RICERCA ITALIANA     

Meccanismi di vulnerabilita' neuronale: identificazione di nuovi target biologici per lo sviluppo di terapie innovative

Università degli Studi di Milano

Abstract

I gruppi di ricerca che afferiscono al progetto si propongono di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi molecolari e cellulari che mediano la risposta di fenotipi neuronali differenti a medesimi insulti, allo scopo di chiarire le proprietà intrinseche che regolano la vulnerabiltà neuronale selettiva.
L'acquisizione di queste conoscenze sarà strumentale ad una migliore comprensione delle modalità di integrazione di un segnale tossico da parte di sistemi cellulari diversi e potrà contribuire alla identificazione di nuovi strumenti per l'intervento farmacologico.
Nell'ambito del progetto saranno affrontati i seguenti aspetti, in tre work-packages:

1- Studio di meccanismi extracellulari ed extranucleari
Verranno esplorate vie di attivazione extrasinaptiche e cascate biochimiche intracellulari coinvolte nei fenomeni di vulnerabilità neuronale. In particolare i meccanismi che regolano la disponibilità extracellulare di glutammato (recettori presinaptici, gliali e/o neuronali) verranno studiati dal gruppo del Prof. Volterra (Universita' di Milano) e Prof. Raiteri (Universita' di Genova). L'unità Volterra investigherà le basi molecolari e le dinamiche del rilascio di glutammato Ca/dipendente dagli astrociti al fine di comprendere le implicazioni di questo processo sulla propagazione di un segnale citotossico nel network neuroni-glia. Il gruppo di Genova studierà in popolazioni di motoneuroni in coltura i meccanismi capaci di modulare il>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

FLAMINIO CATTABENI, Universita' degli Studi di MILANO

Obiettivo del Finanziamento

La vulnerabilità di cellule nervose ad un insulto dipende dal fenotipo cellulare e l'espressione della vulnerabilità neuronale utilizza in modo concertato segnali extracellulari e specifiche cascate biochimiche intracellulari.
Obiettivo primario di questo progetto é quello di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi molecolari e cellulari che stanno alla base della diversa risposta di cellule ad insulti.
Dal momento che la vulnerabilità di popolazioni/fenotipi neuronale puo' determinarsi a diversi livelli nella cascata di eventi a partire dalla disponibilità di neurotrasmettitore eccitotossico nello spazio sinaptico fino a meccanismi nucleari, sarà necessario, per raggiungere in modo esaustivo l'obiettivo del progetto, analizzare nel dettaglio tutte le componenti di questa cascata. Possiamo quindi distinguere tre sotto obiettivi:
1) Analisi dei meccanismi extranucleari
1.a - Rilascio e ricaptazione del glutammato. I meccanismi che regolano il rilascio e la disponibilità di glutammato nello spazio sinaptico verranno studiati in modelli in vitro, quali colture neuroni-astrociti e in fettine ippocampali. Particolare attenzione sara' dedicata al rilascio di glutammato da parte di astrociti al fine di identificare le implicazioni di questo processo sulla funzione sinaptica e sulla propagazione del segnale nel neuroni-glia. Verranno analizzati in questo contesto le basi molecolari degli aumenti di Ca++ citosolico indotti da PGE2 in astrociti in intracellulare.
Gli studi condotti su motoneuroni in coltura si focalizzeranno sull'analisi dei meccanismi recettoriali capaci di modulare l'effetto neurotossico mediato dal glutammato, monitorando l'impatto di [3H-colina] come indice selettivo di funzionalità cellule in neuroni in motoneuroni esposti a insulto eccitotossico. Verrà inoltre valutato l'effetto neuroprotettivo mediato dall'attivazione di recettori inibitorii (quali GABA-A e glicina) e la possibilita' che sia l'attivazione di recettori metabotropici per il glutammato appartenenti al gruppo II e III, che come già dimostrato conferiscono neuroprotezione, che l'applicazione di fattori di crescita possa essere legata a protezione dei motoneuroni all'insulto eccitotossico.

1.b - Recettori per il glutammato e meccanismi di trasduzione.
L'organizzazione funzionale e strutturale delle PSD eccitatorie verrà studiata in colture ippocampali primarie (neuroni-glia) e colture corticali.
Obiettivo principale sarà l'identificazione di nuovi target molecolari all'interno dell'organizzazione strutturale delle densità post-sinaptiche di tipo eccitatorio e dei meccanismi di trasduzione del segnale ad esse associati, così come l'identificazione di possibili meccanismi in grado di modulare dinamicamente la struttura delle densità post-sinaptiche e quindi, influenzando la funzionalità dei recettori ionotropici per il glutammato, di influenzare la vulnerabilita' neuronale. Verra' inoltre valutata l'ipotesi che l'espressione differenziale di subunità dei recettori al glutammato nelle diverse popolazioni neuronali, e conseguentemente il diverso reclutamento di elementi di trasduzione del segnale ad esse direttamente legati, sia alla base della vulnerabilità selettiva dopo insulti ischemici o eccitotossici. Verranno inoltre studiati gli eventi che conseguono all'attivazione dei recettori glutammatergici quali produzione di NO, induzione di markers della lipoperossidazione quali 8 epi-PGF2a e il loro ruolo nell'espressione della eccitotossicità e dal pre-condizionamento ipossico. Verrà dato particolare rilievo alla disregolazione dell'omeostasi del ferro e la modulazione dell'espressione e la modificazione selettiva della funzionalità di Iron Regulatory Proteins nel danno metabolico e anossico/ipossico.
Verranno esaminate le vie di trasduzione associate a recettori glutammatergici in cellule spinose dello striato che siano coinvolte nell'espressione del potenziamento a lungo termine indotto da deprivazione di ossigeno e glucosio molecolari per farmaci che possano bloccare gli effetti anomali sulla trasmissione sinaptica indotti dallo stato ischemico.
Al termine del progetto i gruppi coinvolti in questo sottobiettivo, che riflettera' il WP1, dovrebbero avere acquisito nuove conoscenze sui meccanismi cellulari e molecolari extranucleari che regolano i processi di vulnerabilita' neuronale selettiva e quindi di nuovi taget molecolari per terapie innovative

2) Eventi intranucleari
Le cascate di eventi intracellulari descritte negli obiettivi al punto 1 convergono ad attivare fattori di trascrizione, enzimi nucleari e di geni specifici.
Obiettivo specifico sarà lo studio del ruolo dell'attivazione dell'enzima poli (ADP) ribosio polimerasi (PARP) nella patogenesi della morte neuronale eccitotossica e post ischemica. In particolare si valuterà in colture primarie di neuroni corticali o in colture organotipiche ippocampali il grado di stress ossidativo (mediante esposizione a H2O2 , deprivazione di ossigeno e glucosio o insulti eccitotossici) necessario per attivare la PARP ad un livello tale da portare a deplezione cellulare di NAD e ATP. Inoltre si esaminerà il tipo di neurodegenerazione ottenibile in modelli sperimentali in cui si ha una significativa attivazione della PARP.
Si potranno inoltre correlare i livelli di attivazione della PARP e il tipo di morte neuronale con la selettività di specifiche popolazioni neuronali, i.e. cellule della CA1 ippocampali versus CA3 ippocampali, agli insulti eccitotossici o simil ischemici.
Questi studi avranno come obiettivo finale da possibilità di intervenire su questi eventi patogenetici mediante uso di nuovi inibitori della PARP.
Un fenomeno causalmente correlato alla vulnerabilità neuronale é la sensibilita' a stimoli apoptotici. Pertanto si valuterà il ruolo di diversi fattori trascrizionali NF-KB nella modulazione della risposta cellulare e stimoli neurotossici o neuroprotettivi. In particolare obiettivo specifico sarà quello di identificare il ruolo dei diversi complessi NF-KB coinvolti nell'espressione di geni regolatori dell'apoptosi in grado modulare la soglia di vulnerabilita' neuronale. Nell'ambito di eventi intranucleari, verrà studiato l'eventuale ruolo di geni Wnt e Notch nei processi neurodegenerativi mediante uso di modelli in vitro ed in vivo.
Al termine del progetto le unita' coinvolte in questo obiettivo dovrebbero avere acquisito nuove conoscenze sui meccanismi intranucleari (WP2) che regolano i processi di vulnerabilita' neuronale selettiva e quindi di nuovi taget molecolari per terapie innovative.

3) Eventi patogenetici specifici riconducibili a patologie neurodegenerative nell'uomo.
Allo scopo di identificare nuovi target molecolari per un intervento terapeutico specifico ed innovativo, obiettivo specifico di questo studio sarà estendere l'analisi di meccanismi molecolari di vulnerabilita' neuronale selettiva a modelli di patologie neurodegenerative. Verranno utilizzati animali esposti cronicamente a tossine mitocondriali, quali acido 3-nitropropionico e malonato, in grado di bloccare il complesso mitocondriale II selettivamente alterato nella malattia di Huntington, e un modello murino di di Huntington allo scopo di studiare meccanismi sinaptici e molecolari responsabili di danno neuronale selettivo nello striato. In quest'ultimo modello, obiettivo specifico sarà quello di indagare l'attività di nuovi agenti farmacologici che si sono dimostrati in grado di interferire con modificazioni elettro- fisiologiche specifiche riscontrate in questi animali.
Al fine di analizzare eventi patogenetici riconducibili a patologie degenerative nell'uomo verranno utilizzati animali esposti a gp 120 del virus HIV-1 come modello animale di "AIDS dementia complex" sindrome neurologica caratterizzata da disordini cognitivi e motori.
E' stato documentato che la somministrazione di gp 120 determina una rapida attivazione delle cellule della microglia, con concomitante induzione di espressione di IL-1beta e infine di apoptosi nella corteccia di ratti. Pertanto obiettivo specifico sarà quello di indagare il possibile ruolo di IL-1beta nell'attivazione del programma di morte cellulare ed in particolare il suo possibile ruolo nei meccanismi di traslocazione del citocromo C, come eventi causalmnete correlato a fenomeni apoptotici. Verranno inoltre studiati meccanismi patogenetici di una importante patologia neurodegenerativa quale le malattie di Alzheimer. Siccome é opinione generalmente accettata che la formazione di peptidi Abeta di varia lunghezza e la deposizione in placche siano fenomeni necessari all'induzione ed espressione di malattia, obiettivo specifico sarà quello di studiare non solo i meccanismi cellulari responsabili della formazione di peptidi Abeta differentemente troncati all'estremità N-terminale, ma anche: i) la loro distribuzione in cellule in coltura ed in tessuti cerebrali autoptici di soggetti controllo ed affetti da malattia di Alzheimer; e ii) i meccanismi molecolari e cellulari responsabili della tossicità di questi frammenti di amiloide. Sarà inoltre obiettivo di questo progetto esaminare trattamenti farmacologici atti a modificare la formazione di peptidi amiloidogenici, in particolare inibitori specifici di secretasi (enzimi responsabili delle produzioni di frammenti Abeta) e l'impatto che queste molecole possono indurre sulla fisiologia cellulare di neuroni e glia.
I risultati attesi di questo sottoobiettivo (WP3) riguardano l'approfondimento della comprensione di eventi molecolari di patogenesi di morte neuronale selettiva mediante l'utilizzo di modelli di patologie neurodegenerative
Per il conseguimento degli obiettivi sopradescritti i gruppi di ricerca impegnati in questo progetto coordineranno le loro forze con pronto scambio di informazioni, di materiali e modelli di studio innovativi e non facilmente reperibili, di metodologie acquisibili e con stages di giovani ricercatori nei laboratori delle differenti sedi. I gruppi di ricerca che propongono questo progetto hanno già dimostrato una ottima capacità di coordinamento e di conseguire risultati comuni pubblicati su riviste di alto impatto, legati allo scambio di competenze, in 2 precedenti progetti cofinanziati dal MURST. Riteniamo quindi opportuno ed estremamente produttivo continuare questo tipo di progettualita' convinti che solo l'uso coordinato di approcci differenziati, che sono competenze specifiche delle diverse unità di ricerca che propongono questo progetto (approcci di biologia molecolare, biochimica, morfologia, biologia cellulare fisiologia, utilizzo di modelli in vivo), possa permettere un significativo avanzamento delle conoscenze in un settore della ricerca biologica e medica, quale quello delle malattie neurodegenerative, che pur avendo un grosso impatto sul contesto sociale, manca ancora di interventi farmacologici innovativi e significativi.]>>>

Durata

36 mesi