RICERCA ITALIANA     

PROGETTAZIONE, SINTESI E VALUTAZIONE BIOMOLECOLARE DI PEPTIDI E PEPTIDOMIMETICI MELANOCORTINICI AD ATTIVITÀ ANTIFUNGINA

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

I peptidi antimicrobici naturali sono promettenti candidati per il trattamento di infezioni batteriche e fungine e, pertanto, sono oggetto di numerose ricerche sperimentali. Alcune di queste molecole si sono rivelate efficaci nell'inibire la crescita di un numero elevato di agenti patogeni, compresi organismi resistenti ai più comuni antibatterici in uso.
Dati recenti indicano che il peptide antiinfiammatorio e antipiretico endogeno alfa-melanocitostimolante (alfa-MSH) e altre melanocortine hanno potente effetto antimicrobico. La struttura di questo peptide può quindi rappresentare la base per la progettazione e la sintesi di una nuova classe di agenti antimicrobici.
In questa ricerca ci proponiamo di sintetizzare nuove molecole peptidiche e peptidomimetiche derivate dalle melanocortine che abbiano marcato effetto candicida. Le molecole più promettenti per attività antimicotica verranno quindi esaminate per la potenziale attività antiinfiammatoria propria di alfa-MSH e di altre melanocortine. Infine, con l'uso delle moderne tecniche di biologia molecolare basate su cDNA microarrays, determineremo i meccanismi molecolari dell'effetto candicida delle nuove melanocortine sintetiche. Questa fase della ricerca permetterà non solo la definizione del meccanismo d'azione delle molecole da noi prodotte, ma anche l'identificazione di nuovi potenziali target molecolari per agenti antifungini.
I derivati melanocortinici sintetici potrebbero costituire una classe innovativa di agenti dotati di contemporanea attività antimicrobica e antiinfiammatoria. Questa caratteristica, del tutto peculiare, ne farebbe molecole di notevole utilità per la difesa dell'ospite durante i processi infettivi accompagnati da febbre e infiammazione. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alfonso CAROTENUTO Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

La progressiva e rapida comparsa di microoorganismi resistenti agli antibiotici attualmente in uso ha stimolato la ricerca di nuove molecole dotate di migliore efficacia terapeutica. Questo progetto di ricerca ha come obiettivo generale la progettazione, la sintesi e lo studio biomolecolare di nuove molecole peptidiche e peptidomimetici derivati dalle melanocortine ad attività candicida e antiinfiammatoria.

Questa ricerca rappresenta l'ampliamento e lo sviluppo di nostri studi preliminari che hanno identificato analoghi aminoacidici del peptide antiinfiammatorio e antipiretico endogeno alfa-MSH dotati di potente attività antimicrobica (Cutuli et al., J Leukoc Biol 2000,67:233-9; Grieco et al., J Med Chem 2003,46:850-5).
Gli studi sulla attività candicida di alfa-MSH ci hanno permesso di formulare linee guida per la progettazione di nuove molecole. Abbiamo infatti identificato la struttura minima indispensabile per l'effetto antimicrobico, ossia la sequenza core 6-9 e il tripeptide C-terminale 11-13 di alfa-MSH. Abbiamo inoltre delineato sostituzioni vantaggiose e negative per l'effetto candicida in termini di carica e conformazione degli aminoacidi. Siamo pertanto in grado di disegnare nuove molecole con parametri prestabiliti. Questo faciliterà notevolmente il raggiungimento degli obiettivi.

Per indagare le proprietà antimicrobiche dei peptidi melanocortinici, abbiamo scelto Candida albicans come patogeno rappresentativo, in quanto questo lievito è un modello universalmente accettato per studiare la risposta dell'ospite alle infezioni. C. albicans, infatti, è un patogeno opportunistico fungino responsabile della maggior parte delle infezioni micotiche nell'uomo. Il genoma di questo lievito è stato quasi completamente sequenziato e largamente annotato; molte delle sue vie regolatorie e metaboliche presentano omologie con le analoghe vie umane; inoltre, l'attività fagocitica e microbicida delle cellule monocito-macrofagiche viene normalmente studiata usando alcune specie di Candida come microrganismi bersaglio. Perciò, le cellule di Candida offrono un elevato numero di strumenti per approfondire lo studio dell'attività antimicrobica di nuovi analoghi di alfa-MSH.

Usando strumenti di bioinformatica, profili di espressione genica e altre tecniche di indagine molecolare indagheremo il meccanismo degli effetti candidicidi di queste molecole.

Ci proponiamo infine di selezionare tra le melanocortine antimicrobiche sintetiche le molecole che mantengano l'effetto antipiretico e antiinfiammatorio delle molecole naturali. L'effetto modulatorio sulle risposte dell'ospite può infatti essere molto benefico nel corso di malattie infettive. Ciascuna molecola ad effetto candicida da noi sintetizzata verrà pertanto sottoposta a test che ne determino l'attività antiinfiammatoria.

Gli obiettivi specifici, ripartiti tra le diverse unità operative, sono:

a) Progettazione e sintesi di nuovi analoghi melanocortinici lineari e ciclici e determinazione della rispettiva attività candicida; selezione dei composti più promettenti.
b) Studio conformazionale mediante analisi NMR della struttura tridimensionale caratteristica dei composti più attivi al fine di individuare la conformazione associata a maggiore attività.
c) Progettazione di peptidomimetici sulla base dei risultati ottenuti nello studio conformazionale; selezione di composti ad elevata attività candicida.
d) Determinazione del meccanismo molecolare dell'effetto candicida, mediante lo studio di profili di espressione genica e della possibile induzione di apoptosi e l'identificazione del target recettoriale.
e) Valutazione dell'effetto antiinfiammatorio delle molecole più promettenti dal punto di vista candicida. A tale scopo verranno studiate in vitro attività dei neutrofili e delle cellule mononucleate del sangue in presenza delle melanocortine sintetiche.

Questo progetto di ricerca attuerà pertanto sintesi, analisi conformazionale e valutazione biologica di nuovi derivati di alfa-MSH attraverso un produttivo approccio sistematico multidisciplinare che comprende metodiche di chimica, biologia molecolare e biologia cellulare.

Potenziali sviluppi futuri di questa ricerca comprenderanno la valutazione dello spettro antimicrobico delle molecole candicide e la valutazione in vivo mediante studi preclinici. <<<

Risultati parziali attesi

Il successo di questo Progetto di Ricerca (PR) dipende da un'intensa sinergia tra le varie Unità di Ricerca (UR). Considerati i compiti e la necessaria e continua interazione tra le varie UR, abbiamo proposto il progetto di ricerca (PR) in 2 fasi, alternando le attività delle singole unità di ricerca impegnate. In tal modo è possibile poter integrare ed utilizzare meglio le informazione ottenute dalle Unità di Ricerca durante tutto il periodo di 24 mesi in cui si articola il progetto.

Risultati del attesi per il 1° anno di ricerca:

(1) Progettazione, sintesi e caratterizzazione chimica di peptidi e peptidomimetici (UR3-Carotenuto).
a) Progettazione di analoghi di alfa-MSH mediante tecniche di modellistica molecolare partendo da dati presenti già in letteratura e da composti sintetizzati dall'Unità di Ricerca in precedenza.
b) Messa a punto della metodologia sintetica per ottenere i nuovi composti progettati.
c) Sintesi dei peptidi e peptidomimetici analoghi dell'alfa-MSH. Studi di delezione, di Ala-scan e di D-Aminoacido-Scan. Sintesi su piccola scala di peptidomimetici al fine di mettere a punto le strategie di sintesi e di purificazione. Accurata caratterizzazione analitica dei prodotti ottenuti. Ottimizzazione delle strategie sintetiche.
d) Studi conformazioni in soluzione del peptide naturale alfa-MSH mediante CD e NMR.

(2) Effetti candidicida di nuovi agonisti melanocortinici (UR2-Capsoni)
a) Valutazione dell'attività candicida sul ceppo di riferimento ATCC 24433 dei nuovi derivati melanocortinici, progettati e sintetizzati dall'Unità di Ricerca N°3, e selezione delle molecole più potenti.
b) Valutazione dell'attività candicida dei nuovi derivati melanocortinici su isolati clinici di Candida albicans, ottenuti dalla collezione del Laboratorio di Microbiologia dell'Ospedale Maggiore di Milano, e identificazione di molecole attive anche su ceppi azolo-resistenti.
c) Screening ed identificazione di molecole da usare negli esperimenti susseguenti sulle cellule umane. Molecole con un significativo potenziale come agenti antifungini saranno ulteriormente indagate riguardo il loro meccanismo di azione.

(3) Studio dei profili trascrizionali delle cellule di Candida albicans in risposta ad agonisti melanocortinici di nuova concezione (UR1-Buffa)
a) Determinazione dei profili di espressione genica di cellule di Candida in risposta al trattamento con i nuovi agonisti melanocortinici selezionati dall'Unità di Ricerca N°2, mediante la tecnologia dei DNA chip.
b) Analisi di cluster e costruzione di modelli molecolari predittivi del meccanismo d'azione candicida.
c) Analisi tempo-risposta per individuare geni e vie coinvolti nel meccanismo d'azione.1) Sintesi e studi conformazionali di peptidi e peptidomimetici melanocortinici (UR3-Carotenuto).
a) Sintesi di peptidi e peptidomimetici addizionali per incrementare lo studio SAR in corso.
b) Studio conformazionale in soluzione mediante CD e NMR dei peptidi sintetizzati in precedenza. Studio conformazionale in ambiente membrano-mimetico (micelle di SDS) dei peptidi naturali e dei loro analoghi più significativi.
c) Progettazione e sintesi di peptidomimetici.

2a) Caratterizzazione del meccanismo di morte cellulare indotto dagli agonisti melanocortinici nei lieviti (UR1-Buffa).
2b) Identificazione, clonazione e caratterizzazione funzionale del recettore per alfa-MSH in Candida albicans.

3) Effetti delle molecole melanocortiniche candidicide sulla produzione di mediatori dell'infiammazione (UR2-Capsoni):
a) Riduzione della produzione di mediatori dell’infiammazione in cellule implicate nella flogosi.
b) Inibizione della chemiotassi, e/o del burst ossidativo e/o dell'attivazione dei neutrofili dopo incubazione con melanocortine sintetiche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il rapido emergere di microrganismi resistenti agli antibiotici convenzionali ha sollecitato la ricerca di nuovi agenti antimicrobici da usare in alternativa o in associazione con i farmaci attuali.
Alcuni peptidi antimicrobici endogeni, come le catelicidine e le defensine, e loro analoghi sintetici sono candidati promettenti per il trattamento delle infezioni batteriche e fungine resistenti: essi sono caratterizzati da un ampio spettro di azione microbicida e raramente inducono resistenza (Shai, 2002; Zanetti et al., 2002)

La ricerca in questo campo è quindi di grande attualità e offre notevoli potenzialità per la scoperta di nuove classi di agenti antimicrobici.

La Candida albicans è un fungo patogeno opportunista spesso resistente al trattamento con antibiotici convenzionali, responsabile della maggior parte delle infezioni fungine negli uomini. L'immunosoppressione associata a chemioterapia oncologica, trapianto d'organo e infezione da HIV sono la causa di un numero crescente di soggetti resi suscettibili alle micosi sistemiche (Corner and Magee, 1997). Il fluconazolo e gli altri farmaci azolici antifungini si sono rivelati efficaci nel trattamento delle infezioni da C. albicans. Tuttavia, l'uso generalizzato di questi agenti ha promosso la comparsa di ceppi di Candida azolo-resistenti (White et al., 1998).

È stato recentemente dimostrato che il peptide naturale ormone alfa-melanocito-stimolante (alfa-MSH [1-13], SYSMEHFRWGKPV) possiede attività antimicrobica (Cutuli et al., 2000). Alfa-MSH è un peptide lineare endogeno derivato dalla proopiomelanocortina (POMC). Alfa-MSH ha dimostrato di possedere una potente attività antiinfiammatoria e antipiretica in modelli di infiammazione acuta, cronica e sistemica (Lipton and Catania, 1997; Catania et al., 2000). Il peptide e altre melanocortine naturali e sintetiche sono stati ampiamente usati in studi preclinici; questi composti rappresentano una classe promettente di nuovi agenti farmacologici dotati di ampio spettro d'attività e la bassa tossicità (Catania et al., 2004).

Le proprietà antimicrobiche di alfa-MSH sono state inizialmente indagate per verificare l'ipotesi che questo potente peptide antinfiammatorio e antipiretico potesse anche avere un ruolo nella difesa dell'ospite verso le infezioni (Cututli et al. 2000).
Questa ipotesi si basava su diverse considerazioni. Come altri peptidi antimicrobici naturali noti, alfa-MSH è filogeneticamente molto antico e altamente conservato nella sua struttura. Esso è presente in specie animali primordiali che mancano della immunità adattativa. Infine, il peptide è prodotto dalle cellule fagocitiche e in organi barriera come l'intestino e la cute (Fox and Kraicer, 1981; Thody et al., 1983; Hancock and Diamond, 2000; Hong et al., 2001; Colombo et al., 2002) dove potrebbe esercitare effetti protettivi contro l'invasione microbica.

Abbiamo così scoperto che alfa-MSH e il suo tripeptide C-terminale alfa-MSH (11-13) (KPV) possiedono una potente attività antimicrobica contro due patogeni rappresentativi, Staphylococcus aureus e Candida albicans (Cutuli et al., 2000). I risultati di questa ricerca hanno inoltre dimostrato che le proprietà antimicrobiche di alfa-MSH sono esercitate con un meccanismo peculiare, che differisce radicalmente da quello di altri peptidi antimicrobici naturali. L'effetto candicida di alfa-MSH è infatti legato all'attività di induzione di cAMP esercitata dal peptide. alfa-MSH induce la produzione di cAMP in C. albicans e l'inibitore dell'adenilato ciclasi ddAdo contrasta l'effetto candicida (Cutuli et al., 2000). Il livello intracellulare di cAMP è cruciale per la vitalità del lievito e la trasduzione del segnale mediata da adenilato ciclasi è essenziale per la transizione da blastospora a forma ifata e per la virulenza della C. albicans (Borges-Walmsley and Walmsley, 2000; Rocha et al., 2001).
Appare di particolare interesse l'osservazione che il meccanismo d'azione, basato sulla induzione di cAMP nel lievito, riproduce l'effetto di alfa-MSH nelle cellule di mammifero nelle quali il peptide si lega a recettori melanocortinici accoppiati a proteine G, attiva l'adenilato ciclasi e aumenta cAMP intracellulare (Mountjoy et al., 1992). Queste osservazioni fanno supporre la presenza, nelle cellule fungine, di recettori che potrebbero presentare analogie con i recettori melanocortinici delle cellule di mammifero. L'identificazione e la clonazione di questi recettori "melanocortin-like" potrebbe avere grande rilevanza per il trattamento delle malattie fungine caratterizzando un nuovo target terapeutico.

In uno studio successivo sulla relazione struttura-attività della sequenza di alfa-MSH, sono stati disegnati e sintetizzati nuovi analoghi di questo peptide, con residui differenti nelle sequenze core (alfa-MSH [6-9]) e C-terminale. I peptidi sintetici sono stati quindi testati per la loro attività candicida (Grieco et al., 2003). I criteri adottati sono stati simili a quelli usati per disegnare analoghi attivi nelle cellule di mammifero (Hiltz et al., 1991; Sahm et al., 1994). Alcune delle nuove molecole si sono dimostrate più potenti della sequenza naturale di alfa-MSH quanto ad attività candicida (Grieco et al., 2003). I risultati di questa ricerca incoraggiano ulteriori indagini per produrre peptidi attivi o composti peptidomimetici che possano rappresentare la base di trattamenti antimicrobici innovativi. Inoltre lo studio fornisce linee guida che permettono di utilizzare/evitare determinate sostituzioni aminoacidiche facilitando così il raggiungimento dell'obbiettivo della ricerca.
Abbiamo infatti dimostrato che alcune sostituzioni (ad esempio D-Nal-7 e Phe-7) aumentano l'effetto candicida mentre altre (ad. es aminoacidi con doppia carica negativa in posizione 12) lo annullano. <<<