (siero, cellule) sarà un importante punto di collegamento con le indagini di tipo genetico. Infatti, l’individuazione di profili di espressione proteica associabili a definiti stati patologici (marcatori della patologia) indicherà quali cellule o tessuti siano responsabili della produzione dei diversi marcatori e di conseguenza consentirà di indirizzare in maniera puntuale l’indagine genetica (expression profiling). Inoltre, sarà possibile classificare l’alterazione delle proteine espresse, caratteristica del profilo patologico, in tre categorie distinte: 1) l’entità dell’espressione, 2) l’espressione di proteine mutate, 3) l’espressione di proteine modificate (alterazioni post-traduzionali). Queste informazioni saranno collegate agli studi genetici e ne consentiranno un più puntuale approfondimento in quanto indizio di “pathways” genetici e metabolici alterati. In particolare, alterazioni di tipo 1) potranno essere collegate con alterazioni del DNA genomico a carico delle sequenze regolatorie del gene oppure ad alterazioni delle proteine regolatorie o dei piccoli RNA coinvolti nella regolazione della trascrizione. Alterazioni di tipo 2) suggeriranno una verifica diretta di alterazioni del codice genetico o del meccanismo di maturazione (splicing) dell’RNA messaggero del gene. Alterazioni di tipo 3) saranno collegabili al processamento post-traduzionale della proteina. L’integrazione nella ricerca clinica dello studio genetico con quello di tipo proteomico costituisce un elemento assolutamente innovativo, in quanto generalmente l’utilizzo di una di queste tecnologie emergenti esclude l’applicazione dell’altra. Integrare significherà fornire sinergie impensabili ai risultati di entrambi gli strumenti d’indagine.
Alla medesima analisi proteomica saranno sottoposti i frammenti di lesione atero-trombotica ottenuti presso IFC-CNR da pazienti sottoposti ad angioplastica primaria e tromboaspirazione.


WP5. PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA

Questo WP, che verrà perseguito dall’ Unità UHSR, ha l’obiettivo di ottenere solidi profili di espressione sottostante la patologia che definiscano i diversi fenotipi clinici.
I profili di espressione genica saranno eseguiti direttamente su placca aterosclerotica e sui vari tipi cellulari separati dal sangue periferico e coinvolti nella formazione della placca.

BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA CORONARICA
Questa attività verrà svolta nell'ambito di una consulenza scientifica assegnata dall'Unità UHSR al Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia dell’Università Sapienza di Roma, in particolare con il Prof. Matteo Russo.
L'obiettivo di questa attività sarà la caratterizzazione e la separazione con il microscopio per dissezione laser di popolazioni di cellule che infiltrano le placche coronariche ottenute dai pazienti con angina stabile ed instabile. La selezione di frazioni specifiche di tessuto dello stesso tipo ottenute con il microscopio a dissezione laser sarà combinata con l’estrazione, il controllo e la manipolazione tramite nanotecnologia. Questa tecnologia si baserà sullo sviluppo di una tecnica recentemente acquisita, che prevede la preparazione di RNA da tessuti tumorali e dell’ospite adatti per un microarray contenente 1200 geni.

PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA DIFFERENZIALE
Per lo svolgimento di questa attività ci si avvarrà della collaborazione scientifica del Dipartimento di Biologia dell’Università di Padova, attivando una specifica commessa di ricerca con il gruppo del Prof. Gerolamo Lanfranchi.
Il primo obiettivo di questa attività sarà l’identificazione dei profili di espressione genica differenziale di cellule del sangue intero e delle piastrine purificate nei gruppi di pazienti selezionati (durante le fasi acute e stabili della malattia) e controlli sani, utilizzando piattaforme microarray con sonde oligonucleotidiche per 55.000 trascritti umani diversi. La piattaforma utilizzata (Amersham Biosciences/GE) è già in uso presso l’UHSR e ha già rivelato una notevole omogeneità e riproducibilità di risposta. I geni differenzialmente espressi nei pazienti acuti e cronici e nei controlli saranno validati mediante RT PCR, e saranno considerati come candidati per l’approccio di associazione allelica volto a confermare il ruolo patogenetico dei geni selezionati.
Il suo secondo obiettivo sarà la correlazione di geni differenzialmente espressi nel sangue, con quelli differenzialmente espressi in popolazioni leucocitarie e piastrine. Sarà eseguita l’analisi del trascrittoma di piastrine e leucociti circolanti su campioni di sangue periferico prelevati entro le prime 6 ore di una sindrome coronarica acuta, onde cercare di risalire agli eventi che hanno influito sull’espressione genica di queste cellule circolanti nel periodo immediatamente precedente l’evento acuto in modo da formulare ipotesi patogenetiche innovative.


WP6. SVILUPPO DI KIT DIAGNOSTICI

L’attività di questo WP sarà costantemente alimentata dai risultati provenienti dalle attività di ricerca previste nei WP 2,3,4,e 5 e verrà condotta dalla Unità DIASorin.
Questa attività costituisce l’obiettivo finale del progetto, che è lo sviluppo di test accurati e di costo contenuto e come tali applicabili nei laboratori ospedalieri, per un sottoinsieme di SNP identificati dal progetto come significativi predittori di suscettibilità alla malattia e di prognosi.
Il raggiungimento di questo obiettivo prevede la stretta collaborazione tra l’unità industriale e le unità di ricerca coinvolte nel progetto per la costituzione del laboratorio GENOCOR.
Il kit sarà basato sulla tecnologia proprietaria di DiaSorin denominata OCEAN (One CutEventAmplificatioN), che consente la genotipizzazione per mezzo di una reazione rapida in provetta singola. L’analisi dei dati consente la classificazione delle sequenze come wild-type, eterozigote o omozigote mutata. I saggi OCEAN eseguiti sui preamplificati PCR dei pazienti studiati saranno poi comparati con le genotipizzazioni effettuate con la tecnologia TaqMan-MGB e, per alcuni di essi, con genotipizzazioni effettuate tramite analisi di enzimi di restrizione (RFLP) in modo da avere un controllo incrociato delle diverse metodologie. Il kit diagnostico dovrà caratterizzarsi per semplicità di esecuzione e costi competitivi rispetto ad altre tecnologie.

Abstract

Il principale obiettivo del progetto GENOCOR (Mappaggio genetico per la valutazione del rischio cardiovascolare) è la creazione di un laboratorio pubblico/privato (GENOCOR-LAB) dedicato allo sviluppo ed alla valutazione di nuove tecnologie con rapporto costo/efficacia favorevole, che si avvalgano delle conoscenze sui correlati genomici delle malattie cardiovascolari (CVD) e sulla loro evoluzione; i dati ottenuti dal GENOCOR-Lab dovrebbero in particolare contribuire ad orientare le misure di prevenzione secondaria e di trattamento specifico della cardiopatia ischemica (IHD).

Il laboratorio sarà insediato nelle strutture dell'Istituto di Fisiologica Clinica del CNR, istituzione che gestisce un'azienda ospedaliera di ricerca specializzata nelle CVD, con due presidi ospedalieri (Area di Ricerca di Pisa, e Ospedale G. Pasquinucci di Massa). Al laboratorio contribuiranno la DiaSorin (azienda nazionale che dispone di promettenti tecnologie proprietarie nelle nuove biotecnologie diagnostiche) e tre unità di ricerca (a livello clinico e di biologia molecolare), due del CNR (IFC-CNR, Pisa, e ITB-CNR, Milano, all'avanguardia nella ricerca in campo biologico), ed una dell'Università Vita-Salute San Raffaele (UHSR, Milano, che opera come ospedale di eccellenza e centro di ricerca biologica avanzata): GENOCOR-LAB diviene così il primo prodotto della cooperazione tra due poli della rete MERIT (MEdical Research in ITaly) in via di attivazione da parte del CNR.

Il>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Antonio L'ABBATE, CNR

Obiettivo del Finanziamento

Il duplice obiettivo generale che caratterizza il progetto GENOCOR, delineato nel capitolo sulle strategie, viene qui ulteriormente precisato:
- GENOCOR opererà come punto di confronto e sinergia scientifica e tecnologica tra biologia, genomica e clinica delle CVD, finalizzato nell’ambito di questo progetto allo sviluppo di nuovi metodi di diagnosi e cura della IHD, basati su una più avanzata conoscenza dei meccanismi biologici sottostanti le patologie d’interesse.
- Il Laboratorio opererà come incubatore, possibile partner e promotore per l’industria che opera nel settore delle nuove tecnologie strategiche per la “nuova medicina” che integra l’attuale tassonomia fisiopatologica con la nuova tassonomia molecolare. Tale considerazione ha guidato la scelta di DiaSorin, azienda nazionale nel settore in grado di affrontare le sfide di questo nuovo mercato con tecnologie proprietarie, premessa indispensabile di elevata probabilità di sviluppo industriale dei risultati.

Il progetto è finalizzato alla messa a punto di nuove tecnologie di screening multigenico a rapporto costo-efficacia favorevole per la definizione di profili genici specificamente associati al rischio di cardiopatia ischemica, a quadri acuti e cronici di malattia, ad evoluzione favorevole o sfavorevole e risposta alla terapia medica ed interventistica. Tale obiettivo sarà perseguito mediante un approccio ad immediata applicabilità (A) ed un approccio propedeutico a successivi sviluppi (B-C).>>>

Durata

36 mesi