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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

SCHEDA FIRB

italiano - english
Unità di Ricerca
  • Universita' degli Studi di PADOVA
    Dip. SCIENZE BIOMEDICHE SPERIMENTALI, PADOVA (PD)
  • Universit¿ degli Studi di PADOVA
    CHIMICA BIOLOGICA, PADOVA (PD)
  • Universita' degli Studi di GENOVA
    Dip. MEDICINA SPERIMENTALE, GENOVA (GE)
  • Universita' degli Studi di BARI
    Dip. FARMACO BIOLOGICO, BARI (BA)
  • Universita' degli Studi di MILANO-BICOCCA
    Dip. BIOTECNOLOGIE E BIOSCIENZE, MILANO (MI)
  • Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati di TRIESTE
    Dip. SETTORE BIOFISICA, TRIESTE (TS)
  • Libera Universita' "Vita Salute S.Raffaele" MILANO
    Dip. MEDICINA E CHIRURGIA, MILANO (MI)
  • Universita' degli Studi di FERRARA
    Dip. MEDICINA SPERIMENTALE E DIAGNOSTICA, FERRARA (FE)
FIRB simili:
Classificazione scientifico-disciplinare
Classificazione brevettuale
  • CHEMISTRY; METALLURGY
    • BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
      • MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES OR MICRO-ORGANISMS (immunoassay G01N33/53); COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
      • MICRO-ORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF (biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, containing micro-organisms, viruses, microbial fungi, enzymes, fermentates or substances produced by or extracted from micro-organisms or animal material A01N63/00; food compositions A21, A23; medicinal preparations A61K; chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings, absorbent pads or surgical articles A61L; fertilisers C05); PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICRO-ORGANISMS (preservation of living parts of humans or animals A01N1/02); MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA (micro-biological testing media C12Q)
Classificazione geografica
Bibliografia
References

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59. Beltran B, Mathur A, Duchen M R, Erusalimsky J D and Moncada S, Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97, 14602-14607
60. Liu L and Stamler JS, Cell Death Differ (1999) 6, 937-942
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Parole Chiave
calcio; secondi messaggeri; biotecnologie; espressione genica; bioinformatica; proteomica

Il sistema di trasduzione del segnale Ca2+: dalle molecole alle funzioni

Università degli Studi di Padova
Abstract
Cambiamenti nella concentrazione di Ca2+ svolgono un ruolo universale nell'attivazione della cellula e numerosi meccanismi di trasduzione del segnale convergono alla fine in una via comune che conduce ad alterazioni dei livelli di Ca2+ cellulare. Inoltre il Ca2+ modula una serie di cascate enzimatiche distribuite a valle che successivamente cooperano alla regolazione di risposte cellulari. Sconvolgimenti nell'omeostasi cellulare di Ca2+ sono spesso la causa di importanti malattie umane e rappresentano uno degli eventi scatenanti che portano alla tossicità e morte cellulare.
Come descritto in dettaglio nelle sezioni successive, lo scopo di questa applicazione è di creare un network di gruppi di ricerca che, benché provenenti da esperienze ed istituzioni diverse, si occupano tutti dello studio di meccanismi che regolano il segnale di Ca2+ e/o dei processi che sono a valle del segnale stesso. Tutti questi gruppi si interessano dei vari campi di questa proposta e vi hanno già contribuito con sviluppi tecnologici e scientifici significativi. Un aspetto importante della loro partecipazione sarà pertanto l'accessibilità a queste nuove opportunità, offerta a tutti i gruppi, e lo sviluppo coordinato di ogni eventuale progresso tecnologico.Il progetto e' diviso in 5 workpakages ognuno dei quali e poi ulteriormente suddiviso in svariate attivita'. I primi due workpakages sono concentrati essenzialmente con lo sviluppo di nuove metodologie fluorescenti e/o chemiluminescenti per>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
TULLIO POZZAN, Universita' degli Studi di PADOVA
Obiettivo del Finanziamento
L'obiettivo generale del programma è di migliorare la nostra comprensione dei meccanismi di segnalazione del Ca2+ tramite lo sviluppo e l'utilizzo di nuovi approcci metodologici. La caratteristica che contraddistingue questo progetto è di integrare diversi gruppi di ricerca unendoli nel comune sforzo di utilizzare due diversi tipi di metodologie: DNA chip e spettroscopia di massa (ad alta resa, ma distruttivi) da un lato; metodi analitici e imaging di singola cellula dall'altro. Tramite questa combinazione di approcci complementari ci aspettiamo di approfondire la conoscenza dei meccanismi segnalazione del Ca2+, di importanza cruciale non solo in fisiologia ma anche in molte condizioni patologiche.
1. Sviluppo di nuovi strumenti per lo studio di secondi messaggeri intracellulari.
L'unità coordinata dal Dr. Pozzan si occuperà del miglioramento di nuove sonde molecolari (fluorescenti e chemiluminescenti) per lo studio dei secondi messaggeri a livello subcellulare. L'unità coordinata dal Dr. Rizzuto focalizzerà l'attenzione sullo sviluppo di nuove sonde per la misura di [ATP] in ristretti compartimenti del citoplasma o nello spazio pericellulare (ad esempio, in risposta a neurotrasmettitori o fattori di crescita). Gli stessi gruppi lavoreranno allo sviluppo di nuove sonde per la misura quantitativa dell'attivazione di isoforme di PKC durante l'attivazione cellulare. Il gruppo Pozzan, in collaborazione col gruppo Meldolesi (Dr. Clementi), raffinerà anche la in ristretti compartimenti del citoplasma o nello spazio pericellulare (ad esempio, in risposta a neurotrasmettitori o fattori di crescita). Gli stessi gruppi lavoreranno allo sviluppo di nuove sonde per la misura quantitativa dell'attivazione di isoforme di PKC durante l'attivazione cellulare. Il gruppo Pozzan, in collaborazione col gruppo Meldolesi (Dr. Clementi), raffinerà anche laL'obiettivo generale del programma è di migliorare la nostra comprensione dei meccanismi di segnalazione del Ca2+ tramite lo sviluppo e l'utilizzo di nuovi approcci metodologici. La caratteristica che contraddistingue questo progetto è di integrare diversi gruppi di ricerca unendoli nel comune sforzo di utilizzare due diversi tipi di metodologie: DNA chip e spettroscopia di massa (ad alta resa, ma distruttivi) da un lato; metodi analitici e imaging di singola cellula dall'altro. Tramite questa combinazione di approcci complementari ci aspettiamo di approfondire la conoscenza dei meccanismi segnalazione del Ca2+, di importanza cruciale non solo in fisiologia ma anche in molte condizioni patologiche.
1. Sviluppo di nuovi strumenti per lo studio di secondi messaggeri intracellulari.
L'unità coordinata dal Dr. Pozzan si occuperà del miglioramento di nuove sonde molecolari (fluorescenti e chemiluminescenti) per lo studio dei secondi messaggeri a livello subcellulare. L'unità coordinata dal Dr. Rizzuto focalizzerà l'attenzione sullo sviluppo di nuove sonde per la misura di [ATP] in ristretti compartimenti del citoplasma o nello spazio pericellulare (ad esempio, in risposta a neurotrasmettitori o fattori di crescita). Gli stessi gruppi lavoreranno allo sviluppo di nuove sonde per la misura quantitativa dell'attivazione di isoforme di PKC durante l'attivazione cellulare. Il gruppo Pozzan, in collaborazione col gruppo Meldolesi (Dr. Clementi), raffinerà anche la misura di cGMP e cAMP. La disponibilità di nuove sonde richiederà anche nuovi sviluppi di hardware e software per imaging di fluorescenza ad alta risoluzione. Specificamente, il gruppo Torre (Dr. Mammano) si prefigge di: i) customizzare elettronica commerciale per realizzare un sistema di video imaging capace di catturare immagini con risoluzione del megapixel a frequenza prossima ad 1 kHz (intervallo tra immagini circa 1 ms); ii) sviluppare software di controllo dedicato; iii) disegnare interfaccia utenti grafiche di semplice utilizzo ed orientate all'esperimento ed all'analisi delle immagini.
Infine, raffinando l'approccio basato sulla spettroscopia a perdita d'energia degli elettroni in microscopia elettronica, saranno ulteriormente migliore le tecniche di imaging per lo studio non solo del calcio libero ma anche del contenuto di calcio totale (Dr. Meldolesi). Intendiamo migliorare importanti dettagli della tecnica: la tecnologia del congelamento rapido; l'identificazione della miglior resina per il fissaggio; il software d'analisi delle immagini.
Nel complesso, questi sviluppi potenzieranno la nostra capacità d'indagare, a livello di cellula singola, la dinamica del calcio intracellulare e di altri secondi messaggeri ad esso strettamente correlati.
2. Microchip e spettroscopia di massa.
Lo sviluppo di microarray ad alta densità di geni analizzabili e capaci di fornire risultati più quantitativi fornirà importanti informazioni in grado di indirizzare studi futuri. Sarà in particolare possibile: 1. Scegliere accuratamente i geni la cui espressione va ulteriormente analizzata; 2. Utilizzare tecniche per la misura dei livelli di RNA e proteine per studiare prodotti genici d'interesse a livello di biologia cellulare. L'analisi dei geni attivati durante il ciclo cellulare, nel lievito e in cellule di mammifero, di quelli attivati dal Ca2+ in neuroni cerebellari, o nella retina e nella coclea, sarà grandemente semplificata dalle migliorie che proponiamo di apportare alla tecnologia corrente.
Ugualmente importanti per il progetto sono le metodologie di screening di proteine ad alto rendimento. L'introduzione della spettroscopia di massa ha aumentato drasticamente la sensibilità degli studi di sequenziamento proteico passando dalla purificazione chimica al livello di 2D-PAGE spot. Al momento tuttavia si tratta ancora di una procedura laboriosa che spesso non fornisce sufficienti informazioni sul campione analizzato. La nuova tecnica del nano-spray aumenterà da un lato la sensibilità complessiva del saggio di almeno 10 volte; dall'altro renderà possibile l'analisi di un numero molto maggiore di proteine presenti in preparati misti, fornendo informazioni utili anche a scopo comparativo.
3. Generazione e modulazione del segnale Ca2+.
Gli aspetti spazio-temporali del segnale Ca2+ sono di cruciale importanza per la regolazione cellulare e saranno studiati sia con le sonde molecolari già disponibili che con quelle da sviluppare. I gruppi Pozzan e Rizzuto si interesseranno principalmente di interscambio di segnali tra organuli (mitocondri e reticolo endoplasmatico), mentre i gruppi Pozzan e Torre (Dr. Mammano) studieranno la regolazione dell'influsso di Ca2+ attraverso il cosiddetto pathway capacitivo. Il meccanismo di generazione del cAPDR e la sua modulazione da parte del Ca2+ sono l'obiettivo principale dell'indagine condotta a Genova e Trieste. Un secondo obiettivo chiave è l'identificazione e la caratterizzazione dei tre trasportatori dinucleotidici che partecipano al traffico intra- ed extra-cellulare di NAD+ e cADPR al fine di sviluppare un composto a base di piombo capace di interferire con l'azione del cADPR e quindi di correggere molte patologie associate ad incorretta omeostasi del calcio. Il modello dell'oocita, d'altronde, permetterà di separare I contributi dei tre secondi messaggeri (InsP3, cADPR e NAADP) nella modulazione del segnale Ca2+ che controlla maturazione e fertilizzazione. Nello specifico, l'unità Carafoli (Dr. Santella) vuole chiarire il ruolo di NAADP nell'innesco della risposta agli altri due messaggeri. La comunicazione intercellulare basata sul Ca2+ costituisce uno dei principali meccanismi d'interscambio di segnali tra cellule del sistema nervoso. Il gruppo di Milano (Dr. Matteoli) studierà i meccanismi mediati dal calcio che sono coinvolti nella comunicazione tra astrociti ed altri tipi cellulari del sistema nervoso centrale. A tal fine si realizzerà anche una collaborazione strategica tra i gruppi De Flora e Torre (Dr. Mammano) data l'importanza delle connessine nella comunicazione intercellulare sia diretta che mediata da stimoli paracrini locali (ATP, cADPR).
4. Interscambio tra pathways di comunicazione.
Gli esperimenti sull'interscambio tra NO e Ca2+ si baseranno su un approccio rivoluzionario: abbiamo generato cellule HeLa che esprimono NOS III in modo condizionale. Ciò consente la produzione fisiologica di NO in vari compartimenti subcellulari che ospitano tale enzima. Inoltre utilizzeremo nuove sonde per Ca2+ capaci di misurare Ca2+ in vari organelli con elevata sensibilità in combinazione con un nuovo sistema di FRET misurare la produzione di cGMP. Ciò permetterebbe una chiara definizione dell'interscambio tra Ca2+ e NO/cGMP, generati in modo endogeno, in ciascun comparto subcellulare fornendo anche informazioni utili per interpretare il ruolo dell'interscambio NO/Ca2+ nella modulazione di apoptosi e ciclo cellulare, alle quali entrambi sono noti prendere parte.
Quanto ad interscambio tra ca2+ e cAMP, la loro reciproca regolazione è nota da tempo. Gli enzimi che producono e degradano cAMP (nove isoforme di AC e circa 30 forme di PDE) sono attivati o inibiti dal Ca2+. Similmente, le fosforilazioni dipendenti da cAMP possono modulare il segnale Ca2+. In questo progetto studieremo due aspetti fondamentali dell'interscambio tra ca2+ e cAMP a livello di singola cellula: 1. Il ruolo dell'influsso di Ca2+ rispetto a quello del rilascio intracellulare e l'attivazione/inibizione della diverse forme di AC; 2. L'effetto di cAMP sulla distribuzione spaziale del segnale Ca2+ e, segnatamente, dell'interscambio tra mitocondri e reticolo endoplasmatico.
5. Bersagli del segnale Ca2+: organelli.
I mitocondri sono un bersaglio chiave del segnale Ca2+. Variazioni della concentrazione citoplasmatica di Ca2+ sono correlate quasi invariabilmente con consumo energetico che dev'essere compensato da produzione d'energia. L'attivazione Ca2+-dipendente della sintesi mitocondriale di ATP è pertanto un evento tanto vitale quanto, sinora poco conosciuto. In questo contesto perseguiremo due obiettivi principali: il gruppo Rizzuto, usando lo screening a doppio ibrido, intende isolare le proteine della membrana esterna dei mitocondri che partecipano al controllo della morfologia di questi organelli (esempio, fzo) o alla permeazione ionica (esempio, VDAC). Le conseguenze funzionali della sovraespressione o eliminazione di queste proteine consentirà di chiarire il ruolo dell'interazione tra reticolo endoplasmatico e mitocondri nella trasmissione del segnale Ca2+ a questi ultimi.
Quanto alle proteine mitocondriali bersaglio del Ca2+, lo scopo principale del gruppo Palmieri è quello di chiarire il ruolo di ?aralar? e ?citrin? nella trasduzione del segnale Ca2+ dal citosol ai mitocondri. Queste due proteine possiedono classici siti di legame per Ca2+ sotto forma di mani EF e sono attivate da variazioni di concentrazione di Ca2+ nello spazio intermembrana. Un secondo obiettivo perseguita dal medesimo gruppo consiste nell'identificare la funzione di nuovi trasportatori mitocondriali capaci di legare Ca2+. A questo scopo saranno scrutinate basi di dati per membri della famiglia dei trasportatori mitocondriali la cui struttura contiene motivi capaci di legare Ca2+ (esempio, il clone non identificato umano BC001656). Marcatori di sequenze parziali espresse (EST) saranno ampliati. Le sequenze codificanti per trasportatori mitocondriali sconosciuti che legano il Ca2+ saranno clonate ed espresse in batteri e sistemi umani allo scopo di identificarne la funzione. Intendiamo con ciò identificare e fornire una caratterizzazione funzionale per talune componenti del meccanismo di controllo del Ca2+ in questi organelli.
Nessun altro fenomeno regolato dal Ca2+ ha attratto un'attenzione pari a quella riservata dalla comunità scientifica alla regolazione della secrezione. Sino a poc'anzi, il ruolo del Ca2+ nell'esocitosi in neuroni e cellule neurosecretorie si riteneva limitato alla scarica di vescicole chiare e dense. Ora si riconosce un ruolo più vasto, e tuttavia poco si sa ancora dell'esocitosi di altri organelli, tra cui vescicole chiare di astrociti; vescicole neuronali contenenti fattori di crescita; ed una nuova classe di vescicole apparentemente coinvolta nella differenziazione. Questo progetto intende far luce su tali processi, per renderli disponibili ad approcci di biologia molecolare. Il ruolo di queste vescicole sembra infatti essenziale in molti processi chiave della vita cellulare tra cui: plasticità sinaptica, sopravvivenza, sviluppo e riparazione di neuroni.
6. Bersagli del segnale Ca2+: espressione genica.
L'espressione genica è uno dei principali bersagli del segnale Ca2+ generato o dall'attivazione di canali della membrana plasmatica o dal rilascio da depositi intracellulari. Tra questi si annoverano i geni precoci coinvolti nella modulazione del ciclo cellulare e/o in specifiche funzioni cellulari.
Il gruppo Torre intende studiare le variazioni dell'espressione genica indotti dalla stimolaione sensoriale prolungata utilizzando come modello tre sistemi sensoriali: retina, epitelio olfattivo e coclea di ratto e topo. Usando la tecnologia dei DNA chips, si studieranno le variazioni di livello dell'espressione genica in svariate condizioni sperimentali modificando la durata e/o specifici parametri della stimolazione. Studi di profilo genico saranno condotti nel sistema uditivo ed applicati al problem socialmente rilevante d'identificare geni espressi differenzialmente dopo trauma da rumore. Per analizzare l'immane mole di dati prodotti con queste metodologie saranno sviluppati strumenti appropriati in collaborazione con ricercatori del Settore di Stato Solido della SISSA. Il gruppo Carafoli studierà i meccanismi tramite cui variazioni della concentrazione basale di Ca2+ modulano l'espressione dei diversi trasportatori del Ca2+ in colture primarie di cellule dei granuli del cervelletto, ampiamente utilizzate come modello per i meccanismi di sopravvivenza neuronale.
7. Ca2+ e patologia.
Si è oramai chiarito che la morte cellulare può essere innescata dall'attivazione di una pletora di recettori di membrana, alcuni dei quali sono canali ionici permeabili al Ca2+ (ad esempio, recettori NMDA e P2X), e coinvolge una complessa rete comprendente mitocondri, reticolo endoplasmatico e nucleo. Studieremo le modalità con cui recettori P2X e membri della famiglia Bcl-2 alterano l'omeostasi ionica del citoplasma e degli organelli partecipando ai complessi mutamenti metabolici che precorrono la morte cellulare. Chiariremo inoltre se e come specifiche isoforme di caspasi attivate da eccitotossine attivano/inibiscono i sistemi di pompaggio del Ca2+.
Vogliamo altresì chiarire sotto quali condizioni avviene la transizione da morte per apoptosi e per intossicazione. I due gruppi principalmente interessati a queste ricerche sono Rizzuto e Carafoli.
La comprensione dei meccanismi tramite cui mutazioni di connessine inducono alcune comuni patologie umane risulterà dallo sforzo congiunto di ricercatori appartenenti a tre gruppi: Trieste (Torre-Mammano), Padova (Pozzan-Bruzzone) e Genova (De Flora-D'Andrea). Il compito è quello di stabilire a qual punto mutazioni funzionali delle connessine associate a malattie ereditarie alterano le caratteristiche delle giunzioni gap e la loro capacità di scambiare secondi messaggeri, ripercuotendosi sulla segnalazione intercellulare. Ci s'attende che questi studi in vitro contribuiscano a migliorare la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della segnalazione mediata dal Ca2+ e della loro possibile relazione con malattie genetiche imputate a mutazioni di connessine.]>>>

Durata
36 mesi