RICERCA ITALIANA     

Laboratorio di Parassitologia e Microbiologia Molecolare: sviluppo di una piattaforma integrata per l'uso di micro-array di antigeni nella diagnosi microbiologica.

Università degli Studi di Perugia

Abstract

Le malattie infettive sono tutt'ora una delle prime cause di mortalità a livello mondiale. L'elenco di microrganismi capaci di determinare gravi patologie ed epidemie nella popolazione umana non è ancora completo. Una elevata densità di popolazione insieme a frequenti contatti con animali domestici e selvatici possono creare nuove nicchie ecologiche per la diffusione di virus e batteri. E' stato accertato che negli ultimi trenta anni sono apaprsi più di quaranta nuovi agenti infettivi in grado di causare malattie nell'uomo, tra questi Legionella pneumophila, Escherichia coli O157, Cryptosporidium parvum, virus della febbre emorragica, HIV e coronavirus e l'agente della SARS. Molte malattie infettive ritenute sotto controllo nei paesi più sviluppati, si stanno nuovamente diffondendo, spesso sottoforma di ceppi resistenti alla terapia in conseguenza di una continua immigrazione di individui dai paesi in via di sviluppo nei quali mancano controlli efficienti. La possibilità di utilizzare microrganismi come armi batteriologiche a scopi terroristici causa ulteriori elementi di preoccupazione. Tutte insieme, queste considerazioni sottolineano la necessità di sviluppare efficienti saggi clinici che permettano di effettuare diagnosi multiple allo scopo di rilevare precocemente l'esposizioni ad agenti patogeni ed effettuare analisi che permettano di apprezzare lo stato d'immunizzazione della popolazione e sorvegliare la diffusione dei microrganismi. Per rispondere a questa esigenza, il nostro laboratorio propone di sviluppare un sitema innovativo per diagnosticare l' esposizione ad agenti patogeni che utilizza micro-array costituiti da un vasto repertorio di antigeni virali e batterici. Il processo di rilevazione immunochimica verrà ottimizzato in termini di sensitività e specificità per identificare diverse classi di anticorpi diretti contro gli antigeni dei micro-array a concentrazioni molto basse, permettendo così la diagnosi precoce sia dell'avvenuta esposizione ad agenti microbici, sia dell'infezione in corso. Le superfici sulle quali saranno distribuiti gli antigeni dei micro-array saranno ottimizzate per favorire il legame con diversi antigeni microbici. Lo sviluppo di questi saggi sarà supportato da un'adeguata strumentazione ottimizzata in termini di costo e prestazione che utilizza un nuovo dispositivo optoelettronico basato su luce emessa da diodi. La tecnologia proposta permetterà la diffusione e l'utilizzazione dei saggi diagnostici dei micro-array alle unità periferiche del nostro sistema sanitario nazionale. Tutte le unità operative coinvolte in questo progetto hanno le conoscienze tecniche, la capacità logistica e possiedono la proprietà intellettuale per sviluppare la tecnologia proposta. Questa tecnologia sarà caratterizzata da bassi costi di produzione, facilità di analisi e utilizzo. Gli sviluppi tecnologici e scientifici che origineranno da questo laboratorio rivoluzioneranno le prospettive di utilizzazione e applicabilità della diagnosi microbiologica multiparametrica e permetteranno di soddisfare un'importante esigenza di costi, tempi e gestione del sistema sanitario nazionale nel suo prossimo futuro. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Andrea CRISANTI, Universita' degli Studi di PERUGIA

Obiettivo del Finanziamento

La differenza fondamentale fra i saggi micro-array e le tecniche immunologiche convenzionali come l'ELISA, è costituita dal numero di indagini che possono essere effettuate con un singolo saggio. Mentre i metodi convenzionali utilizzano uno o più antigeni alla volta, i micro-array permettono di generare una grande quantità di informazioni che rifletterà lo stato immunitario umorale globale del paziente suddiviso nelle sue singole specificità. I prodotti commerciali attualmente disponibili sono al limite della loro capacità ad effettuare analisi multiple anche quando utilizzano complessi sistemi di automazione e non sono in grado di soddisfare l'esigenza clinica di effettuare saggi che permettano di valutare in strutture sanitarie periferiche la reattività immunitaria di un singolo individuo contro una varietà di microrganismi. Il principale obbiettivo di questo progetto è quello di realizzare dei micro-array immunologici che contengano un ampio numero di antigeni di agenti microbici principalmente diffusi in Europa utilizzando antigeni proteici e saccaridici. Un secondo micro-array, contenente un differente repertorio di antigeni, verrà realizzato per mettere in evidenza l'esposizione a microrganismi presenti in paesi in via di sviluppo o utilizzabili come armi biologiche. Questi chip verranno sviluppati insieme ad una efficiente piattaforma commerciale caratterizzata da uno strumento di lettura che utilizza tecnologia LED a basso costo e la messa a punto di superfici idonee per l'adesione di antigeni microbici ai micro-array. Sebbene vi siano differenze non trascurabili tra virus, parassiti e batteri che causano malattie infettive nelle diverse regioni della terra, i chip prodotti conterrano gli antigeni prinicipali degli organismi microbici che causano Infezione Respiratoria Acuta (IRA), agenti causativi della diarrea, e virus che causano la varicella, le epatiti A, B e C e il virus dell'HIV. Molti di questi antigeni sono stati caratterizzati a livello molecolare e convalidati quali componenti di singoli test immunologici come l'ELISA o immunoblot. Ulteriori attività di ricerca avranno l'obiettivo di identificare marcatori diagnostici in microrganismi quali Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Yersinia pestis, Pasturella tularensis, Bacillus anthracis, vaiolo, ebola e il virsu Hanta. Inoltre attività sperimentali avranno l'obiettivo di ottimizzare superfici di vetro per favorire l'ancoraggio degli antigeni (proteine ricombinanti, peptidi e polisaccaridi) ai microarry, e la costruzione di prototipi di lettori di micro-array basati su tecnologia LED. E' possibile prevedere che la messa a punto di questo sistema diagnostico integrato faciliterà il diffondersi dell'utilizzazione dei micro-array nel campo della diagnosi clinica. A questo scopo sono state definite una serie di attività sperimentali alle quali parteciperanno le varie unità di ricerca i cui obiettivi sono:
a) identificare gli antigeni in microrganismi di grande rilevanza clinica, che funzionino come marcatori diagnostici per la risposta immunitaria umorale;
b) sviluppare un array che contenga un grande numero di antigeni microbici;
c) convalidare la stabilità e la prestazione diagnostica degli antigeni distribuiti su micro-array;
d) verificare l'effetto di diversi trattamenti di superfici di vetro nel favorire il legame degli antigeni al micro-array;
e) creare nuovi programmi bioinformatici per analizzare la risposta immunitaria e
f) costruire dei prototipi di strumenti di lettura e validarne le prestazioni cliniche. <<<

Durata

60 mesi