RICERCA ITALIANA     

Polipeptidi Bioattivi e Nanostrutturati: Struttura Molecolare e Supramolecolare, Attività Biologica, Sintesi Innovative.

Università degli Studi di Padova

Abstract

La ricerca si propone lo studio ed il miglioramento di alcune caratteristiche di peptidi e glicopeptidi bioattivi dotati di un potenziale interesse terapeutico. Verranno sintetizzati nuovi analoghi, anche glicosilati, della dermorfina, della deltorfina e di altri peptidi oppioidi, quali l'endomorfina e la nocicettina (Padova, Roma). Verrà studiato l'effetto della modifica dei residui aromatici nella sequenza N-terminale dell'analogo delladermorfina, H-Tyr-D-Arg-Phe-beta-Ala-ammide, uno dei più selettivi agonisti dei recettori mu. Poichè antagonisti dei recettori delta possono prevenire la tolleranza e la dipendenza indotta dalla morfina, senza deprimere l'effetto analgesico mu-mediato, la ricerca si orienterà verso l'ottenimento di delta antagonisti potenti e selettivi. La scoperta della prima classe di analoghi peptidi oppioidi (H-Tyr-Tic-Phe-Phe-OH, TIPP) (Tic = acido 1,2,3,4-tetraisochinilin-3-carbossilico), ha dato notevole impulso allo sviluppo di ligandi delta selettivi. La ricerca intende occuparsi dello studio del rapporto struttura/attività in derivati sintetici riferibili al farmacoforo 2',6'-dimetiltirosina-Tic (Cagliari). Verranno inoltre preparati nuovi analoghi della ciclo-Nle-Lys-bradichinina, ad esempio ibridi peptide-peptoide, tali da rispettare quelle dimensioni dell'anello (33 atomi) che si sono dimostrate ottimali per l'attività (Padova). Si cercherà di trovare nuovi inibitori selettivi delle proteasi aspartiche e delle metallo proteasi di matrice, quali la gelatinasi-B (MMP-9), un bersaglio biologico di particolare interesse nella terapia del cancro. In alcuni degli inibitori della MMP-9, verrà studiato l'effetto della sostituzione di gruppi alifatici con catene fluoroalchiliche (Milano). Gli opportuni alfa e beta ammino acidi aromatici fluorurati verranno preparati con metodi enzimatici innovativi. Le proprietà conformazionali degli inibitori fluorurati e dei diversi analoghi sintetici dei peptidi oppioidi e delle chinine verranno studiate mediante numerose tecniche quali CD, NMR, FT-IR, spettroscopia di massa MALDI, diffrazione dei raggi X, etc. Queste tecniche verranno anche utilizzate per indagini conformazionali su sistemi peptidici in cui si siano inseriti ammino acidi conformazionalmente ristretti, ottenuti a partire da addotti di Baylis-Hillman (Ancona). Le variazioni conformazionali indotte verranno determinate anche attraverso metodi di calcolo computazionale e messe in relazione con l'attività biologica. L'unità di Potenza sarà essenzialmente coinvolta nella produzione di polipeptidi nanostrutturati derivati dall'elastina e dall'adduttina mediante sintesi chimica e/o tecniche di DNA ricombinante. I peptidi saranno sottoposti a reazioni di reticolazione con vari agenti mono- e bifunzionali e saranno poi valutate le proprietà chimico-fisiche, meccaniche e conformazionali dei composti ottenuti. Infine sarà studiata l'organizzazione supramolecolare mediante tecniche di microscopia elettronica e si effettueranno misure di analisi di superficie mediante XPS. In collaborazione con l'unità di Roma si determinerà la potenziale attività biologica di opportune sequenze sintetiche dell'elastina,. Verrà studiato il processo di maturazione che permette di ottenere dal precursore gp160, le due proteine del virus HIV-1, gp120 e gp41 e verranno sintetizzati alcuni substrati peptidici per valutare il ruolo delle caratteristiche conformazionali e dei residui P3 e P2' ai fini del riconoscimento enzima-substrato. Verrà effettuata la sintesi di substrati per lo studio della specificità delle due endoproteasi, SKI-1 e NARC-1, implicate nella maturazione di precursori del Lassa virus, agente eziologico delle febbri emorragiche e nell'ipercolesterolemia (Padova). Verrà utilizzata la spettroscopia di massa MALDI per caratterizzare, a scopo diagnostico, i peptidi che si formano nel siero durante lo sviluppo del melanoma cutaneo maligno, e studiare il meccanismo della melanogenesi (Padova). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Raniero ROCCHI Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il programma di ricerca che viene presentato è il risultato di un notevole sforzo di razionalizzazione, omogenizzazione e finalizzazione dei temi di ricerca proposti dalle diverse unità operative sulla base delle loro specifiche competenze. A questo programma, tipicamente interuniversitario, hanno aderito 6 unità operative che opereranno in stretta collaborazione e le cui proposte di ricerca sono totalmente integrate tanto che alcune di esse potrebbero essere considerate di fatto un'unica unità operativa la cui articolazione è unicamente dovuta al fatto che operano in Atenei diversi.
Comune obiettivo scientifico è lo studio delle relazioni tra struttura ed attività in molecole peptidiche di interesse applicativo e potenziale utilizzo terapeutico, e la loro modifica chimica al fine di comprenderne il meccanismo di azione e migliorarne alcune caratteristiche, quali l'attività farmacologica, la stabilità conformazionale, la biodisponibilità, la resistenza alla digestione enzimatica e la capacità di attraversare la barriera ematoencefalica. La ricerca ovviamente verrà affrontata e condotta sotto vari aspetti, con l'apporto di competenze sia di tipo chimico che farmacologico e con l'utilizzo di tecniche diverse.
Punto di partenza sarà la sintesi di molecole di natura peptidica, di peptidomimetici e di loro analoghi variamente modificati sia in catena laterale che a livello della catena polipeptidica. La sintesi verrà effettuata sia in soluzione che in fase solida, utilizzando anche, se necessario, le più recenti tecniche quali la chimica combinatoria per la preparazione di opportune librerie di composti.
In particolare le modifiche potranno riguardare la sostituzione di residui ammino acidici con altri allo scopo di variare l'idrofilicità o l'idrofobicità complessiva della molecola, la funzionalizzazione delle catene laterali, la glicosilazione di ammino acidi ossidrilati e di asparagine, la variazione del tipo di legame glicosidico in glicopeptidi, l'inserimento di beta-ammino acidi, di ammino acidi non proteici e/o conformazionalmente ristretti o di N-alchil-glicine, in modo da ottenere ibridi peptide-peptoide, etc. Oggetto dell'indagine saranno peptidi oppioidi (Padova e Cagliari) ed analoghi della bradichinina (Padova). Nel caso dello studio di proteine elastiche (Potenza, Roma) l'obiettivo è non solo quello di cercare di chiarire il meccanismo responsabile della loro elasticità ma anche la preparazione, l'analisi strutturale e la caratterizzazione fisico-meccanica di polipeptidi nanostrutturati come potenziali biomateriali, ed infine lo studio dell'attività biologica di alcuni domini dell'elastina. L'unità di Ancona si propone di analizzare l'effetto dell'inserimento di ammino acidi conformazionalmente ristretti in idonei sistemi peptidici. Le variazioni conformazionali indotte verranno valutate attraverso metodi di calcolo computazionale, facendo uso di programmi specifici (Ancona), e messe in relazione con l' attività biologiche del sistema di partenza.
Obbiettivo primario dell'unità di Milano risulta essere la sintesi di nuovi peptidomimetici fluorurati quali potenzali inibitori delle proteasi aspartiche e delle metallo proteasi di matrice, con particolare riferimento alla Gelatinasi B (MMP-9), lo studio della loro attività, selettività e delle loro caratteristiche conformazionali, e la valutazione degli effetti biologici della fluorosostituzione sia per quanto riguarda le interazioni enzima-inibitore, sia sulla biodisponibilità dell'inibitore stesso. Inoltre, verrà studiata la sintesi di amminoacidi non naturali, selettivamente fluorurati e non, mediante tecniche di catalisi enzimatica. Per una razionale progettazione delle modifiche da apportare ad una molecola bioattiva è essenziale conoscerne con la maggiore precisione possibile non solo la struttura ma varie caratteristiche quali le preferenze conformazionali, la selettività verso i recettori, la capacità di interagire con altre molecole, l'esistenza di agonisti ed antagonisti ed, in alcuni casi, la capacità di superare la barriera emato encefalica. Ecco quindi la necessità di disporre di adeguate competenze e della strumentazione adatta ad una così accurata indagine di tipo chimico-fisico e farmacologico. Tali competenze sono presenti nel complesso delle unità operative che si ritrovano nel presente progetto di ricerca. Tecniche sperimentali di tipo spettroscopico (NMR ad alta risoluzione, dicroismo circolare, FT-IR, spettroscopia di massa MALDI) e di tipo teorico (analisi conformazionale teorica e dinamica molecolare)(Ancona), saggi funzionali in vitro ed in vivo e misure di affinità recettoriale (Roma), consentiranno di ottenere informazioni utili alla scelta del tipo di derivati da preparare ed alla corretta interpretazione ed ottimizzazione dei risultati ottenuti. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi al termine della prima fase del progetto di ricerca derivano logicamente dalle premesse fatte alla descrizione dell'attività prevista in tale periodo. Si ritiene di poter mettere a punto la sintesi di polipeptidi elastino e adduttino-simili per espressione genetica e/o per sintesi chimica e di poter effettuare la determinazione delle caratteristiche molecolari e supramolecolari dei monomeri polipeptidici e la definizione delle attività biologiche di alcuni domini dell'elastina Potenza, Roma).
Nel corso della prima fase della ricerca verrà messo a punto il metodo di trasformazione degli addotti di Baylis-Hillman in dipeptidi con costrizioni conformazionali contenenti un alfa-metilene,beta-amminoacido achirale. Successivamente verranno preparati oligopeptidi biologicamente attivi come la met-encefalina, la leu-encefalina e la dinorfina, in cui il frammento Gly-Gly sarà sostituito dal dipeptide isostere con costrizioni conformazionali. Obbiettivo di questa prima fase della ricerca sarà anche la messa a punto - attraverso metodi computazionali - di un modello di interazione fra gli oligopeptidi citati e i loro recettori, che permetterà di correlare con le variazioni strutturali le variazioni di attività osservate (Ancona).
Nell'ambito della ricerca riguardante la sintesi di glicopeptidi bioattivi si ritiene ragionevole poter effettuare la preparazione di un certo numero di nuovi derivati glicosilati dei peptidi oppioidi, anche sulla base dell'efficacia dei procedimenti sintetici precedentemente impiegati nella sintesi di analoghi della dermorfina e della deltorfina (Padova). La ormai lunga esperienza nell'utilizzo del procedimento in fase solida per la preparazione di glicopeptidi e le dimensioni relativamente contenute dei composti che si intende sintetizzare, consentono di ritenere realizzabile tale obbiettivo. Considerazioni analoghe si possono fare sia per quanto riguarda la sintesi degli analoghi glicosilati e no dell'endomorfina e della nocicettina che per le proposte dell'unità di Cagliari che si propone di realizzare nuovi analoghi del farmacoforo Dmt-Tic di struttura generale Dmt-Tic-spacer-aromatico, modificati a livello dello spacer (NH-CH2 modificato in NH-CH(R)- e dell'anello aromatico aggiuntivo.
Anche la preparazione di peptidi chimerici con code di natura cationica o ammino acidica per favorirne l'implicazione nei processi di endocitosi dovrebbe essere possibile senza particolari problemi. L'esame delle caratteristiche dei diversi peptidi modificati potrà permettere di ottenere nuove informazioni sui requisiti molecolari necessari per l'utilizzo dei sistemi di trasporto costitutivi della BEE (Roma). Per ogni nuovo composto si studieranno l'affinità recettoriale, l'efficacia e l'attività biologica, con metodiche di binding recettoriale, misurazione dell'incremento del legame di GTPgS su preparazioni di muscolatura liscia in vitro. I peptidi di maggior interesse saranno studiati in vivo nel ratto e/o topo per valutare la potenza e durata della analgesia prodotta dopo somministrazione sottocutanea (s.c.) e dopo somministrazione intracerebroventricolare (i.c.v.). Il rapporto tra dosi equianalgesiche per somministrazione centrale e periferica è una misura indiretta della capacità di superare la BBB.
La sintesi di analoghi ciclici, di natura totalmente o parzialmente peptidica, della ciclo-Nle-Lys-bradichinina può essere considerata un obbiettivo certamente raggiungibile durante la prima fase di attività. Decine di simili derivati sono stati infatti già stati preparati dall'unità di Padova che dispone ormai di tutte le competenze necessarie ad assicurare la realizzazione delle sintesi in programma. Verrà completato lo studio degli oligopeptidi che si formano per azione di enzimi coinvolti nel meccanismo della melanogenesi e la sintesi di alcuni peptidi riproducenti il sito di scissione di gp160 (Padova). Al termine della prima fase del programma di ricerca l'unità di Milano si aspetta lo sviluppo di una nuova metodologia sintetica generale per la preparazione stereoselettiva di unità in grado di mimare lo stato di transizione dell'azione delle proteasi aspartiche, con particolare attenzione alla sintesi dell'unità centrale 2-idrossi-1,3-propildiamminica presente nel potente inibitore Saquinavir. Dopo l'ottenimento in modo stereodefinito di tale unità, la strategia sintetica sviluppata per la sua incorporazione in peptidomimetici dovrebbe consentire la sintesi totale del Saquinavir stesso. Mediante studi di relazione struttura-attività, cristallografia a raggi X, tecniche NMR e calcoli computazionali si prevede di ottenere informazioni sull'effetto della fluorosostituzione in inibitori di proteasi aspartiche e di metallo proteasi di matrice, con particolare riferimento alla MMP-9. L'attenzione particolare verrà rivolta ad un nuovo analogo fluorurato della pepstatina (un potente inibitore di proteasi aspartiche), la bis-triflorometilpepstatina e agli a-trifluorometil-a-amino-b-solfoni idrossammati, come potenziali inibitori selettivi della MMP-9. Per quanto riguarda la sintesi enzimatica, si prevede l'ottenimento di alcuni prodotti racemi e di campioni analitici di entrambi gli enantiomeri dei suddetti inibitori, nonché la messa a punto del metodo analitico.I risultati attesi dalle ricerche condotte nella seconda delle due fasi in cui si articola il progetto, dipendono strettamente e sono evidentemente condizionati dall'esito di quanto si riuscirà a realizzare nel corso della prima fase. In linea generale si può dire che le ricerche riguarderanno un eventuale completamento del lavoro di sintesi e la completa caratterizzazione chimica-fisica e farmacologia dei composti preparati in precedenza. Verranno effettuate approfondite indagini conformazionali utilizzando tutte le competenze che possono venire messe a disposizione dai diversi proponenti. L'uso di tecniche quali NMR ad alta risoluzione, CD, FT-IR, , spettrografia di massa MALDI, diffrazione dei raggi X, calcoli di meccanica molecolare, di statistica ed energetica conformazionale etc. assicurano la possibilità di una caratterizzazione completa ed esauriente di tutti i composti ottenuti. Per i composti analoghi di peptidi oppioidi o di chinine che avessero mostrato, nei saggi preliminari, promettenti caratteristiche, si procederà anche ad un completo screening farmacologico utilizzando gli opportuni saggi in vivo ed in vitro. Dall'applicazione della via sintetica studiata per l'ottenimento di unità centrali mimiche dello stato di transizione idrolitico delle proteasi aspartiche ci si attende l'ottenimento delle stesse unità selettivamente fluorurate. L'incorporazione di tali unità fluorurate in peptidomimetici dovrebbe portare alla sintesi dell'analogo fluorurato del Saquinavir. Dalla sintesi stereoselettiva di altri inibitori fluorurati di MMP-9, quali gli N-solfonil amminoacidi idrossammati selettivamente fluorurati nella catena in alfa al gruppo idrossammico ci si aspetta di ottenere degli inibitori altrettanto potenti come gli analoghi noti non fluorurati ma più selettivi e più stabili farmacocineticamente. Per la parte di sintesi per via enzimatica, si prevede l'ottimizzazione delle reazioni e l'ottenimento delle forme L- degli ammino acidi su scala compresa tra 0.1 e 1.0 g.
Verrà realizzata la preparazione di alfa-metilene, beta-amminoacidi in forma enantiomericamente pura usando sia ausiliari chirali che metodi di risoluzione enzimatica. Gli amminoacidi ottenuti saranno inseriti nelle strutture di oligopeptidi bioattivi (encefaline e dinorfina) al posto degli amminoacidi naturali corrispondenti, e si verificheranno le correlazioni fra le variazioni conformazionali indotte e l'attività biologica. A partire dai nuovi beta-amminoacidi verranno costruiti poi foldameri in cui l'ampiezza dell'elica verrà modulata in base ai risultati di calcoli computazionali. Questi foldameri, che presentano una serie di doppi legami coniugati, verranno successivamente trasformati in strutture ancora più rigide per reazione con nucleofili bidentati (ditioli, diammine) le cui catene verranno determinate in precedenza per via computazionale. Potranno essere ottenuti così sistemi nanostrutturati rigidi di cui si indagheranno le proprietà per impieghi nel campo della catalisi e del trasporto di piccole molecole.
Tra i risultati attesi figurano la sintesi di polipeptidi elastino e adduttino simili ottenuti per espressione genetica o per sintesi chimica, la determinazione delle loro caratteristiche molecolari e supramolecolari e la definizione delle attività biologiche di alcuni domini dell'elastina.
L'auspicio è che dall'insieme dei risultati sia possibile individuare gli elementi essenziali che caratterizzano il comportamento e le caratteristiche chimico-fisiche e biologiche dei diversi composti ed acquisire le informazioni necessarie alla progettazione e realizzazione di prodotti in possesso di caratteristiche migliori, essenzialmente per quanto riguarda la loro stabilità, specificità, resistenza all'attacco di enzimi, biodisponibilita e capacità di attraversare la barriera ematoencefalica. Ci si attende anche di realizzare la produzione di biomateriale polimerico, di determinarne le caratteristiche supramolecolari e fisico-meccaniche e di ottenere nuove informazioni sui requisiti molecolari necessari per le attività biologiche di elastina e suoi derivati. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il programma si propone, in larga misura, lo studio delle relazioni tra struttura ed attività in peptidi bioattivi di potenziale interesse terapeutico. Sebbene l'obiettivo delle diverse unità operative sia comune, l'apporto di competenze diverse e l'utilizzo di tecniche e strumentazioni di vario genere suggeriscono di articolare la base scientifica di partenza illustrando i vari aspetti della ricerca. L'attività di tutte le unità operative riguarda la sintesi chimica di molecole peptidiche e di loro analoghi e lo studio e la caratterizzazione dei diversi composti mediante misure chimico-fisiche, indagini conformazionali, calcoli teorici e saggi farmacologici. Il programma delle unità operative di Ancona e Milano, prevede anche la sintesi enantioselettiva di ammino acidi non naturali. Frequenti sono in letteratura gli esempi di isosteri di ammino acidi conformazionalmente ristretti ottenuti sia mediante sintesi enantioselettiva mediata da opportuni ausiliari, che attraverso la modifica di composti tratti dal pool chirale (1, 2). La preparazione di ammino acidi con costrizioni conformazionali è stata in gran parte finalizzata alla progettazione ed alla sintesi di peptidi modificati per facilitare il loro uso come farmaci ed ha permesso di ricavare utili informazioni sulle caratteristiche di numerosi recettori di interesse farmacologico. Dal momento che una determinata conformazione di un peptide è responsabile delle sua attività biologica e quindi della sua funzione (3), allo scopo di stabilizzare questa conformazione (4, 5) nella sequenza di alcuni peptidi sono stati incorporati amminoacidi conformazionalmente ristretti contenenti anelli (in genere pirrolidinici o gamma lattamici) o doppi legami. Di particolare interesse risultano i peptidi in cui si sono incorporati beta-ammino acidi con restrizioni conformazionali (6) ed i peptidomimetici in cui gli elementi di rigidità risultano utili per una modulazione delle proprietà biologiche del peptide stesso (7, 8). L'unità operativa di Ancona da tempo si occupa dell'ottenimento di ammino acidi non proteinogenici a partire da addotti di Baylis-Hillman mentre l'unità di Milano si occupa della sintesi stereospecifica di ammino acidi fluorurati, anche per catalisi enzimatica, della preparazione di peptidomimetici fluorurati e della sintesi di fluoro-composti. Le proteasi aspartiche, una nota classe di endopeptidasi, largamente studiate mediante spettroscopia a raggi X, sono caratterizzate da due sequenze Asp-Thr-Gly che delineano il sito attivo ed una o due regioni chiamate "flap region", estremamente mobili e flessibili, che sovrastano il sito catalitico. Le proteasi aspartiche possono essere suddivise in due classi fondamentali [9]: peptidasi modello (penicillopepsina, endotiapepsina, chimosina, pepsina e Rhizobus chinesis pepsina) e proteasi rilevanti dal punto di vista medico quali la renina, che gioca un ruolo fondamentale nella biosintesi dell'angiotensina II [10], le plasmepsine, utilizzate dal protozoo della malaria per degradare l'emoglobina nel suo ciclo di alimentazione [11], l'HIV proteasi, enzima chiave per la replicazione virale associata all'AIDS [12], la b-secretasi, enzima coinvolto nella formazione del peptide amiloide b che è il principale componente della placca neuronica riscontrata nel cervello dei pazienti affetti da Alzheimer [13], e la catepsina D, una proteasi implicata nel processo di metastasi delle cellule cancerose [14]. Negli anni sono stati sviluppati diversi inibitori molto potenti delle proteasi aspartiche ma solo pochi tra questi sono risultati essere adeguati per un trattamento clinico a causa soprattutto della loro scarsa disponibilità orale.
Le metallo proteasi di matrice (MMPs) svolgono un ruolo importantissimo nella morfogenesi dei tessuti. Le MMPs sono regolate a molteplici livelli da inibitori endogeni delle proteasi (TIMPs), che si legano ai domini catalitici. Alcune malattie, come l'arteriosclerosi, l'infarto ed il cancro, sono caratterizzate da attività abnorme di alcune MMPs, come la Gelatinasi-B (MMP-9). Infatti, la MMP-9 degrada il basamento della membrana, favorendo la crescita del tumore attraverso un'angiogenesi sregolata, [15]. Anche nel caso delle MMPs gli inibitori attualmente disponibili mostrano delle controindicazioni: in particolare essi risultano solo scarsamente selettivi, bio-disponibili ed altamente tossici [16].
La selettività di tali inibitori potrebbe essere aumentata modificandone soprattutto il sostituente P1' che è ospitato nella tasca S1' dell'enzima, altamente idrofobica.
L'osservazione che numerosi peptidi e proteine sono capaci di auto-assemblarsi e formare nanostrutture ha stimolato la ricerca nel campo dei materiali, permettendo la progettazione di biomateriali con diverse applicazioni (17) ad esempio nel campo biomedico, quali ad esempio protesi vascolari e sostituti artificiali di cartilagini. In questo contesto, lo studio delle proteine elastomere è importante non solo per chiarire i meccanismi molecolari responsabili della loro elasticità ma anche perché possono essere considerate biomateriali innovativi (18).
La sintesi e lo studio strutturale di alcune sequenze dell'elastina (Potenza), ha già consentito significativi avanzamenti nella comprensione del meccanismo dell'elasticità di tale proteina (19). Ci si propone ora di estendere le indagini ad altre proteine elastiche quali la adduttina dei molluschi bivalvi caratterizzata da un contenuto eccezionalmente alto di metionina solfossido (20). Questa proteina si oppone all'azione dei muscoli adduttori nella chiusura ed apertura del guscio e lavora in compressione, a differenza dell'elastina che lavora in estensione. Queste due proteine rappresentano pertanto due aspetti contrapposti dell'elasticità e sono stati scelte come modelli per la produzione di polipeptidi nanostrutturati con caratteristiche elastiche per applicazioni biomediche.
Uno dei principali problemi da superare nella produzione di biomateriale nanostrutturato è rappresentato dall'ottenimento di crosslinks stabili e in quantità controllabili (21).
Per permettere di effettuare una reazione di reticolazione intermolecolare, nelle sequenza naturali di elastina e adduttina devono venire inseriti residui di amminoacidi con catene laterali funzionalizzate (lisina, ornitina, acido glutammico o aspartico, cisteina) o residui di ammino acidi non naturali, cosa quest'ultima non realizzabile mediante processi di ingegneria genetica. Per valutare le diverse caratteristiche fisico-meccaniche del materiale ottenuto importante sarà la sua caratterizzazione supramolecolare mediante indagini morfologiche, realizzate con tecniche di microscopia (AFM e TEM) e di analisi di superficie (XPS).
E' poi noto che la degradazione e/o l'errato assemblaggio della elastina della matrice extracellulare vasale possono essere un importante cofattore nella aterosclerosi vascolare. Infatti inducono l'attivazione di cellule muscolari liscie della tunica media vasale, normalmente quiescenti, in fenotipi proliferanti e migranti. Inducono chemiotassi e chemiocinesi, stimolano la fagocitosi macrofagica e liberano anioni superossido e nitrossido. Delucidare i domini della elastina coinvolti nell'attività biologica esplicata dai suoi derivati solubili (22) potrà costituire la base per la ricerca di farmaci antagonisti ed i polipeptidi sintetizzati subiranno un adeguato screening di attività biologica che verrà affrontato dall'unità di Roma.
L'unita di Potenza possiede inoltre una documentata esperienza nel campo della caratterizzazione strutturale di specie chirali (23) che potrà risultare utile ad altre unità operative.
Le indagini conformazionali e strutturali su peptidi e composti modello, complemento indispensabile all'attività di sintesi, sono parte integrante dell'attività dell'unità operativa di Padova. L'unità di Roma si dedica essenzialmente alle prove farmacologiche richieste per una completa valutazione dell'effetto delle modifiche apportate alla struttura dei peptidi bioattivi. Lo studio degli effetti biologici in vitro ed in vivo di peptidi e proteine di origine animale è sempre stato ed è tuttora la base di partenza per la comprensione del ruolo fisiologico di tali molecole ed il conseguente riconoscimento di nuovi bersagli farmacologici.
Le indagini sulla funzione della componente carboidrato nelle proprietà e nelle caratteristiche di glicopeptidi bioattivi costituiscono un tema di viva attualità. Le ricerche effettuate hanno dimostrato come la glicosilazione influenzi le proprietà farmacologiche, in particolare di peptidi oppioidi (24, 25), e sia in grado di modificare le preferenze conformazionali di oligopeptidi e polipeptidi (26).
Il trattamento farmacologico di patologie a carico del sistema nervoso centrale (SNC) è reso difficile dalla scarsa capacità dei farmaci peptidici di diffondere attraverso la barriera emato-encefalica (BEE) e la barriera emato-liquorale (B-CSF) che sono le principali interfacce tra il sangue periferico ed il SNC. Tuttavia molecole di grandi dimensioni, idrosolubili e/o a carattere ionico possono superare queste barriere con meccanismi diversi dalla semplice diffusione, quali ad esempio: endocitosi recettore mediata o da assorbimento non specifico, sistemi di trasporto facilitato o attivo. Una volta attraversate queste barriere, l'accumulo dei farmaci nel cervello può essere ulteriormente limitato da altri meccanismi tra cui: a) efflusso in massa con il liquor (effetto scarico), b) estrusione attiva operata da P-glicoproteina (P-gp) e "multidrug resistence protein" (27) o da altri trasportatori, c) metabolizzazione operata da una serie di enzimi farmaco-metabolizzanti, che costituiscono una addizionale barriera enzimatica. Lo sviluppo di peptidi resistenti alla degradazione enzimatica e capaci di attraversare la BEE riveste quindi un notevole interesse terapeutico e diagnostico alla luce delle importanti proprietà farmacologiche di alcune molecole di natura e sono diversi i tentativi fatti per migliorare le caratteristiche dei farmaci peptidici (28). Come già ricordato (24, 25) è stato ad esempio possibile dimostrare che la glicosilazione, ed in particolare la galattosilazione, dei peptici oppioidi dermorfina e deltorfina conferisce loro una maggiore resistenza alla degradazione enzimatica e ne favorisce il coinvolgimento in sistemi di trasporto.
La recente dimostrazione che antagonisti dei recettori delta possono prevenire la tolleranza e la dipendenza indotta dalla morfina, senza deprimere l'effetto analgesico mu-mediato (29, 30), giustifica la ricerca di delta antagonisti potenti e selettivi. L'eptadecapeptide nocicetina (NC) è considerato il ligando endogeno di un recettore orfano oppioide-simile (ORL-1)(31, 32). Il sistema NC-ORL-1 sembra mediare effetti centrali e periferici non oppioidi (33) ma la mancanza di agonisti enzimaticamente stabili e di antagonisti selettivi per il recettore NC ne limita il potenziale terapeutico e giustifica l'interesse per tale sistema. La scoperta della prima classe di analoghi peptidi oppioidi (H-Tyr-Tic-Phe-Phe-OH, TIPP) contenenti l'acido 1,2,3,4-tetraisochinilin-3-carbossilico (Tic) in posizione 2, ha dato notevole impulso allo sviluppo di ligandi delta selettivi (34) e gli studi condotti hanno portato a numerosi derivati peptidici caratterizzati da un ampio range di effetti agonisti/antagonisti sui differenti recettori oppioidi. La ricerca intende occuparsi dello studio del rapporto struttura/attività in derivati sintetici riferibili al farmacoforo 2',6'-dimetiltirosina-Tic, allo scopo di definire le caratteristiche strutturali richieste per un'interazione selettiva con i diversi recettori oppioidi (Cagliari).
Nel tentativo poi di ovviare ad alcuni dei limiti di un possibile impiego delle chinine incrementandone la resistenza alla degradazione enzimatica o stabilizzandone la conformazione bioattiva, sono stati preparati alcuni analoghi lineari e ciclici della bradichinina (Padova). Si è dimostrato che l'attività chininergica è ancora presente in tali derivati e che, nel caso degli analoghi ciclici, essa dipende dalle dimensioni dell'anello (35). Si sono anche preparati alcuni ibridi peptide-peptoide della Thr6-bradichinina, lineari e ciclici, mediante la sostituzione di uno o di entrambi i residui di fenilalanina (posizioni 5 e 8) con residui di N-benzilglicina (Nphe)(36). In questo caso i saggi farmacologici hanno indicato che la modifica apportata è accompagnata da un rilevante calo o dalla scomparsa di attività. Unica eccezione è la ciclo-Nphe5, Thr6-bradichinina che mostra una potenza dello stesso ordine di grandezza della ciclo-bradichinina.
Un altro tema di grande interesse è la ricerca sull'eventuale ruolo di alcuni ammino acidi e peptidi in varie forme patologiche (Padova). Utilizzando la tecnica di spettroscopia di massa si sono condotte ricerche volte ad identificare e caratterizzare, a scopo diagnostico, gli oligopeptidi che si formano nel siero durante lo sviluppo del melanoma cutaneo maligno. Si sono utilizzati peptidi sintetici nello studio del meccanismo di entrata del virus HIV nelle cellule bersaglio e si è anche valutata la loro capacità di inibire il virus (37). Dati interessanti sono emersi sul ruolo del tratto terminale del corecettore CCR5 che risulta contenere alcuni residui di tirosina solfato. Nell'ambito della ricerca sull'AIDS si stanno effettuando indagini sulla struttura secondaria del sito di rottura nel precursore gp160, una molecola afunzionale che per digestione enzimatica fornisce due proteine, gp120 e gp41 fondamentali alla produzione dei virioni infettivi (38, 39) L'emergenza di varianti HIV farmaco-resistenti (40), rende necessaria la progettazione di nuove classi di inibitori della HIV proteasi e l'individuazione di nuovi bersagli terapeutici come ad es. l'inibizione del proteasoma (41). Per quanto riguarda i peptidi immunogenici è noto che le immunorisposte dei linfociti T sono controllate dall'interazione tra i recettori delle cellule T (TCR) e ligandi peptidici legati al maggior complesso di istocompatibilità (MHC) di classe I. Recentemente è stata anche dimostrata la possibilità di progettare epitopi peptidici immunogenici, derivanti da antigeni virali e tumorali, utilizzabili in nuovi protocolli immunoterapici (42). Come già ricordato una delle tematiche affrontate dall'unità di ricerca di Milano è la preparazione di nuovi inibitori fluorurati della gelatinasi-B (MMP-9) particolarmente interessanti nella terapia del cancro. Il ruolo di alcune MMPs è dimostrato dal fatto che i loro inibitori impediscono il processo angiogenico in modelli sperimentali (43). Molti inibitori hanno raggiunto lo stadio dei tests clinici come agenti anti-angiogenici o anti-metastatici e nel trattamento di forme avanzate di cancro (44) ma i risultati sono stati finora deludenti (45). L'inibizione delle MMPs si è dimostrata invece efficace nelle fasi iniziali della formazione del tumore e l'inibizione di MMP-9 costituisce una strategia promettente per prevenire la progressione dei tumori da una fase premaligna alla fase maligna (46, 47). Anche in questi casi sono però numerose le controindicazioni ed i problemi di tossicità (48). Un punto fondamentale per lo sviluppo di inibitori selettivi verso MMP-9 consiste nell'ottimizzazione dei contatti idrofobici nei siti di riconoscimento enzima/legante (49). Il progetto di ricerca si basa sull'idea di incorporare sostituenti fluoroalchilici, localmente idrofobici, in strutture peptidomimetiche. Ciò potrebbe permettere di modulare le proprietà di "binding" degli inibitori nei confronti del sito attivo dell'enzima con l'obiettivo di individuare nuove famiglie di inibitori selettivi di MMP-9, prendendo in considerazione dati strutturali 3D e l'effetto specifico del fluoro. <<<