RICERCA ITALIANA     

Genomica e Proteomica nello studio di funzioni cellulari complesse(GAP).

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Definire il significato delle sequenze nucleotidiche di genomi interi è un problema biologico. È oggi disponibile una gran quantità di dati di sequenza, ottenuti a partire dai genomi di moltissimi organismi,la cui interpretazione è compito complesso. Proponiamo un insieme integrato di approcci per colmare questo GAP, per affrontare i vari aspetti della logica postgenomica e sviluppare le metodologie e le tecnologie necessarie. Proponiamo, in una pura prospettiva post-genomica,
(a) studi ologenomici. In particolare:
- analisi ologenomiche di espressione genica in ampi gruppi di geni trascritti da RNA polimerasi I, II e III,
- analisi ologenomiche di popolazioni proteiche,
- analisi ologenomiche degli effetti delle modificazioni post-traduzionali delle proteine.
(b) Studi focalizzati sulla determinazione delle strutture proteiche e delle interazioni proteina-proteina saranno eseguiti su macromolecole a funzione centrale in sistemi genetico-fisiologici ad ampio spettro.
Questi studi saranno rilevanti per sé e nella scoperta di regole generali, attraverso analisi comparative. Lo studio viene affrontato da 8 Unità Operative, indicate e numerate secondo l'ORDINE LOGICO DELLA CONCATENAZIONE DEGLI ARGOMENTI ( e non l'ordine amministrativo-burocratico della tabella 1.10).
UR # 1 DI MAURO, UR # 2 OTTONELLO,UR # 3 VINDIGNI,
UR# 4 PLEVANI, UR # 5 LUCCHINI, UR # 6 FRONTALI,
UR # 7 DI SEGNI, UR # 8 TSERNOGLOU.
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Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

ERNESTO DI MAURO, Universita' degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Finanziamento

La piena comprensione della massa di dati prodotti dalla determinazione di interi genomi e forniti dalle analisi in corso sui profili di espressione ologenomica richiede la determinazione (i) delle integrazioni funzionali tra geni, (ii) delle interazioni tra i loro prodotti. Abbiamo pianificato un insieme coerente di approcci e di sistemi modello integrati allo scopo di rispondere a questa necessità.
L'attenzione sarà rivolta alle funzioni cellulari più rilevanti: 1) SCHEMI DI TRASCRIZIONE A LARGO SPETTRO, 2) VIE E FUNZIONI GENETICHE COINVOLTE NELLA REPLICAZIONE, RIPARAZIONE, SEGREGAZIONE DEL GENOMA E NEL CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE, 3) SISTEMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE, rapportati soprattutto ai collegamenti tra regolazioni della trascrizione ed ai controlli del ciclo cellulare, 4) FUNZIONI DEL PROTEASOMA, un quasi-organello multiproteico, nel regolare il flusso delle popolazioni proteiche.
Gli approcci sperimentali che verranno usati si basano sia su conoscenze e capacità genetiche altamente sviluppate, sia su tecnologie d'avanguardia (quali: analisi microarrays di espressioni genetiche a livello ologenomico, analisi ologenomiche di espressione proteica e di pattern di modificazioni epigenetiche, tecniche innovative sviluppate a partire dalla analisi di microarrays) (Vedi Sez. 3.3). Molte tra le proteine dotate di centrali funzioni regolative a largo spettro e di ruoli generali di attivazione, oggetto di studio nei sistemi modello considerati intendiamo cercare legami, importanti ma ancora elusivi, tra la regolazione degli RNA ribosomali e quella delle proteine ribosomali che, nel loro insieme, assommano a più di 2/3 delle sintesi macromolecolari in cellule di crescita esponenziale (1).
Elementi comuni ai due sistemi genici sono non solo componenti della famiglia SIR e Rap1; sono anche gli effettori di natura globale, quali la DNA topoisomerasi I e gli istoni. Un ulteriore elemento di questa ampia strategia diretta a districare le connessioni esistenti tra le funzioni cellulari principali è rappresentata dai telomeri. I telomeri sono i siti nei quali è posta gran parte delle copie cellulari delle proteine Rap1 e SIR; le loro peculiarità fisiche, genetiche e di organizzatori di cromatina sono state studiate intensamente [per i contributi dei componenti di questa UR e altre Refs, vedi (8 e Refs) e (9 e refs)]; sono strettamente legate al ciclo cellulare, ai meccanismi di replicazione, alla stabilità genetica, a proprietà di invecchiamento e longevità, fornendo quindi stretti legami con gli studi programmati dalle UR # 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Effettori globali saranno studiati nelle loro correlazioni, sia attraverso lo studio per microarrays dei profili di espressione genica che attraverso la determinazione delle variazioni globali dei profili proteici. Come esempio: l'effettore globale DNA topoisomerasi I (10, 82,83) sarà studiato sia nei suoi effetti sulle sintesi ribosomali che sugli ampi profili di geni trascritti dalla RNA polimerasi II e sui profili genici tipicamente correlati con il ciclo cellulare, la riparazione e la sintesi del DNA (in connessione con le UR # 2,3,4,5,6, 7 e 8). Studi analitici e comparativi simili saranno svolti su altri effettori globali quali: SIRs, Adr1, Rap1, mutanti istonici, proteine che influenzano i profili di modificazione proteica epigenetica e covalente. Contributi recenti della UR # 1 a questi argomenti sono in 2,3,8,11-29.
2) ANALISI OLOGENOMICHE DELLA ESPRESSIONE GENICA IN SISTEMI UNIFICANTI.
Queste analisi verranno eseguite nei geni di Classe III, trascritti dalla RNA polimerasi III. Questo sistema è particolarmente adatto a studi ad ampio spettro poiché i) i complessi trascrizionali che operano sui geni di classe III sono straordinariamente stabili ed efficienti, e in grado di dirigere eventi multipli di inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi III ; inoltre, l'enzima stesso può reiniziare più volte sullo stesso gene senza dissociarsi (30). Queste caratteristiche di "iper-processività", che si traducono in un'occupazione continua -e topologicamente non inerte- delle unità trascrizionali conferiscono a queste ultime la capacità di influenzare altri processi nucleari apparentemente non correlati. ii) I geni di classe III sono organizzati in famiglie multigeniche i cui membri, anche quando dispersi nel genoma, presentano sequenze codificanti identiche, possibili siti di frequente ricombinazione. iii) In S. cerevisiae è stato dimostrato che i tDNA svolgono ruoli "posizionali" nell'ambito di interazioni genomiche complesse. In particolare, essi possono influenzare in modo determinante eventi di retrotrasposizione di elementi Ty, possono provocare il blocco temporaneo di forche replicative, agiscono come siti di riorganizzazione dei nucleosomi o di blocco alla propagazione di strutture eterocromatiniche silenti, possono esercitare un effetto repressivo sulla trascrizione di geni adiacenti da parte della RNA polimerasi II. La quasi totalità di questi effetti richiede che il tDNA coinvolto sia in uno stato di attiva trascrizione. I geni di classe III possono quindi essere visti come "hot spots" trascrizionali in grado di influenzare l'organizzazione, la stabilità e l'espressione del genoma. Le possibili implicazioni di questo ruolo extra-codificante sono tanto più significative se si pensa all'elevatissimo numero di sequenze di classe III (ad es. le cosiddette tRNA-like SINES o le sequenze Alu derivate dall'RNA 7SL) presenti nel genoma umano sotto forma di elementi ripetuti e dispersi. Altri sistemi particolarmente interessanti per la loro capacità di influenzare una vasta gamma di processi genomici sono i macchinari multiproteici adibiti al riparo del DNA. Le regioni danneggiate, infatti, agiscono come veri e propri siti di nucleazione di complessi di riparo in grado di innescare vie intranucleari di trasduzione del segnale, che conducono ad una risposta cellulare al danno stesso. Per riferimenti bibliografici, (v. 30-45).
Nel presente progetto, intendiamo studiare queste due categorie di complessi nucleoproteici - "HOT SPOT" TRASCRIZIONALI RNA polimerasi III-dipendenti e MACCHINARI DI RIPARAZIONE DEL DNA - soprattutto dal punto di vista delle loro interazioni con altri processi ed apparati multiproteici nucleari. Per ulteriori dettagli e per la pianificazione sperimentale, vedi RU # 2, 4 and 5. Questi studi, pur caratterizzati da approcci leggermente differenti, saranno accomunati dallo sviluppo e dalla applicazione di una nuova strategia di "crosslinking" in vivo seguito dalla purificazione di specifici frammenti cromatinici mediante l'impiego di acidi peptido-nucleici (PNA) come descritto in dettaglio nella sezione 3.3.
3) CONTROLLO DELLA REPLICAZIONE, RIPARAZIONE E SEGREGAZIONE DEL DNA:
Tre unità sono impegnate in modo esclusivo nello studio dei complessi meccanimi coinvolti nel metabolismo del DNA e nella segregazione cromosomica: UR # 3 (Vindigni), UR # 4 (Plevani), UR # 5 (Lucchini). Le UR # 2 e 6 affronteranno problemi connessi ai meccanismi di riparazione (UR # 2) e di controllo del ciclo cellulare, connessi alle funzioni del Proteasoma (UR # 6) e del sistema trascrittivo RNA polIII (UR # 2). Nel suo insieme questo Gruppo di Unità di Ricerca affronterà al livello più avanzato tutti gli aspetti genetico-regolativi del metabolismo del DNA. L'attenzione maggiore è rivolta al corredo proteico del sistema, sottolineando gli aspetti proteomici del sistema replicativo. La UR # 3 ha recentemente identificato e caratterizzato a livello nucleotidico l'origine di replicazione Lamin B2 umana. Anche a seguito di questa scoperta gli studi verranno focalizzati sulla IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DELLE PROTEINE CHE SI LEGANO A QUESTA ORIGINE DI REPLICAZIONE e sulla descrizione della attività elicasica che svolge attivamente la doppia elica. L'identificazione del complesso proteico associato a questa origine di replicazione fornisce indicazioni nuove alla comprensione del meccanismo che controlla la REPLICAZIONE DEL DNA NELL'UOMO.
Con il progetto della UR # 4 ci proponiamo:
1. La ricerca di nuovi geni di checkpoint e definizione delle interazioni proteina-proteina coinvolte nella risposta cellulare a danni al DNA con il metodo del doppio ibrido ed approcci di proteomica.
2. La identificazione delle proteine che sono fosforilate in risposta a Double Strand Breaks (DSB) e ad altri agenti genotossici e che vengono modificate durante il processo di adattamento.
3) Lo studio del ruolo del checkpoint nel controllare la stabilità delle forche di replicazione.
Questa UR ha recentemente conseguito risultati molto rilevanti sulla DINAMICA DELLA REPLICAZIONE DEL DNA (46-50) e sulla sua regolazione. Una descrizione della linea sperimentale che si intende proporre in prospettiva post-genomica è riportata in maggior dettaglio nella sezione 3.2, dopo le indispensabili premesse.
La UR # 5 focalizza la propria attenzione sui complessi meccanismi di risposta cellulare ai danni del DNA ed all'APPARATO MITOTICO. Scopo di questo progetto è contribuire a chiarire alcuni dei molti punti ancora oscuri dei complessi pathways di trasduzione del segnale, detti checkpoints, conservati in tutti gli eucarioti finora studiati, che monitorano il corretto completamento degli eventi del ciclo cellulare ed eventualmente ritardano la progressione del ciclo in caso di alterazioni del DNA (checkpoints del DNA) o dell'apparato mitotico (checkpoints mitotici) finché gli errori non sono stati rimossi, assicurando così la corretta successione temporale delle diverse fasi e la stabilità genetica di una linea cellulare (V. Sez. 3.2 e UR # 5). I diversi approcci programmati in S. cerevisiae, largamente interconnessi, possono essere elencati come segue:
A) localizzazione subcellulare degli omologhi di lievito di ATM ed ATR umani, Mec1 e Tel1 e del loro putativo regolatore Ddc2.
B) Ruoli ed interazione di Te11, Mec1 e Ddc2 nel controllo della lunghezza dei telomeri.
C) Modificazioni post-traduzionali della proteina del checkpoint del cinetocore Mad3.
D) Ricerca di fattori coinvolti nella stabilità del fuso mitotico.
E) Controllo dell'allungamento del fuso mitotico in presenza di molecole di DNA non completamente replicate.
Questi studi focalizzano gli aspetti correlativi tra checkpoints, metabolismo del DNA e processi mitotici esplorando nuove componenti proteomiche complesse. Il coinvolgimento di molte proteine di checkpoint nel controllo della lunghezza dei telomeri (punto B) verrà studiato in collaborazione con le analisi di REGOLAZIONE GENETICA TELOMERICA programmate dalla UR # 1. Per Referenze, v. 51-66.
4) LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE verrà studiata specificamente in due sistemi modello di portata generale:
IL PROTEASOMA (UR # 6) e un sistema innovativo dei "due ibridi" basato sui recettori accoppiati alle G-proteine (UR # 7). Al ruolo centrale del proteasoma nei meccanismi generali della cellula abbiamo accennato in precedenza. L'approccio specifico allo studio dei suoi rapporti in numerosi processi metabolici che proponiamo è di tipo genetico-molecolare. La identificazione di mutanti specifici di funzioni proteasomiche (v. programma della UR # 6) permette di pianificare una analisi dei rapporti proteasoma-ciclo cellulare, proteasoma-apparato di trascrizione, proteasoma-risposta al danno da radiazioni, proteasoma-apparato di modificazione della cromatina e/o acetilazione.
Il progetto della UR # 7 tende, a partire da osservazioni originali, allo sviluppo e applicazione di un nuovo sistema dei "due ibridi" per lo studio delle interazioni fra proteine citoplasmatiche basato sui recettori accoppiati alle G-proteine. Tale sistema è caratterizzato dalla possibilità di saggiare interazioni fra proteine citoplasmatiche senza la necessità di aggiungere a queste segnali speciali per farle penetrare nel nucleo cellulare, come è necessario fare con il sistema dei due ibridi convenzionale basato sull'attivazione della trascrizione.
5) MODELLI DI STUDI STRUTTURALI
La determinazione della struttura delle proteine è uno dei compiti maggiori che la proteomica dovrà affrontare ed è di fondamentale importanza nella interpretazione della organizzazione delle sequenze del DNA. La ricerca di strutture proteiche comuni, di motivi conservati o evoluti in parallelo, di meccanismi di scambio, è orientata non solo verso la comprensione delle strutture proteiche per sé: i suoi risultati saranno indispensabili nella interpretazione delle strutture dei geni a livello del DNA e della organizzazione dei genomi. La base di partenza per il nostro approccio agli studi di BIOLOGIA STRUTTURALE è schematizzato nella Sezione 3.2. Le proteine che rivestono il ruolo di sistemi modello e che saranno studiate dalla UR # 8 (totalmente dedicato alla biologia strutturale) e da parte della UR # 3 sono descritte nei programmi rispettivi e sono parte integrante dei progetti delle UR # 1,2 e 3. I risultati saranno estesi quali paradigmi metodologici ai progetti delle altre UR.]>>>

Durata

36 mesi