RICERCA ITALIANA     

Canalopatie genetiche: identificazione di marcatori molecolari e loro funzione, sviluppo di sistemi diagnostici avanzati e identificazione di bersagli farmacologici.

Centro San Raffaele del Monte Tabor

Abstract

La presente proposta si propone di comprendere il ruolo dei canali ionici in alcune patologie avvalendosi della collaborazione di un insieme di metodi, complementari tra loro, e di risorse che nel loro insieme creeranno una importante sinergia scientifica. Al centro della proposta è la identificazione di nuovi geni malattia e di marcatori molecolari, la determinazione del loro ruolo fisiopatologico e del potenziale farmaco-terapeutico. Tra i nostri più ambiziosi obiettivi ricordiamo lo sviluppo di nuovi e affidabili protocolli diagnostici e l'identificazione di nuove strategie terapeutiche. Questi obiettivi potranno essere raggiunti solo grazie alla collaborazione coordinata dei partecipanti a questo progetto, poiché ognuno possiede specifiche competenze per lo studio dei canali ionici in discipline diverse. Il nostro lavoro sarà focalizzato sullo studio di alcuni canali ionici, alcuni voltaggio-dipendenti (sodio, calcio, potassio, cloro) altri ligando-dipendenti (recettori della rianodina ed acetilcolina), già associati a patologie del muscolo scheletrico (Miotonia, Paralisi Periodica), cardiache (Sindrome di Brugada, Tachicardia Ventricolare Polimorfa Catecolaminergica), neurologiche (Epilessia, Emicrania Emiplegica Familiare, Atassia Episodica di tipo 2, Atassia Spino Cerebellare di tipo 6), e pancreatiche (Diabete Mellito di tipo 2).
Attaccheremo questi problemi cercando di identificare nuovi geni malattia in quelle canalopatie che mostrano eterogeneit>>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

MAURIZIO FERRARI, IRCCS OSPEDALE S.RAFFAELE

Obiettivo del Finanziamento

La presente proposta si propone di comprendere il ruolo dei canali ionici in alcune patologie avvalendosi della collaborazione di un insieme di metodi, complementari tra loro, e di risorse che nel loro insieme creeranno una importante sinergia scientifica. Il ruolo fisiopatologico, il potenziale terapeutico, e lo sviluppo di nuovi strumenti di diagnosi avanzata sono i temi centrali che questo progetto intende affrontare, allo scopo di delucidare questo importante capitolo delle canalopatie genetiche che includono, tra le altre, anche malattie ad alto impatto socio-economico.
Verranno applicate molte tecnologie innovative allo scopo a) di identificare nuovi geni malattia e di caratterizzarne il difetto, b) di sviluppare metodi diagnostici avanzati utili in molte canalopatie, per stabilire una correlazione tra la mutazione e la risposta ai farmaci. Anche se dapprima questo studio avrà un impatto più importante su un numero relativamente ristretto di pazienti, le sue implicazioni potranno andare oltre le attuali conoscenze sulle canalopatie già note, e riguardare patologie più comuni quali l'emicrania e il diabete.
I canali ionici sono presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche. Numerose classi o famiglie di canali ionici sono state definite, tra esse ricordiamo le famiglie dei canali la cui operatività può essere ligando- o voltaggio-dipendente.
In tutte queste famiglie di canali, possono essere identificate caratteristiche strutturali e funzionali causano la sindrome del QT lungo nell'uomo ma epilessia nella Drosophila). In ogni caso tale diversità rende più complesso lo studio ed il confronto tra modelli umani ed animali.
Indichiamo i nostri principali obiettivi e le linee di ricerca incentrate su numerose patologie ereditarie associate a mutazioni in canali ionici:
Canalopatie genetiche del muscolo scheletrico. Mutazioni in alcuni geni che codificano per canali del Sodio (SCN4A), del Cloro (CLCN1), del Calcio (CACNL1A3), del Potassio (KCNE3 e KCNJ2) espressi nel muscolo scheletrico sono responsabili di numerose malattie ereditarie, che sono trasmesse come caratteri dominanti o più raramente recessivi. Le mutazioni generalmente missenso modificano la biofisica del canale interessato, portando sia ad un "gain-of-function", sia ad un "loss-of-function", e risultano nell'ipereccitabilità (miotonia) e/o nell'ineccitabilità del sarcolemma (paralisi). E' importante anche ricordare l'esistenza di fattori biofisici e biochimici, quali l'esercizio, i livelli di potassio, il freddo, etc…, che con meccanismi ancora del tutto sconosciuti scatenano le crisi miotoniche o paralitiche. Ci proponiamo di valutare l'esistenza di nuove mutazioni in pazienti miotonici (canali del cloro e canali del sodio) ed in pazienti con paralisi periodica (canali del sodio, canali del calcio, canali del potassio). Il canale mutato sarà poi studiato in sistemi di espressione eterologa o, quando possibile, in biopsie umane, al fine di identificarne le alterazioni biofisiche e chiarire la relazione genotipo-fenotipo clinico con importanti risvolti diagnostici e terapeutici. Infatti, studi mirati alla caratterizzazione biofisica e farmacologica dei canali normali e mutati permetteranno lo sviluppo di molecole in grado di modularne la cinetica, allo scopo di ottenere farmaci genotipo-specifici con chiari vantaggi verso la terapia puramente sintomatica attualmente in uso. La relativa rarità di queste patologie e le difficoltà da superare prima di ottenere una terapia genica efficace fanno della terapia farmacologica l'unica speranza dei pazienti al momento.
Canalopatie genetiche del muscolo cardiaco. Patologie aritmogene ereditarie. Attraverso un approccio multidisciplinare ci proponiamo di caratterizzare i rapporti genotipo-fenotipo a livello clinico e cellulare, e la fisiopatologia del danno genetico indotto dalle mutazioni causa di patologie aritmogene ereditarie. La comprensione dei meccanismi che possono condurre a morte improvvisa gli individui affetti e la definizione di potenziali nuovi target molecolari o funzionali sono elementi cruciali per lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. In particolare, nell'ambito di questo progetto saranno ricercati e studiati nuovi difetti genetici a carico del canale del sodio cardiaco, SCN5A e del recettore della Rianodina, RyR2. L'identificazione di un numero sempre maggiore di mutazioni a carico di SCN5A ha permesso di dimostrare che i rapporti struttura-funzione delle mutazioni a carico del canale del sodio cardiaco siano molto più complessi di quanto precedentemente ritenuto. In particolare si è evidenziata l'esistenza di mutazioni che presentano caratteristiche biofisiche che giustificano dei fenotipi clinici di sovrapposizione tra le manifestazioni elettrocardiografiche della Sindrome di Brugada e della Sindrome del QT lungo. Solo recentemente è stato evidenziato che alterazioni genetiche di un canale ionico intracellulare (RyR2) possono causare una malattia aritmogena ereditaria, la CPVT. Di conseguenza ad oggi, sono disponibili solo informazioni indirette sulle conseguenze fisiopatologiche a livello cellulare e tessutale delle mutazioni.
Canalopatie genetiche neuronali. Le altrazioni dei canali neuronali sono implicate in dicerse patologie, da quelle epilettiche, a quelle neurodegenerative, a quelle emicraniche. Patologie epilettiche. Mutazioni in diversi canali ionici sono state implicate in alcune forme ereditarie di Epilessia; tuttavia non sono ancora stati identificate le basi genetiche delle forme più comuni di questa patologia. I nostri studi aiuteranno a comprendere la complessità genetica delle epilessie ereditarie quali le Convulsioni Benigne Neonatali Familiari (BNFC) e le Convulsioni Infantili Benigne Familiari (BFCI). I geni alterati nella BNFC codificano per due subunità di canali del K+, KCNQ2 e KCNQ3. La nostra ricerca verrà focalizzata sulla identificazione di nuove mutazioni e di nuovi geni associati alla BNFC, sullo studio delle proprietà funzionali dei mutanti identificati, sul chiarimento dei meccanismi con cui le mutazioni causano un'alterazione della funzione del canale. riguarda Si cercherà inoltre di chiarire i processi fisiologici che regolano l'espressione e la funzione del canale KCNQ2/KCNQ3, nonché dei processi fisiopatologici nei quali tale canale sembra giocare un ruolo determinante, quali la regolazione della corrente M da parte del sistema pKA-cAMP; le proprietà elettrofisiologiche e farmacologiche dei circuiti neuronali; il coinvolgimento di KCNQ2 nella regolazione presinaptica della liberazione di neurotrasmettitori cerebrali; e ancora, il ruolo di KCNQ2 nel processo di morte apoptotica neuronale, infatti l'attivazione di canali del potassio sembra essere una tappa cruciale in molti modelli sperimentali di morte neuronale apoptotica. Infine, valuteremo la modulazione farmacologica della IM da parte di farmaci dotati di attività antiepilettica o neuroprotettiva. Un aumento delle correnti mediate da canali KCNQ2/KCNQ3 sembra costituire il meccanismo d'azione di farmaci antiepilettici quali la retigabina. Tale studio fornirà importanti correlazioni farmacogenetiche tra la sensibilità a farmaci e la specifica mutazione, che potrebbero implementare strategie terapeutiche innovative genotipo-specifiche.
Per le Convulsioni Infantili Familiari Benigne (BFCI), un gene malattia non è stato ancora identificato, sebbene il decorso clinico e le analogie della BFCI con la BNFC lascerebbero supporre il coinvolgimento di un canale ionico. Verrà pertanto approfondito lo studio di tali pazienti, per giungere all'identificazione di un gene malattia responsabile di BFCI.
L' Epilessia Frontale Notturna (ADNFLE) è geneticamente eterogenea essendo causata da mutazioni in almeno almeno tre loci: il primo locus (ENFL1) localizzato sul cromosoma 20q13.2 corrisponde alla subunità alpha 4 del recettore dell'acetilcolina nicotinico neuronale CHRNA4. Un secondo locus ENFLE2 è stato identificato sul cromosoma 15q24. Il terzo locus ENFLE3 è stato di recente identificato grazie alla collaborazione delle UO Annesi e Wanke, e codifica per la subunità beta 2 del recettore nicotinico neuronale. Due nuove famiglie calabresi, i cui soggetti affetti da ADNFLE non presentano le mutazioni descritte in letteratura, verranno caratterizzate mediante la ricerca di mutazioni. Studi funzionali aiuteranno a comprendere la fisiologia dei recettori nicotinici cerebrali, oggi ancora dibattuta. Le convulsioni febbrili plus (GEFS+) sono epilessie generalizzate con convulsioni febbrili complesse, recentemente associate a mutazioni nei geni SCN1A e SCN1B, Il coinvolgimento di questo o di altri geni in nuovi casi familiari di GEFS+ e l'analisi funzionale dei mutanti osservati sono tra gli obiettivi perseguiti.
Per le forme di «absence epilepsy» esistono alcuni mutanti spontanei di topo, «tottering, leaner, lethargic e stargazer», che portano mutazioni in geni per subunità alfa1A dei canali del calcio. Oltre al fenotipo epilettico, essi presentano degenerazione cerebellare e atassia. Nell'uomo, solo recentemente sono state descritte mutazioni nei geni CACNB4 e CACNA1A del canale del calcio in associazione a epilessia mioclonica o a un fenotipo complesso con epilessia e Atassia Episodica di tipo 2 (EA-2). Famiglie con epilessia mioclonica e con diversi tipi di epilessia associati a segni cerebellari verranno studiate per approfondire il coinvolgimento dei geni sopraindicati in questo tipo di patologia.
Patologie neurodegenerative ed emicraniche. Il gene CACNA1A, che codifica per la subunità alfa1A del canale di tipo P/Q, era già stato associato all'EA-2, alla Emicrania Emiplegica Familiare (FHM) e all'Atassia Spinocerebellare di tipo 6 (SCA6). Si è inizialmente ipotizzato che differenti classi di mutazioni causassero queste malattie alleliche: le mutazioni «missense» nella FHM, le «frameshift» nella EA2, e quelle dovute all'espansione del numero di triplette CAG nella SCA6. Questa distinzione ha oggi meno forza in quanto pazienti con FHM hanno in alcuni casi atassia progressiva e che mutazioni «missense» sono state trovate anche in pazienti con EA-2 o SCA6 ed espansioni CAGn sono state identificate in pazienti con EA-2. In queste patologie non è stato ancora chiarito se esista per tutte tre le patologie coinvolte una disfunzione dei canali o se le espansioni del tratto ripetuto in SCA6 svolgano un'azione tossica come nelle patologie da poliglutamine, piuttosto che un'alterazione del canale ionico.Ma anche nel caso delle mutazioni puntiformi la correlazione tra la malattia e il tipo di disfunzione del canale è ancora da chiarire. Per FHM ed EA-2 ad esempio, non e' ancora notoo quale sia esattamente il tipo di anomalia funzionale dei canali Ca2+ che le mutazioni identificate determinano, se vi sia un concomitante alterato rilascio di neurotrasmettitori, o una anomala modulazione da parte di messaggeri secondari. Inoltre, rimangono molte domande aperte sullo spettro delle mutazioni del canale del calcio alfa1A, sulla correlazione con la importante variabilità clinica osservata, sul ruolo delle diverse isoforme della proteina, sulla possibilità che il canale alfa1A mutato possa influenzare l'espressione di altri canali del calcio, sulla possibilità che anche forme piu' comuni di emicrania siano associate a geni per canali del calcio. Ci sembra importante rispondere a queste domande sia perchè l'emicrania è una malattia molto comune (5-15%) della popolazione, e perciò con un alto impatto socio-economico, sia perchè molte di queste malattie hanno effetti devastanti nella maggior parte dei pazienti.
Canalopatie genetiche delle cellule beta-del pancreas. Diabete mellito di tipo-2 (T2DM). Il presente progetto ha lo scopo di studiare il coinvolgimento di varie famiglie multigeniche di canali del potassio nell'eziologia del T2DM, una malattia metabolica estremamente eterogenea.
I nostri obiettivi principali saranno raggiunti attraverso la sinergia delle competenze delle varie Unità Operative, e costituiranno utili punti di arrivo anche se considerati singolarmente:
1. Identificare nuovi geni malattia.
2. Identificare nuovi marcatori molecolari associati a canalopatie.
3. Stabilire i meccanismi molecolari e cellulari attraverso cui mutazioni in canali ionici causano il fenotipo della malattia.
4. Delucidare il ruolo di alcuni canali ionici espressi nel cervello, nel muscolo cardiaco e scheletrico.
5. Generare e caratterizzare alcuni modelli animali per canalopatie ereditarie.
6. Sviluppare sistemi diagnostici avanzati basati sulla analisi di profili genetici correlabili al decorso clinico e al trattamento terapeutico nelle canalopatie.
7. Identificare nuove strategie terapeutiche.]>>>

Durata

36 mesi