RICERCA ITALIANA     

PARTNERS DI INTERAZIONE DI PROTEINE AMILOIDOGENICHE PER LO STUDIO DEI PROCESSI DI MISFOLDING ED AGGREGAZIONE; POSSIBILI APPLICAZIONI

Università degli Studi di Udine

Abstract

Alcune patologie umane di grande impatto socio-economico sono causate dalla formazione di aggregati proteici insolubili di aspetto fibrillare che vengono definiti depositi amiloidi. La formazione di tali aggregati richiede la realizzazione di modificazioni conformazionali a carico delle proteine precursori che possono essere considerate variazioni del normale processo di folding delle proteine. I depositi amiloidi inoltre si possono formare a partire da frammenti, sia strutturati che non, ottenuti attraverso eventi proteolitici da proteine precursori di maggiori dimensioni. Obiettivo del progetto è lo studio di entrambi i percorsi amiloidogenici. E' stato dimostrato che una notevole frazione di depositi amiloidi fisiologici nei tessuti è costituita da frammenti proteici derivanti da proteine precursori; su questa base è ragionevole proporre l'utilizzo di frammenti proteici come utili sistemi sperimentali per studiare il meccanismo di formazione delle fibrille amiloidi. D'altra parte durante il processo di conversione fibrillare che ha luogo in altre proteine, la aggregazione impone una fase di destabilizzazione e di formazione di stadi intermedi che vengono stabilizzati da interazioni intramolecolari all'interno della struttura. La fibrillogenesi può essere modulata da modificazioni o condizioni fisiche o chimiche che influiscono sulla solvatazione e la carica di pochi residui chiave, ma anche da interazioni con ligandi naturali o sintetici. Gli ioni metallici sono importanti a questo proposito perchè legandosi possono influire sulla stabilità molecolare, promuovere cambiamenti conformazionali ed attivare processi di oligomerizzazione. Oltre ai piccoli ligandi ed ai metalli, altre due classi di molecole possono essere prese in considerazione per le loro interazioni con proteine amilodogeniche, le chaperonine e gli anticorpi. L'approccio immunologico sembra molto intressante sia in vista di strategie terapeutiche affidabili, sia perchè fornisce eccellenti sonde molecolari specifiche per scopi analitici. Sulla base di recenti evidenze sperimentali, a favore dell'utilizzo di anticorpi per le proteine amiloidogeniche, il progetto persegue l'approccio immunologico. Di recente alcuni dei laboratori afferenti al progetto hanno prodotto anticorpi monoclonali contro proteine amiloidogeniche, ed altri ne verranno prodotti. Oltre alla produzione e purificazione di anticorpi e proteine verrà effettuata una caratterizzazione termodinamica dei complessi proteina anticorpo, inoltre saranno effettuati i classici esperimenti biochimici di Cd, fluorescenza, UV, cinetiche stopped flow etc. Proteolisi limitata e scambio isotopico seguiti da spettrometria di massa , cromatografia, elettroforesi capillare ed altre tecniche analitiche, insieme con microscopia AFM sugli aggregati amiloidi, studi NMR sulle proteine interagenti, principalmente su composti arricchiti isotopicamente in modo selettivo, rappresentano le ulteriori tecniche sperimentali utilizzate dalle unità afferenti al progetto. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Paolo VIGLINO Università degli Studi di UDINE

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo di questo progetto è lo studio di tre differenti aspetti che possono concorrere all'assemblaggio aberrante di proteine specifiche o di frammenti proteici che portano alla formazione di fibrille e placche nelle malattie amiloidogeniche. Sei unità di ricerca collaborano al progetto: tre di esse (Pavia, Firenze e Padova) sono prevalentemente attive nella espressione o produzione di materiale biologico (proteine, frammenti proteici, anticorpi etc) ma contribuiscono anche alla caratterizzazione di parametri termodinamici, biochimici e cinetici che controllano la oligomerizzazione e la fibrillogenesi; le altre tre (Udine, Genova, Napoli) contribuiscono principalmente con tecniche sofisticate quali Microscopia a forza atomica, Risonanza Magnetica Nucleare Multidimensionale e Proteolisi limitata, scambio isotopico H/D e crosslinking chimico abbinati a Spettrometria di massa.
- Studi di aggregazione di frammenti proteici. I depositi amiloidi possono essere formati da frammenti sia strutturati che non strutturati, ottenuti da fenomeni proteolitici attivi sulle proteine precursori. Frammenti proteici isolati possono assumere stati parzialmente strutturati in cui sono esposte zone idrofobiche che invece sono normalmente nascoste all'interno della proteina nativa. Pertanto, i frammenti sono in grado di determinare forti interazioni idrofobiche intermolecolari, che portano alla formazione di oligomeri solubili, che a loro volta costituiscono il nucleo critico di tutto il processo di fibrillogenesi che porta a fibrille mature. La proteolisi di proteine, accoppiata alla spettrometria di massa, può essere usata anche per identificare le regioni proteiche o i frammenti che formano più facilmente aggregati. Questi frammenti, di norma nascosti all'interno della proteina, aggregano più facilmente quando sono isolati dal resto della struttura proteica. Pertanto, i frammenti proteici possono essere proposti quali modelli sperimentali semplificati per studiare il difficile problema della aggregazione proteica. Questi studi sono già in corso ed i risultati ottenuti con frammenti del lisozima sono stati positivi ed incoraggianti.
- Interazione con ioni metallici La stabilità conformazionale delle proteine amiloidogeniche nel loro stato non-amiloidogenico rappresenta un aspetto cruciale per progettare nuove strategie dirette a prevenire il processo fibrillogenico. E' noto che le interazioni con ioni metallici, giocano un ruolo centrale nell'influenzare il delicato equilibrio tra folding e misfolding delle proteine, che normalmente favorisce il primo e la cui alterazione è responsabile della comparsa di aggregati. Si stanno oggi rapidamente accumulando dati che indicano che le interazioni di alcuni metalli di transizione (Fe, Cu, Zn e Mn) potrebbero avere un denominatore comune nell'influenzare le malattie conformazionali. Sono state osservate associazioni metallo-proteina che favoriscono l'aggregazione proteica nel caso dell' alpha-sinucleina, della beta2-microglobulina e della acilfosfatasi. La applicazione di analisi strutturale e funzionale produrrà un insieme di parametri cinetici e termodinamici, che verranno utilizzati per classificare l'interazione con metalli, la stabilità relativa degli addotti, gli aspetti strutturali dell'interazione. Verranno utilizzate tecniche NMR e di spettrometria di massa. Con queste tecniche si possono ottenere informazioni su varianti specificche di beta2-microglobulina in funzione della concentrazione del metallo. Queste includono costanti di legame, la presenza di transizioni conformazionali, parametri di scambio isotopico, dimensione, estensione e mobilità della proteina e degli addotti proteina metallo, cambiamenti nelle superfici esposte e nella accessibilità al solvente. Ulteriori informazioni si possono ricavare inoltre dall'osservazione dell'effetto di metalli su una proteina modello della famiglia AcP, cioe la sulfolobus sulfataricus. Verrà fatta una analisi NMR del sistema basata sulla determinazione della struttura attualmente in corso. Mediante NMR si possono monitorare le interazioni fra ioni paramagnetici e proteine osservando l'allargamento selettivo indotto dal rilassamento paramagnetico. Dai dati NMR e di spettrometria di massa si otterranno informazioni strutturali sui processi di aggregazione ed interazione con metalli identificando i siti specifici.
- interazioni con anticorpi. Obiettivo di questo approccio è la preparazione di sonde immunologiche specifiche per rivelare aggregati amiloidi prefibrillari o le rispettiva fibrille mature per tre proteine modello, la alfa sinucleina associata al morbo di Parkinson e ad altre sinucleinopatie, la beta2-microglobulina ed il suo frammento troncato all'N-terminale, associate con le amiloidosi dei dializzati cronici, ed il dominio N-terminale del fattore di maturazione della idrogenasi procariotica Hypf, non associato ad alcuna patologia amiloidea. Verrà studiata la potenzialità degli anticorpi antibeta2-microglobulina di modificare il processo di misfolding responsabile della formazione di fibrille amiloidi. Questi anticorpi verranno utilizzati in una serie di studi di base che dovrebbero verificare gli effetti delle interazioni locali fra anticorpi ed epitopi specifici sulla stabilità del folding globale della beta2-microglobulina. Gli stessi anticorpi potrebbero avere eventuali applicazioni diagnostiche o terapeutiche. Gli anticorpi contro la specie DN6B2m, troncata al sesto residuo N-terminale e particolarmente suscettibile alla aggregazione in fibrille, permetteranno di identificare la frazione di queste specie presenti nel plasma o nei fluidi periarticolari. Questa strategia di azione è ben integrata in nuove proposte per possibili approcci immunologici nella terapia delle patologie amiloidi. Queste strategie possono diventare sempre più applicabili con il progredire della tecnica di produzione di frammenti di anticorpi veramente specifici, ad alta efficienza, e con effetti collaterali minimi. Gli anticorpi monoclonali contro la bet2-microglobulina da noi già prodotti verranno caratterizzati alla luce di questi dati. Verranno preparati nuovi anticorpi specifici per la specie troncata N-terminale altamente amiloidogenica e verrà utilizzata una libreria scFv. Attualmente la tecnologia scFv sembra essere la migliore disponibile per selezionare specifiche sonde molecolari dato che nella metodica del biopanning, utilizzata per la selezione dei fagi scFv, il ligando è mantenuto in uno stato conformazionale adatto ad essere riconosciuto specificamente. Lo step di biopanning è di importanza fondamentale per selezionare sonde specifiche. I risultati che ci aspettiamo di ottenere saranno utili per far luce sul processo di misfolding ed aggregazione di alcune proteine o dei loro derivati sia nativi unfolded, sia parzialmente, che totalmente unfolded, associati o non a patologie amiloidogeniche. La ricerca inoltre fornirà informazioni sull'uso potenziale di questi frammenti di anticorpi in applicazioni pratiche come agenti anti-amiloidi; inoltre porterà ad avere molecole capaci di identificare epitopi specifici appartenenti a forme tossiche degli aggregati sopramolecolari di due proteine associate con amiloidosi importanti come il morbo di Parkinson e la amiloidosi dei dializzati cronici, per le quali attualmente non esiste nessun aprroccio immunoterapeutico. <<<

Risultati parziali attesi

Tutte le fasi in cui il progetto è stato organizzato, nelle contemporanee fasi IA-IB e la successiva fase II sono caratterizzate da prodotti di ricerca ben evidenti,
La fase Ia stabilirà aspetti strutturali termodinamici e cinetici del processo di fibrillogenesi di una serie di proteine che formano fibre amiloidi in vivo e/o in vitro.Un risultato sarà rappresentato dalla caratterizzazione di intermedi del folding/misfolding stabilizzati da ioni metallici. I risultati della fase IB saranno gli anticorpi target di tre delle proteine oggetto di studio: b2-microglobulina, Hypf e sinucleina. Per questi anticorpi saranno fornite informazioni sulle costanti di dissociazione, caratteristiche strutturali del sito di interazione intermolecolare dei complessi antigene anticorpo.I risultati della fase II consisteranno nella identificazione di anticorpi in grado di interferire con il processo di fibrillogenesi. Una volta che gli anticorpi funzionalmente attivi saranno stati prodotti e caratterizzati, sarà possibile descrivere la struttura degli epitopi riconosciuti. Sarà infine possibile fornire informazioni riguardanti gli effetti sulla struttura terziaria, la topologia superficiale e la stabilità strutturale indotta dall'interazione con l'anticorpo. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Alcune patologie caratterizzate da un rilevante impatto socioeconomico sono causate dalla formazione di aggregati proteici insolubili che vengono definiti depositi amiloidi. La formazione di questi aggregati richiede modificazioni conformazionali a carico delle proteine precursori che mimano gli stati intermedi del normale processo di folding delle proteine. La formazione di questi intermedi sembra critica per la formazione delle fibrille, in quanto queste specie sono in grado di instaurare forti interazioni intermolecolari date dall'esposizione di superfici idrofobiche che sono invece nascoste nella proteina nativa (Dobson 2003). Questo fatto ha portato all'ipotesi che tutte le catene polipeptidiche possano, in determinate condizioni sperimentali, formare fibrille amiloidi (Dobson 1999, 20003) In ogni caso, poiché tutte le fibrille derivate da proteine diverse presentano un comune motivo strutturale, di tipo cross-beta, deve verificarsi un sostanziale riarrangiamento strutturale per produrre aggregati proteici altamente organizzati. Si ritiene inoltre che stati parzialmente strutturati o molten globules (MG) siano intermedi chiave nel processo di aggregazione proteica e della fibrillogenesi (Fink 1998). D'altra parte i depositi amiloidi posso essere formati anche da frammenti, strutturati o non strutturati, ottenuti dalle proteine precursori attraverso fenomeni di proteolisi. Scopo di questo progetto è lo studio di entrambi i meccanismi di degradazione proteica con formazione di depositi amiloidi.Una significativa parte di depositi amiloidi fisiologicamente rilevanti trae origine da frammenti proteici derivati da proteine precursori di maggiori dimensioni (Dobson, 1999, 2003; Sacchettini and Kelly, 2002; Fink,1998). Per esempio le fibrille associate alla malattia di Alzheimer sono costituite da frammenti peptidici derivati dalla proteolisi limitata dovuta all'azione di due secretasi sulla proteina precursore (APP). Altri esempi di depositi amiloidi generati da frammenti proteici includono la serum amyloid protein A, la gelsolina, la apolipoproteina A1, le catene leggere immunoglobuliniche monoclonali, etc. I frammenti proteici derivanti da proteolisi limitata di proteine precursori sono particolarmente predisposti alla aggregazione, perchè di norma essi adottano stati solo parzialmente foldati e non sono in grado di stabilire le interazioni a lunga distanza presenti nella proteina nativa intatta. In particolare una caratteristica comune dei frammenti proteici è quella che essi possono contenere aree idrofobiche oppure gruppi di residui in grado di scatenare la aggregazione proteica attraverso interazioni idrofobiche intermolecolari. Quindi la frammentazione attraverso proteolisi limitata appare un fenomeno significativamente importante e caratteristico di un buon numero di patologie amiloidee e forse in alcune di esse ne è la causa scatenante. Su questa base è ragionevole proporre l'uso di frammenti proteici come sistemi sperimentali per esplorare il meccanismo di formazione delle fibrille amiloidi. D'altra parte nel processo di conversione fibrillare di proteine globulari quali lisozima, beta2-microglobulina, acilfosfatasi, sinucleina etc, la aggregazione richiede una fase di destabilizzazione molecolare e la formazione di stadi intermedi che sono stabilizzati da interazioni intermolecolari che coinvolgono la struttura secondaria ed innescano il processo di oligomerizzazione.
I laboratori del presente progetto hanno una lunga esperienza nello studio della dinamica di folding e nella caratterizzazione strutturale di proteine quali lisozima, beta2-microglobulina, acilfosfatasi etc, per investigare gli eventi molecolari che portano alla genesi delle fibrille.( Esposito et al 2000,2003, Bellotti et al 1998, Chiti et al 2001a, 2001b, Corazza et.al. 2004, Monti et al 2002, Polverino de Laureto et al 2003, etc ).
La fibrillogenesi può essere modulata da modifiche delle condizioni chimiche e fisiche che condizionano la solvatazione della proteina e/o la carica di alcuni residui chiave, ma anche dalla interazione con ligandi sintetici o naturali. Gli ioni metallici sono a questo proposito di grande rilevanza, perchè la loro interazione influisce sulla stabilità molecolare, può promuovere l'acquisizione di conformazioni differenti ed attivare i processi di polimerizzazione. E' stato dimostrato che l'interazione con alcuni metalli del gruppo d (Fe, Cu, Zn e Mn) può giocare un ruolo nella formazione di fibrille amiloidi e puo essere il comune denominatore di alcune patologie conformazionali ( Morgan et.al. 2001). Oltre ai piccoli ligandi ed i metalli altre due classi di molecole sono importanti per le loro interazioni con le proteine amiloidogeniche: le chaperonine e gli anticorpi. La loro importanza risiede nelle loro notevoli potenziali applicazioni sia in campo diagnostico che terapeutico e come strumento di analisi.
L'interazione con altre proteine può influenzare la dinamica di folding ed i processi di aggregazione delle proteine amiloidogeniche. Le chaperonine ad esempio giocano un ruolo importante nella stabilizzazione dello stato correttamente foldato e nel prevenire l'aggregazione. Le chaperonine comunque hanno normalmente una bassa specificità e quindi risulta difficile prevederne applicazioni terapeutiche intese a prevenire il misfolding proteico, eccetto quando influiscono sul rilascio della proteina dal reticolo endoplasmatico. Inoltre se oligomeri solubili non fibrillari, i cosidetti nuclei, sono i primi responsabili delle patologie amiloidi, l'uso di chaperonine può risultare addirittura dannoso perchè può addirittura favorire più che prevenire la formazioni di addotti patologici. Le chaperonine invece possono essere utilizzate come strumenti analitici per proteine amiloidogeniche o frammenti proteolitici. L'approccio immunologico può essere molto più interessante per idonee strategie terapeutiche oltre che essere utilizzato per creare sonde molecolari specifiche per scopi analitici. L'interesse nell'utilizzo di anticorpi o di loro frammenti per studiare ed occuparsi di malattie con depositi proteici è aumentato dopo il 1999, quando per la prima volta fu riportato che l'immunizzazione con Abeta peptide riduceva notevolmente il carico amiloide in cervelli di topi transgenici (Schenk et al. 1999). Negli ultimi anni son stati intrapresi molti studi sull'uso di anticorpi o loro frammenti come possibili strumenti terapeutici nel trattamento di varie amiloidosi quali l'Alzheimer la malattia prionica (White and Hawke 2003). Sebbene esistano evidenze sperimentali che la risposta immunitaria indotta dal sorgere di anticorpi contro le placche di Alzheimer possa rimuovere le fibrille amiloidi, sono state osservate serie complicazioni dovute al superamento della barriera emato-encefalica con conseguente infiammazione meningoencefalitica (Munch and Robinson 2002). Tuttavia l'alta efficienza nella rimozione della placca in questi esperimenti suggerisce che gli anticorpi possano essere un approccio valido, purchè si adottino opportuni protocolli e si sfruttino opzioni di immunoterapia passiva. Risultati analoghi sono stati ottenuti per quanto riguarda le applicazioni nella malattia del prione (Kayed et al. 2003). Anticorpi monoclonali o policlonali o loro frammenti sono inoltre un mezzo valido per studiare alcuni aspetti del folding, misfolding ed aggregazione di proteine. Un recente studio AFM ha confrontato la capacità di differenti anticorpi monoclonali anti-Abeta ad interagire direttamente con Abeta ed inibire la fibrillogenesi, correlando così differenti efficienze antiaggreganti ai differenti epitopi (Legleiter et al. 2004).
Sulla base di queste evidenze in favore dell'uso di anticorpi con proteine che formano depositi amiloidei, questo progetto intende perseguire un approccio immunologico. Uno dei laboratori proponenti (Pavia) ha già prodotto in passato anticorpi monoclonali contro differenti regioni della beta2-microglobulina ed altri ne verranno prodotti sia per la beta2-microglobulina che per alcune varianti, come pure per altre proteine studiate nel presente progetto sia da parte dell'unità di Pavia che quella di Firenze, per studiare il loro effetto sui processi di aggregazione delle proteine bersaglio. E' previsto l'utilizzo di una libreria di scFv, la Nissim library (Nissim et al. 1994) resa accessibile dalla unità di Firenze, che consiste di un ampio repertorio di geni Vh riarrangiati in vitro da una banca di 50 segmenti di geni Vh umani clonati e da sequenze nucleotidiche random codificanti sequenze amminoacidiche di 4-12 amminoacidi corrispondenti alla zona del CDR3. Le regioni variabili delle catene pesanti risultanti dal riarrangiamento vengono assemblate con una costante catena Vlambda 3 così da generare un repertorio anticorpale di frammenti a singola catena variabile (scFv). Inoltre a causa del ruolo specifico della beta2-microglobulina nella risposta immunitaria primaria, dove questa proteina è presente come componente non polimorfica del complesso MHC-I, verrà analizzata l'interazione con la catena pesante polimorfica ed i suoi effetti sull'aggregazione. Oltre che della produzione e purificazione di anticorpi e della espressione e purificazione delle proteine indagate, i laboratori afferenti al progetto si occuperanno della caratterizzazione cinetica e termodinamica dei complessi proteina-anticorpo. Verranno inoltre appplicate le tecniche biochimiche classiche (CD, fluorescenza, UV, stopped flow etc.). Contemporaneamente verranno studiati altri ligandi, quali chaperonine e ioni metallici, che interagiscono con le proteine amiloidogeniche. La proteolisi limitata e lo scambio isotopico seguito da spettrometria di massa, esperimenti di crosslinking chimico seguiti da digestione enzimatica ed identificazione mediante spettrometria di massa dei peptidi collegati chimicamente, la cromatografia, l'elettroforesi capillare ed altre tecniche analitiche, insieme con la microscopia AFM su gli aggregati amiloidi, studi NMR sulle proteine interagenti, anche su composti isotopicamente arricchiti in modo selettivo, costituiscono le tecniche e le metodiche sperimentali a disposizione delle unità del progetto. <<<