RICERCA ITALIANA     

Struttura, funzione e biogenesi dei trasportatori mitocondriali per metaboliti

Università degli Studi di Bari

Abstract

Il presente progetto di ricerca è inteso a studiare la struttura, le relazioni struttura-funzione e la biogenesi dei carrier mitocondriali, e a identificare nuovi membri della stessa famiglia di proteine.
Mediante una stretta collaborazione di 5 unità di ricerca con specifiche competenze, questo progetto utilizzerà una combinazione di tecniche biochimiche e biofisiche che fanno uso di sonde specifiche incorporate (mediante mutazioni sito-dirette) in posizioni strategiche delle molecole dei carrier mitocondriali e in particolare del carrier del chetoglutarato (OGC). L'unità di F. Palmieri mutagenizzerà amminoacidi singoli di carrier mitocondriali come l'OGC e il trasportatore della carnitina/acilcarnitine, iniziando da quelli dei domini transmembrana I-VI, allo scopo di identificare i residui che sono essenziali per l'attività di trasporto. Questa unità preparerà anche plasmidi e mutanti (singoli-Cys, doppi-Cys, mutanti contenenti un triptofano e una cisteina) che saranno messi a disposizione delle altre unità partecipanti a questo progetto. Tutti i mutanti saranno espressi in E. coli, purificati, incorporati in liposomi ed analizzati per l'attività di trasporto. I mutanti singoli-Cys ricostituiti nei liposomi saranno saggiati per loro sensibilità a reagenti SH permeabili e impermeabili, in presenza o assenza di substrati o inibitori. Inoltre, sarà misurato il legame di [14C]N-etilmaleimide ai mutanti in presenza o assenza di altri reagenti SH, substrati o inibitori. L'unità di G. Rotilio effettuerà misure di EPR del nitrossido legato selettivamente ad una singola cisteina introdotta con mutagenesi sito-diretta nel C-less OGC, in presenza ed in assenza di "perturbanti" idrofobici o idrofilici. Tutti i mutanti singoli-Cys dei domini transmembrana saranno studiati tramite EPR per identificare la struttura secondaria di ciascun dominio. I mutanti doppi-Cys saranno utilizzati da Rotilio per incorporare sonde fluorescenti contenenti un gruppo di pirene a livello delle due cisteine e studiare la loro capacità di formare dimeri (eccimeri). Saranno inoltre effettuati da Rotilio esperimenti di "fluorescence resonance energy transfer" tra un triptofano ed un pirene introdotto in una specifica posizione della proteina. Entrambe queste misure permetteranno di valutare la distanza tra vari residui presenti nella proteina. L'unità di V. Dolce studierà il "cross-linking" di residui di cisteina introdotti nel OGC C-less. Poiché le due cisteine saranno inserite in differenti domini transmembrana e si useranno cross-linkers di diversa lunghezza, i risultati permetteranno di determinare le distanze esistenti tra i domini transmembrana e ottenere informazioni sul loro "paking". L'unità di F. Bisaccia effettuerà studi di NMR di peptidi corrispondenti ai domini transmembrana del OGC. Questi peptidi saranno studiati mediante NMR, singolarmente o in varie combinazioni, per determinare la struttura di ciascun dominio, le loro proprietà dinamiche e le loro interazioni. L'unità di V. Zara studierà la biogenesi dei carrier mitocondriali, in particolare i segnali di targeting e di sorting anche mediante l'uso di mutanti. Infine, le unità di F. Palmieri e di V. Dolce, partendo da sequenze geniche codificanti nuovi carrier mitocondriali (e cioè proteine di cui non si conosce la funzione ma che sicuramente appartengono alla famiglia dei carrier mitocondriali perché hanno tutte le caratteristiche della loro struttura primaria), identificheranno la funzione di nuovi membri della famiglia dei trasportatori mitocondriali mediante una strategia (già utilizzata da entrambe le unità), che prevede l'espressione dei geni in questione in E. coli o S. cerevisiae, la purificazione delle proteine ricombinanti, la loro incorporazione in vescicole lipidiche (liposomi) e infine l'identificazione dei substrati trasportati da ogni proteina mediante misure di attività di trasporto nei proteoliposomi. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Ferdinando PALMIERI Università degli Studi di BARI

Obiettivo del Programma di Ricerca

La struttura secondaria e terziaria dei carrier mitocondriali, come quella della maggior parte delle proteine di membrana, non è ancora nota. Di conseguenza, il livello di compressione del loro meccanismo di funzionamento a livello molecolare è molto scarso, quasi inversamente proporzionale alla loro importanza in biologia. Anche il processo di "import" dei carrier mitocondriali dal citoplasma ai mitocondri (biogenesi) è poco noto. Inoltre, dal sequenziamento del genoma di vari organismi sono emersi nuovi membri della famiglia dei carrier mitocondriali (e cioè proteine di cui non si conosce la funzione ma che sicuramente appartengono alla famiglia dei carrier mitocondriali perché hanno tutte le caratteristiche della loro struttura primaria).
L'obiettivo di questo progetto di ricerca è acquisire informazioni strutturali sui carrier mitocondriali, in particolare sui loro domini transmembrana, studiare alcune importanti relazioni struttura-funzione e la biogenesi dei carrier mitocondriali, e identificare la funzione (i substrati trasportati) di nuovi membri della famiglia dedotti dal sequenziamento del genoma di vari organismi. Si perseguirà questo obiettivo tramite una stretta collaborazione tra 5 unità di ricerca che hanno specifiche competenze, sono dislocate in diverse università italiane ed hanno già collaborato tra loro. I risultati finora ottenuti da queste unità rappresentano il punto di partenza delle attività di ricerca del presente progetto, i cui scopi dettagliati per i prossimi 2 anni sono:
- identificazione degli amminoacidi strutturalmente e funzionalmente importanti nei trasportatori mitocondriali, in particolare nel carrier del chetoglutarato (OGC) e nel carrier della carnitina/acilcarnitine;
- localizzazione degli amminoacidi importanti dei trasportatori mitocondriali in relazione alla parte idrofobica della membrana, al percorso o via (idrofilica) di traslocazione del substrato (canale) tra i domini transmembrana, e al sito di legame di substrati o inibitori;
- determinazione della struttura dei domini transmembrana dei carrier mitocondriali, in particolare dell'OGC e del carrier della carnitina/acylcarnitine;
- misura delle distanze fra i vari domini transmembrana nei monomeri o nei dimeri dei trasportatori mitocondriali e in particolare dell'OGC e del carrier della carnitina/acilcarnitine;
- prove a favore o contro la struttura omodimerica dei carrier mitocondriali funzionalmente attivi;
- costruzione di un modello che illustra il parziale o completo impaccamento dei domini transmembrana del OGC e del carrier della carnitina/acilcarnitine;
- costruzione di modelli strutturali di altri membri della famiglia dei carrier mitocondriali mediante procedure di "homology modeling";
- identificazione della funzione di nuovi membri della famiglia dei carrier mitocondriali;
- identificazione del ruolo della presequenza dei carrier mitocondriali nel processo di trasferimento degli stessi dal citoplasma ai mitocondri (import); e
- identificazione dei requisiti strutturali per la biogenesi (import) dei trasportatori mitocondriali, in particolare del carrier dei dicarbossilati. <<<

Risultati parziali attesi

1. Costruzione di plasmidi per l'espressione di carrier mitocondriali normali e carrier mitocondriali con mutazioni di singoli aminoacidi (per esempio con cisteina).
2. Identificazione di residui essenziali per l'attività di trasporto dei carrier mitocondriali, in particolare del carrier del chetoglutarato e del trasportatore della carnitina/acilcarnitine.
3. Identificazione della funzione (substrati trasportati) di almeno 3 nuovi carrier mitocondriali.
4. Struttura dei domini transmembrana II e VI del carrier del chetoglutarato mediante EPR.
5. Struttura dei domini transmembrana II e VI del carrier del chetoglutarato mediante NMR.
6. Primi risultati sulle interazioni e distanze tra domini transmembrana mediante esperimenti di cross-linking.
7. Identificazione del ruolo delle presequenze dei carrier mitocondriali nelle interazioni degli stessi con le proteine delle membrane mitocondriali responsabili del loro import (biogenesi dei carrier mitocondriali).1. Costruzione di altri plasmidi per l'espressione di carrier mitocondriali normali e mutati.
2. Identificazione di altri residui essenziali per l'attività di trasporto dei carrier mitocondriali, in particolare del carrier del chetoglutarato e del trasportatore della carnitina/acilcarnitine
3. Identificazione della funzione (substrati trasportati) di almeno altri 3 nuovi carrier mitocondriali.
4. Struttura dei domini transmembrana I, III e V del carrier del chetoglutarato mediante EPR.
5. Struttura dei domini transmembrana I, III e V del carrier del chetoglutarato mediante NMR.
6. Determinazione delle distanze tra domini transmembrana mediante esperimenti di cross-linking e di fluorescenza.
7. Identificazione dei complessi tra carrier mitocondriali e chaperonine citosoliche che sono riconosciute dal recettore TOM 70 della membrana esterna dei mitocondri.
8. Identificazione di amminoacidi essenziali per il processo di "import" dei carrier mitocondriali nei mitocondri. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Più di un quinto di tutte le proteine sono proteine transmembrana, che attraversano varie volte la membrana con la loro catena polipeptidica. Le proteine transmembrana sono responsabili di molte importanti funzioni, tra le quali quelle di trasportare molecole verso l'interno e l'esterno di cellule o organuli cellulari. Nonostante la loro importanza, solo in pochissimi casi è nota la loro struttura ad alta risoluzione. Di conseguenza, il loro livello di comprensione per quanto riguarda il loro meccanismo a livello molecolare è molto scarso, quasi inversamente proporzionale alla loro importanza in biologia. Questa situazione dipende dal fatto che le proteine di membrana in genere, e le proteine di trasporto in particolare, sono molto difficilmente cristallizzabili e caratterizzabili strutturalmente con mezzi tradizionali, a causa della loro idrofobicità e in molti casi della loro natura metastabile.

I trasportatori o carrier mitocondriali (CM) sono una famiglia di proteine di membrana che sono localizzate, con una sola eccezione, nelle membrane interne dei mitocondri (1). La loro comune funzione è quella di collegare il citosol e i mitocondri catalizzando il passaggio di un gran numero di soluti attraverso la membrana interna dei mitocondri. Questo legame è indispensabile, perché molti processi fisiologici richiedono la partecipazione di reazioni enzimatiche sia intra che extramitocondriali.
Sono substrati dei carrier mitocondriali anioni (come ADP/ATP, fosfato, oxoglutarato, aspartato/glutammato, piruvato, citrato, dicarbossilati e chetoacidi ramificati), cationi (come ornitina e spermina) o zuitterioni (come acilcarnitine/carnitina e glutammina). Tra i carrier mitocondriali deve essere inclusa anche "la proteina disaccoppiante", che trasporta H+, per la sua omologia di sequenza con gli altri membri della stessa famiglia. I substrati dei carrier mitocondriali sono trasportati mediante uno dei seguenti meccanismi: uniport (traslocazione di singole specie), symport (traslocazione del substrato e di un protone nella stessa direzione) o antiport (traslocazione del substrato e di un protone o di un altro substrato in direzione opposta). Alcuni carriers (ad esempio, quelli che trasportano ADP/ATP, il fosfato, piruvato e glutammato) sono presenti in tutti i mitocondri. Altri, invece, sono tessuto-specifici ed hanno una distribuzione limitata che riflette la loro importanza in particolari funzioni metaboliche, per esempio la sintesi di urea e la sintesi degli acidi grassi.

Finora, la famiglia dei carrier mitocondriali comprende 16 membri funzionalmente identificati (1), escluse le isoforme e gli ortologhi nei diversi organismi (dal lievito all'uomo). Recentemente, un membro della famiglia dei carriers mitocondriali è stato trovato nella membrana dei perossisomi (2). Questa osservazione indica che queste proteine di trasporto non sono limitate ai mitocondri, ma rappresentano una famiglia più estesa negli eucarioti. Con la disponibilità delle banche-dati di DNA, le caratteristiche di sequenza dei CM sono state usate per cercare altri membri della stessa famiglia di funzione non ancora nota. Il genoma di S. cerevisiae contiene 35 possibili CM, quello di Arabidopsis 58 e quello umano circa 60. Noi abbiamo identificato la funzione di vari geni codificanti nuovi CM (1, 3, 4), ma molti altri CM devono essere ancora identificati. Inoltre, si conoscono varie malattie dovute a deficienza di uno specifico carrier mitocondriale, come la sindrome di Stanley, la sindrome delle 3 H e la citrullinemia di tipo II ( 5-9).

Tutti i CM di funzione nota hanno una caratteristica struttura primaria; contengono 3 domini omologhi ripetuti di circa 100 amminoacidi, e ogni dominio contiene due segmenti idrofobici e un motivo di sequenza abbastanza bene conservato (1). I CM, come molte proteine di membrana, sono difficilmente cristallizzabili e quindi la loro struttura tridimensionale non è nota. Finora, infatti, è stata determinata solo la struttura di una particolare configurazione (inattiva) del carrier dell'ADP/ATP legato alla carbossiatractiloside (10). Di conseguenza, il meccanismo catalitico dei CM è poco conosciuto. Fino a quando i CM non saranno cristallizzati, la determinazione della loro struttura tridimensionale dipenderà dall'applicazione di tecniche biochimiche e biofisiche, che utilizzano sonde specifiche incorporate in posizione strategiche delle proteine in seguito a mutazioni sito-dirette. Queste tecniche sono state e si stanno applicando con successo a molte proteine di trasporto (11-13) e sono proposte, in questo progetto, come metodi utili per la determinazione della struttura, e quindi per la comprensione del meccanismo catalitico di trasporto a livello molecolare, dei carriers mitocondriali.

Uno dei CM più studiati è il carrier del chetoglutarato (OGC), che catalizza il trasporto del 2-chetoglutarato in scambio con malato o altri acidi dicarbossilici attraverso la membrana mitocondriale (14) ed è essenziale in vari processi metabolici come il ciclo del malato/aspartato, il ciclo del chetoglutarato/isocitrato e la gluconeogenesi da lattato (15).

Il OGC è stato purificato all'omogeneità dai mitocondri (16, 17) e ricostituito in forma attiva in liposomi (16, 17). Nel sistema ricostituito è stato trovato che il OGC funziona con un meccanismo cinetico simultaneo-sequenziale, e quindi un complesso ternario formato da due substrati e dalla proteina di trasporto è coinvolto nel ciclo catalitico (18).

La sequenza aminoacidica del OGC è stata dedotta dalla sequenza del cDNA di cuore di bue (19). Un unico gene codifica il OGC nell' uomo, nel bue e nel ratto (20, 21), e il gene umano è localizzato sul cromosoma 17p13.3 (22). Il OGC bovino è costituito da 313 aminoacidi. Ha una struttura tripartita formata da tre segmenti omologhi di circa 100 aminoacidi. Ciascun elemento ripetuto contiene due regioni idrofobiche (I-VI) separate da un'estesa regione idrofilica e i segmenti ripetuti del OGC sono omologhi a quelli presenti in altri membri della famiglia dei carriers mitocondriali (19, 23). La somiglianza strutturale tra la struttura primaria di queste proteine indica che si sono evolute da un gene ancestrale comune e che esse hanno strutture tridimensionali e meccanismi catalitici di trasporto simili.

Folding del monomero del OGC nella membrana mitocondriale. Sulla base del profilo idropatico e di risultati ottenuti mediante proteasi e anticorpi peptido-specifici, è stato proposto un modello di ripiegamento del OGC nella membrana mitocondriale (24) in base al quale la catena polipeptidica del OGC presenta 6 domini transmembrana, corrispondenti ai 2 segmenti idrofobici dei 3 elementi ripetuti, che attraversano la membrana a zig-zag (domini transmembrana I-VI). Le estremità N e C del OGC sporgono dal lato citosolico della membrana mitocondriale interna. I 3 lunghi segmenti idrofilici che uniscono i domini transmembrana di ogni elemento ripetuto sporgono dal lato della matrice e sono chiamati "loops" (A, B e C oppure loop I-II, loop III-IV e loop V-VI). I due segmenti idrofilici più brevi che uniscono i tre elementi ripetuti sono orientati verso l' esterno.

Il OGC contiene 3 cisteine: Cys184 localizzata nel dominio transmembrana IV vicino alla superficie interna della membrana mitocondriale e Cys221 e Cys224 localizzate nel dominio transmembrana V. Abbiamo dimostrato che il reagente-SH fluorescente N-(1-pirenil)maleimide si lega solo alla Cys184 e che Cys221 e Cys224 sono legate da un ponte disolfuro (25, 26). Abbiamo anche dimostrato che Cu2+-fenantrolina forma un ponte disolfuro fra le cisteine di 2 monomeri di OGC (27). Questi risultati suggeriscono che il OGC esiste come omodimero e che le cisteine 184 di 2 monomeri sono molto vicine all' asse di simmetria della struttura dimerica del OGC nativo.

Espressione del OGC in E. coli. Il OGC è stata la prima proteina mitocondriale (e la prima proteina delle membrane degli eucarioti) ad essere espressa in E. coli e rinaturata (28). Procedure simili sono state poi usate per l'espressione di altre proteine di trasporto in E. coli (29-36). Oltre ad E. coli, anche cellule di lievito e di mammifero sono ora usate per l'espressione (36-39). Attualmente la tecnica di espressione è largamente utilizzata nel campo delle proteine di trasporto perché permette la produzione di proteine normali e mutate in grandi quantità per studi strutturali e funzionali.

Tutti gli studi di mutagenesi sito-diretta del OGC, condotti fino ad ora, sono stati effettuati nel nostro laboratorio e possono essere riassunti come segue:

a) Ciascuna cisteina nativa del OGC è stata mutata singolarmente o simultaneamente, e sono state studiate le proprietà di trasporto e i parametri cinetici di questi mutanti (40). I risultati ottenuti dimostrano che i residui di cisteina del OGC non sono essenziali per l'attività di trasporto. Inoltre, e cio' è più rilevante per il presente progetto di ricerca, la caratterizzazione del mutante privo di cisteina (C-less OGC) rappresenta la base di ulteriori studi nei quali la sostituzione di aminoacidi con residui di cisteina, combinata a marcatura con sonde specifiche rilevabili con EPR o fluorescenza, può essere usata per ottenere informazioni sulla struttura secondaria e terziaria del OGC.

b) I mutanti di OGC contenenti mutazioni R/L di ognuna delle 4 arginine localizzate nei domini transmembrana II, IV e VI erano inattivi, indicando l'importanza delle cariche positive dei domini transmembrana nel trasporto di chetoglutarato da parte del OGC (40).

c) Ogni aminoacido nel dominio transmembrana IV e nei loops adiacenti (da T179 a S205) è stato sostituito individualmente con cisteina (41). Solo i mutanti G183C, R190C, Q198C erano completamente inattivi e quindi essenziali per il meccanismo di trasporto. Il chetoglutarato proteggeva i residui di cisteina nelle posizioni 187, 191 e 194 dall'inibizione da N-etilmaleimide. Tutte queste posizioni risiedono sulla stessa faccia dell'elica transmembrana IV, che probabilmente delimita una parte di una cavità o canale accessibile all'acqua esistente tra le eliche del OGC (41). Anche i residui del dominio transmembrana II da I80 a V104 sono stati sostituiti individualmente con cisteina. Solo i mutanti G83C, R90C, Y94C, e R98C erano completamente inattivi e risiedono sulla stessa faccia dell'elica transmembrana II (manoscritto in preparazione).

Inoltre, studi recenti del dominio transmembrana IV condotti mediante EPR (42) e mediante NMR (manoscritto in preparazione) hanno dimostrato che questo dominio ha una struttura ad alfa-elica.

Infine, per quanto riguarda la biogenesi dell'OGC, è stato trovato che il precursore dell'OGC, sintetizzato nel citosol senza una presequenza, è trasportato nei mitocondri mediante un processo dipendente dall'ATP e dal potenziale di membrana. Nel trasporto dell'OGC è coinvolto il recettore Tom 70 e non Tom 20 indicando l'esistenza di vie specifiche di "import" per i CM (43). Come il carrier del 2-chetoglutarato, la maggior parte dei carrier mitocondriali è sintetizzata nel citosol senza presequenza. I carrier, quindi, contengono segnali interni di targeting e di sorting che li indirizzano ai mitocondri e li smistano nella membrana interna (44). Invece, alcuni carriers, come il carrier del fosfato e il carrier del citrato, possiedono una presequenza (45, 46). Anche il processo di "import" del carrier dei dicarbossilati (DIC) è stato studiato (47). È interessante che il DIC si accumula nello spazio intermembrana dei mitocondri in forma solubile, prima di essere inserito nella membrana mitocondriale interna (47). <<<