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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

SCHEDA FIRB

italiano - english
Unità di Ricerca
  • Universita' degli Studi di TORINO
    Dip. GENETICA, BIOLOGIA E BIOCHIMICA, TORINO (TO)
  • Universita' degli Studi di BRESCIA
    Dip. SCIENZE BIOMEDICHE E BIOTECNOLOGIE, BRESCIA (BS)
  • Consiglio nazionale delle ricerche (CNR)
    Centro di Studio per la Medicina Nucleare, NAPOLI (NA)
  • Universita' degli Studi di NAPOLI "Federico II"
    Dip. INGEGNERIA DEI MATERIALI E DELLA PRODUZIONE, NAPOLI (NA)
  • Universita' degli Studi di SIENA
    Dip. BIOLOGIA MOLECOLARE, SIENA (SI)
  • Consorzio interuniversitario Istituto nazionale biostrutture e biosistemi (INBB)
    Ist. Resp. sezione di terapia genica del lab. nazionale di INBB, ROMA (RM)
  • INTERNATIONAL CENTRE FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY
    Molecular Medicine Laboratory, TRIESTE (TS)
  • Universita' degli Studi di MILANO
    Dip. BIOLOGIA, MILANO (MI)
  • PORTO CONTE RICERCHE - Parco Scientifico e Tecnologico della Sardegna
    Laboratorio di Biotecnologie, TORINO (TO)
FIRB simili:
Classificazione scientifico-disciplinare
Classificazione brevettuale
  • CHEMISTRY; METALLURGY
    • BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
      • MICRO-ORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF (biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, containing micro-organisms, viruses, microbial fungi, enzymes, fermentates or substances produced by or extracted from micro-organisms or animal material A01N63/00; food compositions A21, A23; medicinal preparations A61K; chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings, absorbent pads or surgical articles A61L; fertilisers C05); PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICRO-ORGANISMS (preservation of living parts of humans or animals A01N1/02); MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA (micro-biological testing media C12Q)
  • HUMAN NECESSITIES
    • MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
      • PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES (bringing into special physical form A61J [N: mechanical aspects]; chemical aspects of, or use of materials for deodorisation of air, for disinfection or sterilisation, or for bandages, dressings, absorbent pads or surgical articles A61L; compounds per se C01, C07, C08, C12N; soap compositions C11D; micro-organisms per se C12N) [C0203]
Classificazione geografica
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Parole Chiave
Regolatori dell'angiogenesi; ischemia; modelli pre-clinici; ingegneria vascolare; endotelio; Diagnostica per immagini

Nuovi strumenti biotecnologici e post-genomici utilizzabili per la rivascolarizzazione dei tessuti nelle malattie ischemiche.

Università degli Studi di Torino
Abstract
Lo scopo principale di questo progetto è di perseguire nuove strategie terapeutiche per le malattie ischemiche acute e croniche, e comprenderne le basi molecolari,. A questo progetto partecipano 9 unità con caratteristiche di notevole interdisciplinarietà culturale e istituzionale. Infatti le esperienze delle singole unità coprono la biologia molecolare e cellulare, la biologia dello sviluppo, la diagnostica per immagine, la terapia genica, i modelli pre-clinici e la scienza dei materiali di interesse biomedico. L'interdisciplinarietà istituzionale (Università, Centri di eccellenza del MIUR, C.N.R., Parchi tecnologici) è nello spirito auspicato dal Bando e faciliterà il passaggio alla ricerca traslazionale dei risultati ottenuti. Si ritiene che questi due aspetti rappresentino un sicuro vantaggio per implementare le istituzioni a cui afferiscono le singole unità.
L' angiogenesi e l'ingegneria tissutale sono un nuovo bersaglio terapeutico nelle malattie ischemiche. Nonostante i primi risultati incoraggianti ottenuti con un singolo induttore dell'angiogenesi (vascular endothelial growth factor, VEGF-A), sino ad oggi studi clinici controllati non si sono dimostrati efficaci nel raggiungimento degli "end points". Inoltre, il possibile ruolo di VEGF-A nella patogenesi delle placche aterosclerotiche, e il rischio della formazione di emangiomi durante il trattamento, suggeriscono che il VEGF-A da solo non sia la molecola ideale per la rivascolarizzazione fisiologica>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
FEDERICO BUSSOLINO, Universita' degli Studi di TORINO
Obiettivo del Finanziamento
A.Obiettivi generali e razionale scientifico
Lo scopo principale di questo progetto e' di focalizzarsi sugli aspetti più innovativi per trattare le malattie ischemiche. Per incrementare, da un lato la vascolarizzazione dei tessuti ischemici in studi pre-clinici, e dall'altro lo sviluppo di vasi sanguigni artificiali contenenti cellule ingegnerizzate, saranno impiegate molecole solubili che agiscono in fasi diverse e specifiche del processo angiogenico. Inoltre, mediante approcci genomici e proteomici, ci proponiamo di caratterizzare nuove vie e molecole che giocano ruoli ancora sconosciuti nel processo angiogenico associato all'ischemia. Queste conoscenze saranno usate per stabilire termini di correlazione con ulteriori e nuovi approcci terapeutici. Focalizzeremo le nostre energie su di un limitato numero di punti: questo ci permette di utilizzare la conoscenza pratica e l'affermata esperienza dei gruppi partecipanti, in modo da combinare e condividere gli sforzi.
Abbiamo identificato due macro-obiettivi:
1)L'impiego di attivatori dell'angiogenesi, che agiscono a livello di tre differenti fasi del processo angiogenico, nel trattamento delle malattie ischemiche. Tali attivatori agiscono: 1) a livello della fase di progressione, dove le cellule endoteliali (EC) migrano, proliferano e rilasciano enzimi proteolitici[(vascular-endothelial growth factors (VEGF), fibroblast growth factors (FGF), tissue kallicrein (HK)]; 2) a livello della fase di; 2) a livello della fase diA.Obiettivi generali e razionale scientifico
Lo scopo principale di questo progetto e' di focalizzarsi sugli aspetti più innovativi per trattare le malattie ischemiche. Per incrementare, da un lato la vascolarizzazione dei tessuti ischemici in studi pre-clinici, e dall'altro lo sviluppo di vasi sanguigni artificiali contenenti cellule ingegnerizzate, saranno impiegate molecole solubili che agiscono in fasi diverse e specifiche del processo angiogenico. Inoltre, mediante approcci genomici e proteomici, ci proponiamo di caratterizzare nuove vie e molecole che giocano ruoli ancora sconosciuti nel processo angiogenico associato all'ischemia. Queste conoscenze saranno usate per stabilire termini di correlazione con ulteriori e nuovi approcci terapeutici. Focalizzeremo le nostre energie su di un limitato numero di punti: questo ci permette di utilizzare la conoscenza pratica e l'affermata esperienza dei gruppi partecipanti, in modo da combinare e condividere gli sforzi.
Abbiamo identificato due macro-obiettivi:
1)L'impiego di attivatori dell'angiogenesi, che agiscono a livello di tre differenti fasi del processo angiogenico, nel trattamento delle malattie ischemiche. Tali attivatori agiscono: 1) a livello della fase di progressione, dove le cellule endoteliali (EC) migrano, proliferano e rilasciano enzimi proteolitici[(vascular-endothelial growth factors (VEGF), fibroblast growth factors (FGF), tissue kallicrein (HK)]; 2) a livello della fase di maturazione, caratterizzata dal reclutamento delle cellule murali e dal rimodellamento del plesso vascolare primario [Angiopoietins (Ang)]; 3) a livello della fase di stabilizzazione del vaso nel contesto tridimensionale [Semaphorins (Sema)].
Queste molecole saranno studiate in maniera combinata: a) in vitro, per comprendere i loro effetti sinergici o additivi sui meccanismi molecolari dell'attivazione dell' EC (Unita' di Bussolino, Presta, Madeddu, Oliviero); b) in vivo, attraverso il rilascio mediato da vettori virali (virus adeno-associati ) per verificare il loro effetto terapeutico in modelli pre-clinici di ischemia (Unita' di Giacca, Madeddu, DelVecchio); c) in vitro per studiare da una parte il loro effetto sull'architettura delle cellule endoteliali, dall'altra la loro funzione nell' assemblamento tridimensionale dei piccoli vasi; questi fenomeni saranno studiati impiegando cellule endoteliali o cellule endoteliali ingegnerizzate in modo da over-esprimere il gene della trascrittasi inversa della telomerasi che aumenta la durata media della vita delle cellule (Unita' di Netti e Bussolino).
2)L' identificazione di molecole sconosciute espresse in vitro e in vivo in seguito alla stimolazione di EC con le suddette molecole. Questo scopo sara' raggiunto utilizzando approcci genomici(Unita' di Presta, Giacca, Cotelli, Oliviero) e proteomici (Unita' di Turrini) su campioni derivanti da diversi protocolli sperimentali delle unita' coinvolte. In questo modo otterremo profili di espressione relativi a diverse condizioni:
a) EC e cellule murali stimolate in vitro con attivatori dell'angiogenesi, singolarmente o differenzialmente combinati (Bussolino, Presta, Madeddu, Oliviero)
b) EC modificate in vitro per costruire vasi di piccole dimensioni (Unita' di Netti)
c) cellule staminali embrionali wild-type e knock-out per recettori angiogenici indotte a differenziare in EC, in vitro
d) modelli in vivo di ischemia (Giacca, Madeddu).
Da questo approccio genomico ci aspettiamo di identificare geni indotti da specifici fattori e/o dalla combinazione degli stessi.
Questi dati, insieme con quelli in vitro ed in vivo, permetteranno di selezionare geni che saranno ulteriormente studiati per comprendere il loro ruolo nel processo angiogenico.
In questo macro-obiettivo, la necessita' di una piu' approfondita conoscenza dei meccanismi alla base della vascolarizzazione dei tessuti ischemici, e', inoltre, messa in risalto dall'uso del modello genetico di Zebrafish (Unita' di Cotelli).Questo modello ci permette di: a) trovare delle conferme riguardo al ruolo di nuovi geni putativi identificati mediante lo screening genomico, attraverso l'isolamento di geni omologhi e il loro knock-out funzionale, utilizzando oligonucleotidi modificati; b)identificare nuovi geni espressi durante la vasculogenesi embrionale e la differenziazione del sistema vascolare in condizioni ipossiche.

Per collegare tra loro i due macro-obiettivi saranno realizzati sforzi coordinati, mantenendo l'attenzione sullo scopo ultimo del progetto: l'incremento della vascolarizzazione dei tessuti ischemici.
In questo modo, il trattamento dell' ischemia miocardica e dell' arto, sara' affrontato dal punto di vista della ricerca di base (Unita' di Bussolino, Presta, Madeddu, Oliviero, Netti, Cotelli, in collaborazione con le Unita' di Presta e Turrini che offrono la piattaforma tecnologica) e della ricerca traslazionale. Quest'ultima consiste nel miglioramento del rilascio dei geni verso i tessuti ischemici (Unita' di Giacca), nel monitoraggio dell'efficacia terapeutica mediante analisi funzionali (Unita' di Madeddu) e di immagini (Unita' di DelVecchio) e in strategie per perfezionare le interazioni tra cellule e matrice sintetica nei vasi ingegnerizzati (Unita' di Netti).
Infine, e' nostra intenzione approfondire le motivazioni per cui riteniamo che una strategia terapeutica basata sull'uso combinato di piu' di un fattore angiogenico sia la strategia migliore per raggiungere il nostro scopo. Nonostante i primi incoraggianti risultati ottenuti con un singolo fattore angiogenico, fin' ora gli studi clinici randomizzati non sono riusciti a dimostrare una primaria efficacia finale.Allo stesso modo, l'ingegnerizzazione dei tessuti vascolari, per ottenere vasi di piccolo calibro adeguati, comporta svariati problemi metodologici.
Le possibili spiegazioni del parziale fallimento degli approcci terapeutici sono le seguenti: 1) data la complessita' del programma angiogenico, risulta troppo semplicistico pensare che la somministrazione di una singola molecola angiogenica possa essere sufficiente per generare una neo-vascolarizzazione duratura e ben stabilizzata. Cio' nonostante, VEGF, un fattore di crescita principalmente coinvolto nella fase di progressione dell'angiogenesi, e' stato utilizzato come unico strumento terapeutico nelle sperimentazioni cliniche. Ora, pero', e' noto che VEGF porta alla formazione di grovigli vascolari, senza reclutamento di un numero sufficiente di periciti. Questa vascolarizzazione caotica, simile a quella presente nei tumori, e' funzionalmente inefficiente e facilmente soggetta a regressione; 2) un altro problema non risolto riguarda la variabilita' fenotipica dei diversi letti vascolari in termini di risposta a stimoli angiogenici e anti-apoptotici e l'impatto di questa variabilita' sullo stato di malattia; 3) a causa dei pochi studi effettuati fino ad ora, si sa poco riguardo i dosaggi appropriati e la durata del trattamento; 4) nell'ingegnerizzazione dei vasi il passo limitante nello stabilire una ben conformata architettura endoteliale su supporti artificiali e' l'inadeguata condizione di coltura cellulare e l'inappropriato rifornimento dei fattori pro-angiogenici.
Sulla base di queste evidenze e sulle attuali informazioni sulla vasculogenesi e sull'angiogenesi, approcci estremamente riduzionistici potrebbero dimostrarsi inefficaci. Attualmente, la strategia di uso corrente in campo angiogenico e' basata sulla valutazione gene per gene e sulla correlazione tra le caratteristiche biologiche e clinico-patologiche della malattia associate alla risposta vascolare.
L'avvento delle tecnologie post-genomiche e proteomiche permette di avere un approccio globale basato sull' identificazione simultanea di profili di espressione di migliaia di geni noti o ignoti.
Riteniamo che una strategia terapeutica muti-molecolare, monitarata mediante un sistema di analisi di immagine vascolare e associata ad analisi post-genomiche e proteomiche, permettera' di superare le attuali difficolta', portando a benefici piu' precoci (successi negli studi pre-clinici e nell'ingegnerizzazione vascolare) e piu' tardivi (maggiori informazioni sui meccanismi molecolari dell'angiogenesi associata all'ischemia).

B.Obiettivi specifici e risultati attesi da parte delle singole unita'.
Focalizziamoci, ora, sugli specifici obiettivi delle singole unita' partecipanti. Gli obiettivi individuali concorrono alla realizzazione dei macro-obiettivi descritti nel paragrafo precedente. In questa sezione e' descritto il lavoro compiuti da ciascuna singola unita'. L'integrazione di tutti gli sforzi (dal punto di vista culturale, tecnologico, e bioinformatico) saranno trattati in dettaglio nella descrizione dei workpackages.
Unita' di Bussolino:
Questa unita' permettera' di identificare i meccanismi molecolari alla base dell'attivazione dell'EC indotta da Ang e Sema singolarmente o differenzialmente combinati. L'impiego di molecole dominanti negativi permettera' di definire meglio il loro ruolo nell'angiogenesi. Gene Chip e analisi proteomiche permetteranno di definire un pannello di geni e proteine regolati dai fattori pro-angiogenici nei diversi modelli di angiogenesi in vitro.
Questa unita' fornira' cDNAs per la terapia genica e partecipera' nella convalida biologica dei geni selezionati identificati sia da altre unita' che dalla stessa. Inoltre, questa unita' produrra' EC umane ingegnerizzate con la telomerasi, per prolungare la vita media delle cellule.
Queste cellule saranno, poi, utilizzate dall'unita' di Netti nella creazione di piccoli vasi ingegnerizzati.
Risultati attesi.
1.profili di espressione genica e proteica di geni indotti da Ang e Sema e loro raggruppamento funzionale.
2.attivita' di queste molecole in vivo mrdiante l'uso di molecole dominanti negativi.
3.Convalida biologica dei geni selezionati.
4.produzione di EC over-esprimenti la telomerasi.
Unita' di Cotelli:
Questa unita' si focalizzera' sull'identificazione e sulla caratterizzazione dei geni che giocano un ruolo cruciale nella vasculogenesi e nella differenziazione cardiovascolare in condizioni ipossiche.
Inoltre, identifichera' geni omologhi a quelli identificati nello screening genomico effettuato su tessuti di mammifero e contribuira' nella loro caratterizzazione funzionale mediante esperimenti di over-espressione e di knock-out.
Risultati attesi
1.Valutazione di alcune mutazioni (cloche, syu, flh, Cyclops, cripto) coinvolte nella vasculogenesi e nella differenziazione cardiovascolare e nella loro risposta all'ipossia.
2.Identificazione di alcuni geni omologhi a quelli regolati nei mammiferi attraverso l'approccio terapeutico multi-molecolare.
Unita'di Del Vecchio. Questa unita' focalizzera' i suoi sforzi sulla sintesi e la caratterizzazione di peptidi marcati specifici per avb3 e sul loro impiego nell'analisi di immagine vascolare nei modelli di ischemia acuta e cronica.
Risultati attesi
1. Sintesi di peptidi marcati adatti per l'analisi di immagine
2. Raggiungimento di traguardi per valutare l'efficacia della terapia pro-angiogenica

Unita' di Giacca. Questa unita' studiera' il rilascio di molecole angiogeniche dal vettore virale adeno-associato (AAV) nell'arto e nel cuore ischemico.
Identifichera', inoltre, nuovi geni modulati in vivo, durante il processo ischemico. Cio' sara' realizzato esprimendo nel tessuto una library di cDNA di geni espressi nel muscolo striato e cardiaco. Saranno selezionati i geni in grado di indurre protezione, in seguito ad induzione di ischemia.
Risultati attesi
1. Progressi nei protocolli di trasferimento genico mediato dai vettori AAV
2.Miglioramento delle strategie terapeutiche
3.Identificazione di nuovi geni coinvolti nell'angiogenesi associata all'ischemia.

Unita' di Madeddu. Questa unita' identifichera' i meccanismi molecolari di attivazione di EC indotti da HK da solo o differentemente combinato. Gene Chip e analisi proteomiche permetteranno di definire un pannello di geni e di proteine regolati da questo fattore pro-angiogenico in diversi modelli di angiogenesi in vitro.
Questa Unita' utilizzera' nella terapia genica HK singolarmente o in combinazione con altri induttori angiogenici, per modelli sperimentali di ischemia miocardica e dell'arto.
Risultati attesi.
1.Profili di espressione dei geni e proteine indotti da HK e loro raggruppamento funzionale.
2.Attivita'di queste molecole in modelli di ischemia in vivo
3.Convalida biologica dei geni selezionati.

Unita' di Netti. Questa unita' valutera' l'attivita' combinata di piu' induttori angiogenici e quella di nuove molecole identificate nello screening genomico dei tessuti vascolari ingegnerizzati.
Lo scopo di questa unita' e' di valutare l'uso di queste molecole per migliorare la risposta angiogenica nella struttura polimerica tridimensionale.
Risultati attesi.
1.Determinazione delle migliori interazioni tra i fattori solubili e le matrici di supporto
2.Determinazione delle configurazioni spaziali migliori per il rilascio dei fattori in grado di indurre un'efficiente risposta angiogenica in strutture polimeriche tridimensionali
3.Impiego di EC esprimenti la telomerasi per la formazione di un albero vascolare in vitro.

Unita'di Oliviero. Questa unita' identifichera' le vie trascrizionali indotte dai membri della famiglia del VEGF, singolarmente o differentemente combinati, in EC. Generera' mutanti specifici di queste proteine per indirizzare la loro attivita' solamente su uno dei tre recettori affini conosciuti. Gene Chip e l'analisi proteomica definiranno un pannello di geni e proteine regolati da questi induttori angiogenici in differenti modelli in vitro. Questa unita' impieghera' il VEGF nella terapia genica da solo o in combinazione con altri induttori angiogenici per modelli sperimentali di ischemia miocardica e dell'arto.
Risultati attesi
1.Profili di espressione genica e proteica indotti dalla famiglia del VEGF e loro raggruppamento funzionale
2.Attivita' di queste molecole in vivo
3.Convalida dei geni selezionati
4.Identificazione di specifiche vie trascrizionali

Unita'di Presta. Questa unita' fornira' la piattaforma tecnologica per l'analisi genomica, basata sul Gene Chip (Affymetrix) e cDNA microarray.
Questa unita' identifichera' i meccanismi molecolari dell'attivazione dell'EC indotti da FGF-2 da solo o in differenti combinazioni. Gene Chip e l'analisi proteomica definiranno un pannello di geni e proteine regolato da questo induttore angiogenico in diversi modelli di angiogenesi in vitro. Questa unita' procurera' cDNAs per la terapia genica e partecipera' alla convalida biologica dei geni selezionati identificati da altre unita' e dalla stessa.
Risultati attesi
1.Profili di espressione genica e proteica indotti da FGF-2 e loro raggruppamento funzionale.
2.Convalida biologica dei geni selezionati

Unita' di Turrini.Questa unita' fornira' la piattaforma tecnologica dell'analisi proteomica basata su un approccio combinato che utilizza l'elettroforesi bidimensionale, associata alla mappatura di peptidi, ottenuta con il MALDI-TOF e l'electron spray associata alla tandem spettrometria di massa per l'analisi delle modificazioni post-traduzionali.Queste tecniche permettono all'unita' di ottenere informazioni sulle proteine citosoliche e transmembrana e sulle loro modificazioni post-traduzionali. Le proteine saranno analizzate da EC trattate differentemente e usate in vari saggi angiogenici o durante gli esperimenti di ingegnerizzazione vascolare.
Risultati attesi
1.Creazione di un data base proteomico incentrato sull'angiogenesi e sull'ingegnerizzazione vascolare.
2.Identificazione di nuove proteine coinvolte nel processo angiogenico
3.Identificazione di modificazioni post-traduzionali in proteine selezionate, coinvolte nel processo angiogenico e nell'ingegnerizzazione vascolare
4.Confronto dei dati provenienti da analisi proteomiche e genomiche]>>>

Durata
36 mesi