RICERCA ITALIANA     

SOSTANZE NATURALI AD ATTIVITA' ANTIOSSIDANTE DA FONTI VEGETALI

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

Alcuni dei componenti presenti nelle piante edibili e in alcune bevande stanno suscitando notevole interesse scientifico per i loro potenziali effetti positivi nel mantenimento del benessere. Sono i cosiddetti nutraceutici che esplicano le funzioni più disparate e, operando parallelamente ai processi biosintetici, manifestano azione antiossidante e citoprotettiva determinando una diminuzione dell’incidenza di malattie cronico-degenerative.
Il piano di ricerca, articolato in quattro fasi, è finalizzato all’individuazione di nuovi composti ad azione antiossidante utilizzando come punto di partenza estratti di piante quali: l’uva, piante di comune uso alimentare, piante poco studiate della Valsesia e dell’Italia centrale. Il progetto riunisce e coordina i programmi di 4 unità di ricerca che, con competenze diversificate, consentono di affrontare l’aspetto botanico, biologico, chimico e la valutazione dell’attività antiossidante attraverso saggi specifici.
Il presente progetto si propone nella PRIMA FASE di selezionare e raccogliere una serie di specie vegetali con l’ausilio di un esperto botanico che provvederà all’identificazione tassonomica delle specie della Valsesia e dell’Italia centrale. Verranno realizzati degli estratti grezzi e sarà saggiata l’attività biologica. Contemporaneamente si provvederà alla ricerca bibliografica per l'individuazione di specie poco e per niente studiate per quanto attiene l’azione antiossidante.
La SECONDA FASE del progetto riguarderà l’isolamento e la caratterizzazione strutturale dei componenti bioattivi dagli estratti che hanno avuto una valutazione positiva nei test. Accanto alle piante spontanee della Valsesia, si affronterà anche lo studio dei componenti bioattivi dall’uva e verra realizzato l'isolamento dei componenti ad azione antiossidante da piante edibili. Tutti i composti, una volta purificati, saranno sottoposti, nella TERZA FASE, a saggi di attività biologica, come la capacità antiossidanti, l’ossidazione LDL, il danno al DNA, la rimozione dell’HOC, la rimozione dei superossidi, la formazione del trombossano B2, la formazione del leucotriene B4 e l’attività dell’enzima mieloperossidasi. La QUARTA FASE del progetto di ricerca riguarderà l’ottenimento di cloni che mantengano inalterate le caratteristiche di produttività delle specie spontanee, selezionate in base alle peculiarità fitochimiche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Franco ZOLLO Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il programma di ricerca si basa sulla caratterizzazione chimica di metaboliti secondari ad attività antiossidante da specie vegetali. L’attenzione sarà rivolta all’uva, a piante di comune uso alimentare e a piante molto diffuse e poco studiate della Valsesia e dell’Italia centrale.
Le unità di ricerca partecipanti al progetto hanno competenze specifiche in campo chimico, biologico e botanico farmaceutico e il progetto si articolerà in più fasi di seguito schematizzate e riportate in dettaglio nella Sezione 2.4 del presente programma di ricerca.

Fase 1

- Individuazione e raccolta di specie vegetali provenienti da località molto diverse sia per le condizioni climatiche che geo-pedologiche dell'Italia centrale e della Valsesia.
- Ottenimento degli estratti e valutazione preliminare della loro attività antiossidante.

Fase 2.

- Studio chimico degli estratti risultati attivi nei saggi preliminari: isolamento, caratterizzazione strutturale mediante tecniche spettroscopiche (NMR, IR, UV, MS).
- Estrazione e determinazione strutturale dei componenti polifenolici dell'uva ad attività antiossidante: impiego di moderne e sofisticate tecniche cromatografiche per l'analisi delle complesse miscele di procianidine ottenute dalla parziale risoluzione degli estratti dell'uva.

Fase 3.

- Determinazione dell'attività antiossidante dei metaboliti puri precedentemente isolati dalle varie specie studiate.

Fase 4.

- Ottenimento di cloni che mantengano inalterate le caratteristiche di produttività delle specie spontanee, selezionate in base alle peculiarità fitochimiche. Saranno messe a punto le condizioni colturali, nutrizionali ed ambientali ottimali per le diverse fasi della propagazione in vitro. <<<

Risultati parziali attesi

Gli obiettivi specifici che le unità di ricerca partecipanti a questa fase si propongono di realizzare possono essere così riassunti:

- Completare la raccolta di informazioni storiche relative all’impiego tradizionale ed alla presenza di piante officinali in Val Sesia.

- Reperimento, con l’ausilio di un esperto botanico operante in loco, e identificazione tassonomica delle specie.

- Allestimento dell’erbario.

- Preparazione di estratti con solventi a polarita’ crescente.

- Screening preliminari di attivita’ biologica sugli estratti grezzi di specie della Valsesia e dell'Italia centrale.

- Invio delle frazioni biologicamente attive alle unita’ incaricate dell’analisi ed identificazione dei principi attivi.Le unità di ricerca partecipanti a questa fase si propongono di realizzare i seguenti obiettivi:

- isolamento e caratterizzazione strutturale dei principi attivi antiossidanti presenti nelle piante alimentari. In particolare l’attenzione sarà rivolta a specie appartenenti alla famiglia delle Fabaceae, Apiaceae, Brassicaceae, Liliaceae e ad alcune specie impiegate come spezie o aromatizzanti quali il Capsicum, il Laurus nobilis, il Foeniculum vulgaris, lo Juniperus communis e altre appartenenti alla famiglia delle Labiate.

- determinazione stereochimica dei metaboliti isolati attraverso approcci spettroscopici (tecniche bidimensionali ROESY e NOESY) e chimici (Metodo di Mosher)L'attività di ricerca svolta in questa fase ha come scopo principale la valutazione dell'attività antiossidante dei composti puri isolati e caratterizzati dalle unità di ricerca impegnate nella fase 2.I principali risultati attesi per quest'ultima fase possono essere così schematizzati:

- selezione tra i vari cloni ottenuti di quelli maggiormente produttivi attraverso opportune analisi chimiche.

- isolamento di metaboliti secondari, loro identificazione e quantificazione per via cromatografia e spettrometrica.

- creazione di una banca del germoplasma per le specie aromatiche ed officinali della Valsesia. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Uno dei principali obiettivi della più recente chimica delle sostanze naturali è l'individuazione di metaboliti biologicamente attivi presenti nelle piante, usate comunemente come vegetali nella dieta umana e che, nei secoli passati, hanno trovato impiego, oltre che come cibo o spezie, anche nella medicina popolare. Il contributo maggiore delle piante, nelle diete umane, è imputabile all'apporto di vitamine, acido folico e minerali. Tuttavia esse contengono altri metaboliti secondari, che vengono definiti nutraceutici e che sono stati, di recente, al centro di intensi dibattiti scientifici (1 ,2). Le piante edibili sono ricche di terpenoidi, flavonoidi, alcaloidi, pigmenti, polifenoli, fitosteroli, acidi grassi insaturi, che hanno un ruolo importante nel mantenimento del benessere. La dieta mediterranea include una buona quantità di piante alimentari (frutta, verdure, nocciole, semi, vino, olio di oliva)(3) che impedendo le reazioni di ossidazione determinano una forte riduzione dei fattori di rischio in malattie coronariche (CHD), e abbassano livelli di colesterolo nel sangue (4). Risultano inoltre diminuiti i rischi da malattie croniche degenerative quali il cancro, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, malattie autoimmuni, la sclerosi multipla (5, 6). Studi epidemiologici hanno attribuito tali effetti positivi alla presenza di composti ad azione antiossidante sia nei cibi che nelle bevande comunemente noti come polifenoli. Dal punto di vista chimico i polifenoli sono classificati in due gruppi: i flavonoidi e i non-flavonoidi. Ai flavonoidi appartengono i flavonoli miricetina, quercetina, camferolo ed isoramnetina presenti sia in forma libera che glicosidata; i flavan-3-oli quali la catechina e l'epicatechina e le antocianine quali la malvidin-3-glicoside. Fra i non flavonoidi vi sono l'acido gallico, gli idrossicinnammati quali l'acido p-cumarico, l'acido caffeico e l'acido caftarico e gli stilbeni quali il trans- e il cis-resveratrolo. La componente più significativa dei polifenoli è costituita dai tannini condensati, detti anche procianidine. Essi sono oligomeri e polimeri delle catechine (catechina o epicatechina), condensate attraverso legami carbonio carbonio 4-6 e 4-8. L'uva contiene catechine e procianidine nei semi e nella buccia e sono i maggiori costituenti del vino rosso, accanto al resveratrolo; l'epigallocatechina è abbondante nel tè verde (6,7). Il trans-resveratrolo, è inoltre, un potente fitoestrogeno (8). L'interesse per i composti antiossidanti deriva dall'osservazione del loro ruolo nella modulazione della produzione dei radicali liberi. Un argomento di grande attualità in ricerche sulla patogenesi di molte malattie è quello relativo al ruolo svolto dalla formazione non controllata di radicali liberi: l'intervento dei radicali liberi quali mediatori del danno tessutale è infatti riconosciuto in numerosi processi fisiopatologici quali l'infiammazione, l'aterosclerosi, l'ischemia, i tumori, il danno indotto da radiazioni ionizzanti, l'invecchiamento, le fotoreazioni cutanee. Tuttavia è noto che la formazione di radicali liberi non è da considerare un evento che interessi solo la patologia: la loro produzione avviene sistematicamente in vari processi metabolici e può costituire un evento utile in termini biologici, come nel caso dei fagociti, il cui meccanismo di difesa contro agenti nocivi esterni si avvale della generazione di elevate quantità di radicale superossido. I radicali liberi possono essere mediatori di danno ogni qualvolta la loro formazione eccede le capacità dei sistemi di difesa antiossidanti, preposti al loro rapido smaltimento. Occorre inoltre considerare che le molecole antiossidanti sono potenzialmente dotate di attività estrogenica. Sulla base di recenti ricerche i fitoestrogeni, grazie alla loro capacità di interagire selettivamente sui recettori alfa e beta degli estrogeni, sembrano contribuire alle proprietà salutistiche delle specie vegetali. Si rende quindi opportuno che le molecole antiossidanti isolate dalle specie oggetto di studio siano valutate anche per questa potenziale azione.
Attualmente, la maggior parte delle specie officinali italiane è raccolta allo stato spontaneo. Questo sfruttamento, in aggiunta alla sostituzione delle vecchie varietà locali con le moderne varietà molto produttive, può determinare nel tempo un rapido processo di semplificazione, riducendo la biodiversità degli ecosistemi. La propagazione in vitro delle specie aromatiche e officinali rappresenta una grande potenzialità per la conservazione ex-situ di ecotipi con caratteristiche peculiari (9) e per la produzione su larga scala di molecole bioattive (10), favorendo lo sviluppo di nuovi settori produttivi nell'agricoltura italiana.
La Valsesia presenta habitat incontaminati per lo scarso sviluppo di colture importate ed è un esempio di conservazione della biodiversità (11). Nella flora autoctona della Valsesia sono presenti diverse specie appartenenti alle famiglie Lamiaceae (Thymus pulegioides L., Thymus polytrichus Kerner, Thymus froelichianus Opiz, Thymus praecox Opiz, Thymus alpestris Tausch, Mentha longifolia (L.) Hudson, Mentha acquatica L., Nepeta cataria L.), Valerianaceae (Valeriana officinalis L., Valeriana collina Wallroth, Valeriana celtica L.), Asteraceae (Achillea millefolium L., Achillea distans Walldst, Achillea stricta (Koch) Schleicher ex Gremli, Achillea macrophylla L., Achillea moschata Wulf.), Gentianaceae (Gentiana purpurea L., Gentiana kochiana Perr. et Song, Gentianella ramosa (Hegetschw) Holub) (12). Tra queste alcune sono già utilizzate sia come erbe aromatiche, sia per l'estrazione di oli essenziali, e composti aromatici da impiegare in farmacologia ed erboristeria.
Molte pubblicazioni scientifiche avevano attribuito agli estratti di piante impiegate come alimenti oppure come spezie per esempio il Capsicum annuum L. (peperoncino) nelle forme dolci o piccanti (13, 14) , e piante appartenenti alla famiglia delle Liliaceae come l'aglio (A .sativum L), la cipolla (A. cepa L.), il porro (A. porrum L.), lo scalogno (A. ascalonicum L.) (15-19) interessanti attività farmacologiche, tra cui l’azione antimicrobica, antiaggregante piastrinica e anticancro. Recenti studi hanno condotto all'identificazione di numerosi composti organici la cui struttura è stata determinata prevalentemente attraverso metodiche spettroscopiche non distruttive (esperimenti NMR mono- e bi-dimensionali) e attraverso la spettrometria di massa, tecniche che consentono di preservare il prodotto naturale per poi effettuare l'indagine farmacologica. Da diverse specie di Allium e dai semi del Capsicum sono state isolate nuove saponine e sapogenine citotossiche ad azione antimicrobica (14,16-18) oltre ad un ampio numero di glicosidi di varia natura e derivati fenolici (13,15,19). Su alcuni di essi sono stati realizzati test per valutare l'azione antiaggregante piastrinica e l’azione antiossidante.13
Le Lamiacee, alcune specie usate da secoli nella medicina popolare nella cosmesi e nell'alimentazione, sono una famiglia di piante ampiamente distribuita su tutte le zone temperate. Nell'area mediterranea ne sono state censiti circa trenta generi e si è potuto osservare l'esistenza di una grande variabilità intraspecifica. Sarebbe pertanto auspicabile unire alla descrizione morfologica di ciascuna specie anche un fingerprint dei metaboliti secondari o quanto meno la determinazione quantitativa dei composti biologicamente più attivi. Come è ben noto, i metaboliti secondari possono essere soggetti a notevoli variazioni in una pianta vivente in funzione di fattori ambientali e ontogenetici (20). Il rosmarino (21), la salvia (22-23), la Satureja (24), il basilico (25-26), la menta (27), l'origano (28) ed il timo (29) sono state studiate ampiamente anche per le loro proprietà antiossidanti, mentre questa attività biologica non è stata affatto testata per altri generi, come nel caso del genere Galeopsis.
Alla luce di queste osservazioni il presente progetto si propone di isolare e caratterizzare il maggior numero di metaboliti secondari su cui, poi, realizzare dei tests specifici per la valutazione dell'azione antiossidante. <<<