RICERCA ITALIANA     

Chinoni citotossici da Ascidiacei marini: caratterizzazione chimica,modelli sintetici ed attività farmacologica

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Il programma di ricerca qui illustrato ha lo scopo di rendere disponibili nuovi derivati terpene chinonici con proprietà citotossiche da utilizzare come molecole guida per lo sviluppo di nuovi farmaci per la terapia antitumorale. La ricerca proposta si avvale della cooperazione di due unità (Roma-Università “La Sapienza” e Napoli-Università “Federico II”), l’una dedicata all’isolamento, determinazione strutturale e proprietà biologiche di nuovi chinoni da ascidie, invertebrati marini, e l’altra dedicata alla sintesi di queste sostanze e di analoghi strutturali: I nuovi composti isolati ed i prodotti di sintesi verranno sottoposti alle prove biologiche. Per quanto riguarda l’isolamento da fonti naturali, saranno investigate le ascidie appartenenti al genere Aplidium che sono una fonte sicura di sostanze di natura chinonica. Sarà continuata l’analisi della specie A. conicum, per individuare la presenza di componenti minori. Infatti, oltre ai conicachinoni A e B, sono stati già isolati e caratterizzati strutturalmente altri composti, tra cui l’Aplidinone A con una struttura benzochinonica sempre condensata con un anello tiazinico. E’ stato dimostrato che l’Aplidinone A è in grado di penetrare nelle cellule e di interferire con il loro sistema redox di membrana allo stesso modo dei capsaicinoidi. Nel caso degli Aplidinoni la regiochimica dell’anello tiazinico è stata determinata per confronto di spettri calcolati attraverso modelli: la parte di questa ricerca dedicata alla sintesi sarà diretta verso una sintesi non ambigua dell’Aplidinone A. Il programma sarà articolato nelle fasi seguenti:
1.Preparazione degli estratti, da materiali selezionati ed identificati
2.Screening farmacologico preliminare e frazionamento degli estratti attivi guidato da saggi di citotossicità,
3.Separazione e purificazione dei componenti delle frazioni attive.
4.Caratterizzazione strutturale, ottenuta principalmente con misure fisiche.
Poiché il punto cruciale nella determinazione strutturale degli Aplidinoni A-C è la regiochimica dell’anello tiazinico, al fine di eliminare ogni possibile ambiguità abbiamo pensato di realizzare una sintesi nella quale la posizione dell’azoto fosse definita sin dai primi passaggi della sintesi.
In breve, il prodotto di partenza (1,4-diossi,3-metossi benzene, prodotto commerciale) può essere nitrato in para al metossile dopo protezione degli OH per acetilazione. La successiva deprotezione e bromurazione esauriente porta ad un dibromoderivato che viene fatto reagire con solfidrato di sodio. Il prodotto, dopo protezione degli OH ed SH, viene alchilato. Si riduce successivamente l’NO2, ed il prodotto, dopo avere liberato l’SH, viene fatto reagire con 1,2 dibromoetano per chiudere l’anello tiazinico. Si ossida quindi lo zolfo con un peracido e si genera il chinone per diretta ossidazione delle funzioni fenoliche protette con cerio ammonio nitrato.
La sintesi che ci si propone di realizzare è adatta a preparare analoghi nei quali venga modificata la lipofilicità della catena isoprenoide, od introdotte funzioni che permettano al composto di legarsi ad appropriati “carriers”. Tutti i chinoni, preparati per sintesi od ottenuti da fonte naturali, verranno sottoposti ad una approfondita caratterizzazione farmacologica, attraverso uno studio dei meccanismi molecolari che portano alla apoptosi delle cellule. L’induzione da parte di questi composti del processo apoptotico potrà essere valutato misurando attraverso analisi western blot la quantità di citocromo c nella frazione citosolica delle cellule in seguito ad esposizione con i diversi composti citotossici. Questi studi condotti su un buon numero di sostanze strutturalmente correlate porterà a conoscere la relazioni tra struttura ed attività ed i meccanismi dell’apoptosi. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Rosario NICOLETTI Universita' degli Studi di ROMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo del presente progetto di ricerca è lo sviluppo di molecole ad attività antitumorale utilizzando come punto di partenza sostanze naturali di origine marina bioattive. In particolare, la ricerca sarà focalizzata su derivati di natura chinonica isolati da ascidacei, invertebrati marini, presenti nel mar Mediterraneo. Infatti, un gran numero di composti di natura chinonica, sia sintetici che di origine naturale, sono stati testati per le loro proprietà antitumorali, evidenziando che soprattutto tre gruppi di chinoni, i benzochinoni, i naftochinoni e gli antrachinoni, presentano interessanti proprietà citotossiche. Alcune molecole già utilizzate nella terapia medica, come la mitomicina e la streptonigrina, contengono una porzione p-benzochinonica mentre alcuni antibiotici naftochinonici, come il lapacolo ed il lapinone, si sono rivelati citotossici nei confronti di alcune cellule tumorali. Precedenti studi hanno già dimostrato come strutture di natura chinonica ed idrochinonica inducano uno stress ossidativi mediante un aumento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) e la deplezione delle quantità di glutatione ridotto (GSH). E’ probabile che tale azione sia correlata proprio all’istaurarsi del processo apoptotico: d’altra parte, è ormai noto che le neoplasie non sono correlate soltanto alla proliferazione cellulare ma anche ad una diminuzione del processo apoptotico di morte cellulare programmata. La letteratura è ricca di esempi di composti naturali a struttura terpene chinonica/idrochinonica, isolati sia da fonti marine che terrestri, ma soprattutto gli ascidiacei marini dell’ordine Aplousobranchiata (famiglia Policlinidae) come le ascidie appartenenti al genere Aplidium, sono una fonte particolarmente ricca di prodotti di natura terpene-chinonica e idrochinonica biologicamente attivi. Da essi sono stati isolati composti che mostrano una grande varietà dello scheletro carbonioso, dovuta a ciclizzazioni intra- ed inter-intermolecolari o a riarrangiamenti delle catene isopreniche che talvolta danno origine a strutture policicliche o macrocicliche. Inoltre, ad alcune di queste complesse strutture si possono legare amminoacidi o residui di taurina.
Tale progetto, si articolerà in varie fasi che, in parte, costituiranno il proseguimento di ricerche già iniziate.
La raccolta di sostanze da esaminare si svolgerà sul duplice fronte dell’isolamento dei prodotti da fonti naturali seguita dalla loro caratterizzazione strutturale e farmacologica e della loro sintesi totale o parziale. La sintesi di chinoni con struttura uguale o correlata ai prodotti naturali bioattivi isolati avrà lo scopo di arricchire la collezione dei composti da esaminare ed in più di offrire la possibilità di ottenere facilmente – una volta definito un protocollo sintetico – analoghi e composti strutturalmente simili che possiedono funzioni e proprietà chimico-fisiche diversificate, ma modulabili, composti quindi funzionali agli studi delle proprietà biologiche alle quali si è sopra accennato.
L’obbiettivo finale di questa ricerca sarà quello di disporre di un congruo numero di sostanze di natura chinonica, correlate strutturalmente, da sottoporre ad indagine biologica: queste indagini hanno gli scopi di: a) comprendere il meccanismo di induzione della apoptosi, b) studiare le correlazioni tra struttura ed attività biologica, c) l’insieme dei risultati di cui ai punti a) e b) permetteranno di utilizzare le conoscenze sulla caratteristiche dei prodotti più significativi come guida per la realizzazione di farmaci antitumorali. <<<

Risultati parziali attesi

Il primo anno sarà dedicato alla estrazione del materiale biologico ed all'isolamento ed identificazione di nuovi derivati chinonici. Nello stesso periodo, l'unità di Roma si dedicherà alla sintesi dell'Aplidinone A. Alla fine del primo anno è atteso il completamento della sintesi dell'Aplidinone A e la scoperta di nuove entità chimiche. Durante il secondo anno avrà luogo la sintesi di analoghi strutturali e/o la sintesi di nuovi composti naturali identificati. Le sintesi saranno dirette verso quelle strutture che appariranno più promettenti per le loro proprietà farmacologiche. Verrà condotto uno studio esauriente su queste proprietà lungo le linee illustrate nelle appropriate parti di questo progetto, riguardanti tutti i composti disponibili. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Oggi si stima che più del 50 % dei principi attivi di preparati farmaceutici derivi da fonti naturali terrestri. Per esempio, circa il 25% dei farmaci anticancro sono prodotti naturali e un altro 25% è costituito da derivati sintetici di prodotti naturali (1-2).
Per contrasto, il mare è stato solo limitatamente esplorato sebbene quasi i tre quarti della superficie della Terra sia coperta dagli oceani. Gli ambienti marini offrono, generalmente, condizioni di vita più competitive che richiedono agli organismi che li popolano una complessa serie di adattamenti strategici. Questi includono, tra l’altro, la produzione e/o il rilascio di composti chimici specie-specifici, noti con il termine generico di “metaboliti secondari”, che servono a garantire il successo nella competizione per la preservazione dello spazio vitale e per la difesa dai potenziali predatori. Negli ultimi quarant’anni, tuttavia, la ricerca in questo campo ha fatto passi da gigante; sono stati descritti migliaia di nuovi prodotti naturali isolati da organismi marini e questo numero è in costante crescita, così come lo è il numero di gruppi di ricerca in tutto il mondo che si interessa a questi studi. L’interesse per questa disciplina è ancor più aumentato da quando, soprattutto negli ultimi anni, le indagini sulla struttura ed attività biologica dei composti di origine marina, hanno dato luogo ad un notevole numero di sostanze candidate al ruolo di farmaci.(3). Molte di queste molecole sono allo stadio di sperimentazione clinica o pre-clinica. Le ricerche di ecologia marina hanno mostrato che molti di questi composti costituiscono “armi chimiche” e sono divenute, lungo il cammino evolutivo, potenti inibitori di processi fisiologici, da utilizzare contro predatori o competitori.
E’ stato dimostrato che alcuni dei composti isolati da invertebrati marini sono in alcuni casi prodotti di origine microbica: ed è stato ipotizzato che questo sia il caso per la maggioranza di queste molecole.
Molte tra le molecole bioattive di origine marina sono state isolate dagli invertebrati marini sessili. Questi organismi, soggetti a predazione, a infezioni per opera di microrganismi e a “fouling”, affidano la loro sopravvivenza proprio ai metaboliti secondari. Il fatto che circa il 90% dei prodotti naturali di origine marina attualmente noti derivi da solo quattro gruppi di organismi (macroalghe, celenterati, echinodermi e poriferi) riflette più la facilità di raccolta del materiale biologico che una reale distribuzione dei composti in natura. Relativamente poco è noto sul metabolismo di molti altri organismi come ad esempio i Tunicati che, invece, alla luce degli studi condotti negli ultimi 25 anni, sembrano particolarmente promettenti quali fonti di composti bioattivi. Basta ricordare che, tra i sei composti di origine marina che hanno raggiunto lo stadio della sperimentazione clinica come farmaci antitumorali, tre - la Didemnina B, l’Aplidina e l’Ecteinascidina 743 (ET-743) (4-5) sono metaboliti isolati da ascidie; in particolare, la ET-743, isolata dal tunicato Ecteinascidia turbinata, è attualmente ritenuta una molecola molto promettente per il trattamento del carcinoma ed altri tumori solidi.
I Tunicati (o Urocordati) costituiscono un sub-phylum dei Cordati, che include anche l’uomo e gli altri vertebrati. Da un punto di vista evoluzionaristico, quindi, essi sono gli invertebrati più avanzati. Il sub-phylum, in realtà, comprende tre classi ma soltanto le specie appartenenti ad una delle tre, gli ascidiacei, non sono solo pelagiche ma presentano anche una fase bentonica. Ciò si riflette in una maggiore facilità di raccolta e fa si che gli ascidiacei siano di gran lunga i Tunicati più studiati.
Sorprendentemente, però, la chimica delle varie specie di ascidie presenti nel mar Mediterraneo è stata relativamente poco studiata, soprattutto se si fa il confronto con l’enorme mole di studi condotta su altri invertebrati marini, come ad esempio Poriferi ed Echinoderni. Una delle unità di questo gruppo è da tempo impegnata nella ricerca di nuovi metaboliti secondari farmacologicamente attivi da fonti marine ed ha recentemente focalizzato la sua attenzione sulle specie di Ascidiacei presenti nel mar Mediterraneo. I risultati della ricerca confermano le potenzialità dei metaboliti secondari delle ascidie per lo sviluppo di nuovi farmaci utilizzabili nella terapia anticancro. Infatti, l’analisi degli estratti di alcune specie di ascidiacei presenti nell’area mediterranea ha portato al rinvenimento di numerose nuove molecole con attività antiproliferativa su diverse linee cellulari tumorali. Dalle ascidie Ascidia mentula, Halocynthia papillosa, Microcosmus vulgaris e Sidnyum turbinatum sono stati isolati diversi nuovi composti con attività antiproliferativa (6-10) su diverse linee cellulari tumorali. Alcune di queste molecole, strutturalmente molto diverse, hanno mostrato anche un effetto selettivo. In particolare, dal Sidnyum turbinatum è stata isolata la turbinammide (11), una nuova molecola in grado di inibire selettivamente la proliferazione di cellule del sistema nervoso (C6, glioma di ratto) ) e quindi un potenziale strumento per la terapia dei gliomi, che, come è noto, sono resistenti a gran parte dei chemioterapici.
E’ stato anche dimostrato che la citotossicità della turbinammide verso le cellule C6 è dovuta ad apoptosi, dal momento che l’attività della caspasi-3, una delle proteasi che mediano l’apoptosi, viene aumentata in maniera dose-dipendente dalla turbinammide. Questo effetto è particolarmente marcato nelle cellule C6 (glioma di ratto) mentre non si osserva nei macrofagi di topo (J774). Tale molecola rappresenta dunque un nuovo potenziale strumento terapeutico per la terapia dei gliomi, soprattutto per il suo effetto selettivo che limiterebbe gli effetti collaterali tossici come la immunosoppressione.
Nell’ambito di tali studi è stato eseguita l’esame della specie Aplidium conicum che ha portato all’isolamento dei Conicachinoni A e B, due nuove molecole caratterizzate da un nucleo triciclico contenente un inusuale anello 1,1- dioxo-1,4-tiazinico condensato (12) con una porzione naftochinonica prenilata. La letteratura è ricca di esempi di composti naturali a struttura terpene chinonica/idrochinonica, isolati sia da fonti marine che terrestri. Tra questi si possono citare i metaboliti con uno scheletro di farnesil chinone/idrochinone, come l’Avarolo, isolato dalla spugna marina Dysidea avara (13), il Ciclozonarone isolato dalle alghe brune Dictyopteris ondulata(14), e il farnesilidrochinone isolato dall’albero Wigandia kunthii (15),. È noto, tuttavia, che gli ascidiacei marini dell’ordine Aplousobranchiata (famiglia Policlinidae), come appunto l’a. Conicum, sono una fonte particolarmente ricca di prodotti di natura terpene-chinonica e idrochinonica. Infatti, il primo metabolita biologicamente attivo ritrovato nei tunicati è stato un idrochinone prenilato, il geranil idrochinone, isolato proprio da una specie di Aplidium (16),.
Altri esempi di chinoni ed idrochinoni biologicamente attivi isolati da ascidiacei del genere Aplidium sono: i chinoni prenilati ritrovati in un Aplidium sp (17), A. Californicum (18), A. Costellatum (19) e A. Antillense (20) i complessi dimeri isolati dall’a. Longithorax (21-22) ed i cromenoli isolati dall’a. Solidum (23) e Amarocium multiplicatum (24).
Tutti questi composti mostrano una grande varietà dello scheletro carbonioso, dovuta a ciclizzazioni intra- ed inter-intermolecolari o a riarrangiamenti delle catene isopreniche che talvolta danno origine a strutture policicliche o macrocicliche. Inoltre, ad alcune di queste complesse strutture si possono legare amminoacidi o residui di taurina.
Un gran numero di composti di natura chinonica, sia sintetici che di origine naturale, sono stati testati per le loro proprietà antitumorali, evidenziando che soprattutto tre gruppi di chinoni, i benzochinoni, i naftochinoni e gli antrachinoni, presentano interessanti proprietà citotossiche. Alcune molecole già utilizzate nella terapia medica, come la mitomicina e la streptonigrina, contengono una porzione p-benzochinonica mentre alcuni antibiotici naftochinonici, come il Lapacolo ed il Lapinone, si sono rivelati citotossici nei confronti di alcune cellule tumorali (25).
Gli stessi Conicachinoni A e B, da noi isolati dall’A. Conicum, hanno dimostrato un marcato e selettivo effetto citotossico in vitro nei confronti delle cellule gliomali di ratto della linea C6.
E’ ormai noto che le neoplasie non sono correlate soltanto alla proliferazione cellulare ma anche ad una diminuzione del processo apoptotico di morte cellulare programmata (26). Inoltre i processi anti-apoptotici nelle cellule tumorali contribuiscono alla sopravvivenza e favoriscono la metastatizzazione.
Precedenti studi hanno già dimostrato come strutture di natura chinonica ed idrochinonica inducano uno stress ossidativi mediante un aumento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) e la deplezione delle quantità di glutatione ridotto (GSH). E’ probabile che tale azione sia correlata proprio all’istaurarsi del processo apoptotico. L’apoptosi è caratterizzata dalla frammentazione della cellula in corpuscoli detti corpi apoptotici rivestiti dai residui della membrana plasmatici, nei quali sono ripartiti le ultrastrutture cellulari che vengono eliminate per fagocitosi
Da un punto di vista biochimico l’apoptosi è caratterizzato dalla degradazione della cromatina, inzialmente in frammenti grandi di 50-300 chilobasi, e successivamente in frammenti più piccoli di 200 basi (27). La frammentazione del DNA risulta quindi un altro marker dell’apoptosi. E’ stato suggerito che i radicali liberi modifichino le membrane mitocondriali (28) con conseguente rilascio nel citosol di fattori attivanti la cascata delle caspasi come il citocromo c . Nel citosol il citocromo c interagisce con il fattore attivante la proteasi apoptotica (Apaf-1) per generare l’aptosoma che attiva la caspasi 9. Tale attivazione conduce a quella della caspasi 3 e di altre caspasi che inducono la morte cellulare mediante apoptosi (29).
Un’analisi rivolta a componenti di natura chinonica minori della stessa ascidia ha portato all’isolamento di nuovi derivati, tra cui l’Aplidinone A, tutti caratterizzati da una struttura benzochinonica condensata con l’anello tiazinico. Prove biologiche sull’aplidinone A hanno mostrato che questa sostanza è in grado di indurre la morte cellulare per apoptosi, mediante produzione di ossigeno reattivo. Infatti, è stato possibile dimostrare sperimentalmente un aumento di generazione di ROS (Reactive Oxygen Species) , ed è stata anche misurata la perdita di potenziale transmembranico mitocondriale. Il composto è quindi in grado di penetrare le cellule e di interferire con il sistema redox di membrana allo stesso modo dei capsaicinoidi e della resiniferatossina (30)
La struttura dell’Aplidinone A è stata determinata per via NMR: in particolare la regiochimica dell’anello tiazinico (posizione dello zolfo e dell’azoto) è stata determinata dal confronto dei dati NMR con quelli ricavati da modelli semplificati, calcolati ab inizio.
Visto il potenziale interesse farmacologico e la possibilità di sviluppo per analoghi dell’Aplidinone A, si è deciso di procedere da un lato alla sintesi del composto, con il duplice scopo di dimostrare per via chimica la struttura e per avere disponibile una via di sintesi per la preparazione di composti analoghi, e dall’altro procedere alla ricerca di nuovi chinoni da fonti naturali. Così, mentre una delle due unità di ricerca sarà impegnata prevalentemente alla sintesi, l’altra procederà all’isolamento di nuovi chinoni, ed allo studio delle proprietà farmacologiche.
Per quanto riguarda la sintesi, i precedenti in letteratura sul sistema eterociclico (I),un anello 1,1-dioxo-1,4-tiazinico condensato con un benzochinone, presente negli Aplidinoni, sono molto scarsi. Questo sistema biciclico è stato sintetizzato per la prima volta nel 1988 (31) F.J.Schmitz, S.J.Bloor – JOC 53,3922 (1988)), condensando l’ipotaurina con l’appropriato derivato benzochinonico.





Schema 1

Questa sintesi, semplice e versatile, ha come limite il fatto che non è univoca la regiochimica della addizione, come indicato nello schema 1. Gli autori determinano l’identità strutturale dei due prodotti attraverso uno studio attento degli spettri NMR, reso proficuo dal confronto dei due regioisomeri. La stessa sintesi è stata utilizzata in seguito da Harada, per sintetizzare gli Adociachinoni A e B (32). Al meglio delle nostre conoscenze è questa l’unica sintesi utilizzata per preparare composti naturali simili all’Aplidinone: un’altra possibile sintesi di un chinone condensato con una tiazina potrebbe essere realizzata a partire da un azido chinone. (33).
Dato che il punto cruciale nella determinazione strutturale dell’Aplidinon A è la regiochimica dell’anello tiazinico, al fine di eliminare ogni possibile ambiguità abbiamo pensato di realizzare una sintesi nella quale la posizione dell’azoto fosse definita sin dai primi passaggi della sintesi. <<<