RICERCA ITALIANA     

RUOLO DEL SISTEMA "HYALURONAN-PROTEOGLYCAN-HYALURONAN RECEPTOR" DURANTE LO SVILUPPO EMBRIONALE E IN PATOLOGIE EREDITARIE E DEGENERATIVE

Università degli Studi di Parma

Abstract

Il presente Progetto intende definire il ruolo dell'acido ialuronico (HA), di alcuni dei suoi recettori di membrana e dei proteoglicani (PG) PG-M/versican e aggrecan durante lo sviluppo dell'embrione di Xenopus. Inoltre, il Progetto ha come obiettivo studiare questi componenti anche nel contesto della sindrome di Down ed in veste di elementi chiave per l'elaborazione e messa a punto di sistemi di glicomica da applicare alla sierologia clinica. Per apportare modifiche dei livelli di HA durante le varie fasi dello sviluppo embrionale e in modo localizzato, verranno impiegate specifiche sonde di silenziamento genico del tipo morpholino e small interfering RNA (siRNA), specificamente dirette contro i geni codificanti gli enzimi responsabili per la sintesi di questo glicosaminoglicano (GAG), quali i sintasi HAS1-3 e UDP glucosio deidrogenasi (Udgh), e i PGs in esame. Modulazioni temporali-spaziali di questi geni e dei recettori per l'HA, CD44 e RHAMM, verranno anche effettuate tramite iniezioni locali dei corrispettivi mRNA e di vettori contenenti promotori specifici per le cellule della cresta neurale (NC) in fase premigratoria (nella fattispecie XSlug). Gli effetti causati da queste manipolazioni geniche saranno indagati dettagliatamente nel contesto della miogenesi e della formazione del sistema nervoso periferico, che da studi precedenti del gruppo, sono noti per essere processi morfogenetici particolarmente affetti da perturbazioni nell'espressione di queste molecole. In quanto le complete sequenze nucleotidiche del versicano e del aggregano sono ancora largamente ignote nello Xenopus, una parte del lavoro sarà dedicato alla determinazioni delle strutture primarie di questi PGs. Nell'approfondire i meccanismi cellulari e molecolari che, nei processi di miogenesi e neurogenesi periferica, sottendono al coinvolgimento di HA, complessi HA-PG e i loro recettori esamineremo in modo comparativo l'espressione di uno spettro di geni, già noti per essere di fondamentale importanza in questi processi, mediante ibridazione in situ, immunoistochimica e real-time PCR su embrioni trattati e non. A queste indagini si aggiungerà anche un'analisi globale dei profili genici mediante DNA microarray, volta ad individuare geni a valle delle segnalazioni intracellulari innescate da interazioni HA-recettori e PG-HA-recettori. In embrioni manipolati geneticamente ed in feti e cordoni ombelicali affetti da sindrome di Down, le peculiarità delle alterazioni nella deposizione dell'HA, dei suddetti PG e di altri GAGs saranno valutati mediante procedure istologiche, biochimiche e immunologiche, mentre le relative attività e cinetiche degli enzimi d'interesse verranno monitorate mediante appositi saggi di cinetica enzimatica. Nel modificare l'espressione dei geni HAS, presteremo particolare attenzione all'HAS3 e all'Ugdh in quanto recentemente scoperti essere co-espressi nell'orecchio in sviluppo e potenzialmente coinvolti nella formazione del sistema vestibolare. Nello studio della composizione della matrice ialina e proteoglicanica dei tessuti di soggetti affetti da sindrome di Down si prevede di poter delucidare vari aspetti di potenziale valenza clinica per queste malformazioni. Similmente, si prevede che la piattaforma glicomica che verrà sviluppata nell'ambito di questo Progetto potrà fornire nuove indicazioni circa i cambiamenti di livelli plasmatici di GAGs e PGs in patologie ereditarie quali la sindrome di Down e distrofie muscolari, che saranno sfruttate quali patologie degenerative modello a questo scopo. Questa parte del lavoro mirerà anche a poter trasferire procedure biochimiche e immunochimiche per il monitoraggio dei suddetti componenti, nella loro forma intatta o degradata, ad applicazioni cliniche routinarie in altre patologie. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Roberto PERRIS Università degli Studi di PARMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Vi sono attualmente scarse conoscenze dei ruoli eserciati durante l'embriogenesi dai tre enzimi responsabili della biosintesi dell'HA, cioè HAS1-3, e carenti sono anche le informazioni relative alla funzione dei PGs versicano e aggrecano. In gran parte questo è dovuto alla morte prenatale riscontrata nel topo in seguito a delezione dei geni codficanti l'HAS2, l'aggrecano ed il versicano o, nel caso degli HAS1 e HAS3, all'apparente mancanza di alterazioni fenotipiche in seguito alla loro abrogazione. In fine, diversi recettori per HA sono espressi precocemente durante lo sviluppo, ma la loro funzione è ancora largamente ignota.

In diverse malattie ereditarie, come la sindrome di Down e la distrofia muscolare, si osservano alterazioni della ECM sia nei tessuti fetali che quelli adulti. Tali alterazioni risultano importanti a livello clinico ai fini di poter monitorare lo sviluppo del feto e determinare l'eventuali malformazioni che si potrebbero manifestare alla nascita. Nella sindrome di Down tali aberrazioni sembrerebbero essere deputate a difetti nella sintesi e organizzazione dell'HA e di PGs ad essa associati, i quali potrebbero perturbare l'organizzazione macromolecolare della ECM. La frequenza e la natura di queste anomalie rimane però ancora da chiarire.

L'HA, i PGs ed i loro prodotti di degradazione, sono noti per essere differrenzialmente rilasciati nel tessuto connettivo ed entrare nei microcircoli sanguigni e linfatici. Questo processo è accentuato in condizioni patologiche che comportano processi di degradazione tissutale e nelle neoplasie e si pensa che possa essere indicativo dello stato della malattia e/o del protocollo terapeutico adottato. Quindi la caratterizzazione e determinazione quantitativa dei PGs e GAGs plasmatici potrebbe fornire un parametro di alta valenza diagnostico-prognostica implementabile per il monitoraggio clinico di svariate malattie ereditarie o acquisite.

I principali obiettivi di questo Progetto di ricerca sono quindi:

1. definire la funzione del HA prodotto dalla HAS2 durante la miogenesi negli embrioni di Xenopus e topo e di valutare se la mancanza dei geni HAS potrebbe essere associata a condizioni distrofiche nell'uomo;

2. determinare l'espressione spazio-temporale dei recettori per HA CD44 e RHAMM e definire il loro ruolo durante lo sviluppo embrionale, con uno specifico interesse per i processi di miogenesi e neurogenesi periferica;

3. identificare i geni la cui espressione è modulata in assenza di HA e verificare se la perdita di HA possa influire sulla composizione della ECM e la sintesi di altri GAGs.

4. clonare e sequenziare i geni omologhi di Xenopus codificanti per l'aggrecano ed il versicano, determinando la loro distribuzione tissutale e la loro possibile funzione durante lo sviluppo, in particolare del tessuto muscolare e del sistema nervoso periferico;

5. definire il ruolo delle HAS1 e HAS2 durante lo sviluppo delle cellule della NC, nonché definire il ruolo della HAS3 e dell'UDP-glucosio deidrogenasi durante la formazione dell'apparato vestibolare;

6. caratterizzare le alterazioni morfologiche e molecolari causate da una aberrante sintesi e deposizione di HA, altri GAGs, versicani e altri PGs nel cordone ombelicale di feti affetti da sindrome di Down e stabilire l'utilità clinica di questi parametri per una diagnosi prenatale di tale patologia;

7. elaborare nuovi e più accurati metodi per determinare i livelli plasmatici di HA, degli altri GAGs, di svariati PGs e dei loro prodotti di degradazione in campioni di sangue normale e patologico, concentrandosi sulla sindrome di Down e distrofia muscolare come malattie modello.

Obiettivo 1
Nel contesto della miogenesi, le anomalie nella formazione dei muscoli che osserviamo in embrioni trattati con morfolini anti-HAS2 e nel corrispettivo topo knock-out suggeriscono che l'HA e i complessi HA-PG (specialente HA-versicano) possano agire nelle varie fasi intermedie del processo e potrebbero potenzialmente interferire con la somitogenesi, la migrazione delle cellule precursori muscolari, il differenziamento e/o la loro dinamica del ciclo cellulare. Intendiamo chiarire questi aspetti ed inoltre verificare se la mancanza di HA nei somiti possa causare una drammatica modificazione dell'architettura della ECM o se la perdita di HA porti ad un deficit di importanti segnali cellulari direttamente trasmessi dalla medesima molecola.

Obiettivo 2
La nostra evidenza è che l'alterazione della miogenesi in assenza di HA non è dovuta ad una mancanza di segnali cellulari trasdotti da CD44 e quindi fa sorgere l'ipotesi che altri recettori possano giocare un ruolo nella trasduzione del segnale mediata dall'HA. Noi esamineremo con attenzione la possibilità che RHAMM possa essere il recettore che sostituisca CD44 in questo sistema. CD44 è espresso sulle cellule migranti della NC di diverse specie incluso lo Xenopus. Ci prefiggiamo di condurre esperimenti di silenziamento genico e di indurre una selettiva sopraproduzione di questa molecola sotto il controllo del promotore Slug per accrescere le nostre conoscenze sul ruolo di questo recettore durante lo sviluppo della NC.

Obiettivo 3
In mancanza di HA e di conseguenza anche di una ECM strutturalmente e funzionalmente corretta è presumibile che vi sia un'alterata espressione genica dovuta a deficit nelle interazioni cellula-ECM. Un obiettivo di questo Progetto sarà quindi quello di identificare i geni la cui regolazione potrebbe essere disturbata dalla assenza di HA.

Obiettivo 4
Sappiamo che l'aggrecano e il versicano sono presenti nell'embrione precoce, che sono fortemente implicati nella neurogenesi periferica e presumiamo che possano essere importanti anche nei primi stadi della miogenesi. Pertanto cloneremo entrambi gli omologhi di Xenopus e manipoleremo la loro espressione in vivo al fine di espandere le nostre conoscenze sul loro ruolo embrionale.

Obiettivo 5
Evidenze preliminari indicano che l'abrogazione di HAS1 porta ad un cambiamento della migrazione della cellule NC del cranio mentre il silenziamento della HAS2 interferisce con la migrazione di queste cellule nella regione del tronco. La diversa funzione di questi enzimi nello sviluppo delle cellule NC sarà saggiata usando un completo silenziamento o una modulata espressione dei geni HAS nelle cellule NC premigratorie. HAS3 e Ugdh sono espresse nella vescicola otica e mutazioni nel gene codificante l'Ugdh portano a parziale sordità. HAS3 produce catene di HA di diversa lunghezza rispetto a quelle prodotte da HAS1 e HAS2 e potrebbe sintetizzare l'HA con una differente modalità. Cercheremo quindi di capire quale sianono i rapporti fra HAS3 e Ugdh nel contesto della produzione di HA a livello dello sviluppo del sistema vestibolare.

Obiettivo 6
Il fatto che feti affetti da sindrome di Down esibiscono diversi difetti nella ECM, inclusi quelli associati ad aberranti deposizioni di HA e di PGs, durante la gestazione, potrebbe essere ricollegata con le anomalie riscontrate nel cordone ombelicale di questi feti. In questo Progetto saranno compiuti degli sforzi per caratterizzare queste specifiche anomalie della ECM sia in feti abortiti e in cordoni ombelicali malati, anche a fini applicativi clinici.

Obiettivo 7
Uno degli aspetti più attuali dell'era post-genomica è l'ampliamento delle conoscenze relative alle modificazioni post-traduzionali dei prodotti genici (una disciplina denominata glicomica). Allo stesso tempo vi è la necessità di elaborare nuovi metodi diagnostici e prognostici di valutazione delle patalogie ed i loro trattamenti terapeutici di minima invasività. Si presume che i livelli plasmatici di PGs, GAGs ed in particolare dei loro prodotti di degradazione, costituiscano importanti paramentri clinici. Quindi una parte del lavoro di questo Progetto sarà specificamente rivolta a questo problema e sarà incentrata nella messa a punto di metodiche biochimiche e immunologiche che includeranno elaborazione di specifici arrays di anticorpi. <<<

Risultati parziali attesi

Nella prima fase del progetto intendiamo completare la caratterizzazione funzionale di XHAS2 durante lo sviluppo embrionale con particolare riferimento agli eventi di miogenesi. Si prevede che i dati chiariranno la relazione tra una diminuita produzione di HA nella ECM e le alterazioni osservate nei fenomeni di proliferazione/apoptosi in fasi critiche della miogenesi. Il nostro lavoro aggiungerà quindi nuove informazioni riguardo il ruolo dell'HA durante l'embriogenesi e accerterà se deficit di HAS2 possono essere ricompensati da sovraproduzione o trascrizione prematura degli altri HAS.

Un punto essenziale di questa fase del Progetto sarà la caratterizzazione comparativa del fenotipo muscolare in embrioni murini HAS2-/- mutanti Xenopus generati tramite silenziamento genico. Grazie a questi ed altri dati recentemente ottenuti in zebrafish, sarà possibile fare luce su un possibile ruolo evolutivo di HAS2/HA durante lo sviluppo dei vertebrati.

Gli effetti fenotipici osservati durante la morfogenesi degli embrioni di Xenopus in assenza di HA potrebbero essere dovuti ad una mancata attivazione di segnali intracellulari da parte dei recettori dell'HA o ad una perturbazione della struttura macromolecolare della ECM con conseguente alterazione delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM. Gli esperimenti descritti in questa fase del progetto dovrebbero contribuire a chiarire questi aspetti.

Nell'ambito del nostro progetto avremo la possibilità di utilizzare la tecnologia del DNA microarray per effettuare un'analisi completa dell'espressione genica in embrioni di Xenopus privi di XHAS2/HA. Questo ci permetterà di ottenere un quadro complessivo delle alterazioni dell'espressione genica indotte dalla deplezione di HA durante le fasi precoci di sviluppo. Ci attendiamo che questo approccio ci permetta di individuare nuovi geni targets delle cascate di segnale attivate dall'HA nel sistema Xenopus.

Le vie di sintesi dell'HA sono state studiate in batteri, lieviti e cellule di mammimero tra cui quelle umane ma non si hanno praticamente informazioni su questi processi durante l'embriogenesi e nei vertebrati inferiori. Con un analisi dettagliata della funzione dell'omologo di Xenopus di Ugdh, enzima critico per la sintesi di HA, ci aspettiamo di poter contribuire alla comprensione di tali aspetti.
Infine vaglieremo la possibilità che alterazioni dei geni HAS possano essere implicate anche in patologie muscolari umane sperando di poter chiarire se queste siano concause o conseguenze della patologia stessa.

Al fine di creare le basi di partenza per la ricerca prevista nella seconda fase del progetto, che riguarderà in particolare lo studio della migrazione delle NC in riferimento alle interazioni di queste cellule con l'HA e gi alti componenti della matrice, cloneremo gli omologhi dei geni versicano e aggrecano in Xenopus.
Sarà inoltre presa in considerazione la possibilità di clonare varianti del versicano dovute a splicing alternativo che sono già state descritte in altre specie tra cui uccelli e mammiferi. Nella sclera bovina e umana sono inoltre state identificate forme alternative dell'aggrecano, osservazioni non pubblicate dell'Unità 2 in collaborazione con il gruppo del Prof. Anders Malmstrom (University of Lund, Svezia), ma non si conoscono altre varianti in roditori o uccelli.La seconda parte del Programma di ricerca fornirà informazioni dettagliate circa il ruolo dell'HA sintetizzato da HAS1 e in modo più localizzato da HAS3, nonché la correlazione funzionale di questi enzimi con HAS2. Manipolazioni geniche nei mammiferi non hanno fornito informazioni in riguardo ai rapporti funzionali delle tre sintasi in quanto i knock-outs di HAS1 e HAS3 non sembrano causare anomalie fenotipiche e l'abrogazione di HAS2 e precocemente letale. Pertanto, il modello sperimentale Xenopus ci offrirà l'oppurtinità di chiarire questi aspetti grazie alla possibilità di effettuare studi funzionali in vivo in modo temporalmente e spazialmente controllato. Avendo l'opportunità esclusiva di alterare l'espressione genica degli HAS indipendentemente l'uno dall'altro, ci attendiamo di chiarire le diversità funzionali, nel tempo e nello spazio, dei geni HAS durante lo sviluppo embrionale.

I previsti approcci di manipolazione genica nello Xenopus ci permetteranno anche di chiarire il ruolo dell'HA durante la neurogenesi periferica, considerando una sua azione sia come ligando per recettori di membrana che come componente strutturale della ECM. In particolare estenderemo al modello Xenopus un paradigma prcedentemente formulato che presuppone che la peculiare capacità delle cellule della NC di produrre HA durante la loro fase di migrazione venga sfruttata per mediare la loro risposta a fattori del microambiente. Il modello presuppone difatto che l'HA associato alle cellule migranti possa contribuire alla diversificazione del ruolo giocato da alcuni dei principali PGs leganti HA, quali il versicano e l'aggrecano, ai fini di permettere alla cellule di selezionare le vie di migrazione attraverso l'embrione.

Delezioni geniche del versicano murino comportano morte prenatale e un simile fenotipo fortemente compromesso si ottiene in seguito a delezione dell'aggrecano. Non è quindi stato possibile studiare in maniera dettagliata il ruolo di questi PGs durante la formazione del sistema nervoso periferico. Sarà altresì possibile chiarire questo aspetto avvalendosi degli approcci di manipolazione genica adottati in questo studio nell'ambito del modello Xenopus. La possibilità di abrogare contemporaneamente la funzione di geni HAS e versicano e/o aggrecano ci permetterà inoltre di definire la funzione di questi componenti sia come molecole individuali che come complessi ternari di fondamentale rilevanza per l'assemblaggio e l'organizzazione della ECM operante durante lo sviluppo della NC.

Una parte del lavoro proposto riguarderà lo studio della sintesi e del catabolismo dell'HA e dei PGs in feti e cordoni ombelicali sani e affetti da sindrome di Down. Ci attendiamo che l'analisi molecolare dei livelli trascrizionali di HAS1-3, ialuronidasi 1-3, PH20, Ugdh e vari PGs in questi tessuti possa svelare anomalie nell'espressione di questi geni che potranno essere utilizzate come possibili strumenti di diagnosi precoce e pertanto di utilità clinica per questa patologia ereditaria. Inoltre, l'opportunità di valutare con metodiche più accurate e sensibili i livelli plasmatici di HA, PGs e dei loro prodotti di degradazione rappresenterà un contributo essenziale alla descrizione di un quadro clinico più completo e fornirà la possibilità di inserire nuovi parametri di monitoraggio di patologie di origine genetica e non.

Una questione ancora aperta circa il ruolo dell'HA durante i processi morfogenetici riguarda la sua funzione a livello cellulare ed intracellulare. Vi sono descritti in letteratura diverse proteine leganti HA e recettori di membrana e citoplasmatici, ma solo per due di questi è stata inequivocabilmente dimostrata la capacità di trasdurre segnali in seguito a legame con HA. In questo contesto CD44 è il recettore più studiato ma la sua funzione durante lo sviluppo embrionale rimane comunque oscura. Il clonaggio dell'omologo di CD44 in Xenopus, che abbiamo recentemente completato, ci permetterà di approfondire il ruolo di questo recettore durante lo sviluppo embrionale. Ci aspettiamo di capire se CD44 agisce da recettore esclusivo per l'HA durante l'embriogenesi precoce e se esso possa eventualmente esercitare ulteriori funzioni recettoriali e non. I nostri esperimenti definiranno inoltre il suo ruolo e la sua importanza nei diversi tessuti in cui è espresso e durante i vari stadi embrionali.

Tra gli altri recettori noti per l'HA alcuni dati controversi riguardano la localizzazione e la funzione di RHAMM. Nel nostro progetto intendiamo completare la determinazione della struttura primaria dell'omologo di RHAMM in Xenopus e di studiarne la funzione durante lo sviluppo embrionale. Dato che è noto che il legame dell'HA a CD44 o RHAMM attiva una via di segnalazione mediata da Ras, valuteremo in particolare il ruolo di questa via nello sviluppo di Xenopus (dettagliandone la funzione durante la miogenesi e lo sviluppo della NC).

La parte finale del Progetto estenderà l'applicabilità dell'analisi qualitativa e quantitativa dei livelli sierologici di PGs, GAGs e i loro prodotti di degradazione. Metodiche precedentemente messe a punto da membri di questo progetto e dedicati a questo tipo di analisi saranno ulteriormente raffinati ed affiancate da nuovi approcci basati su piattaforme di "antibody arrays". Ci aspettiamo che quest'ultima metodica possa definire nuove modalità per la valutazione globale dei livelli di GAGs e di PGs circolanti e apra nuove vie di studio per comprendere la loro importanza e eventuali applicazioni cliniche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'acido ialuronico (HA) svolge molteplici ruoli durante lo sviluppo embrionale e regola l'omeostasi dei tessuti adulti in condizioni normali e patologiche. L'HA costituisce l'elemento centrale dei complessi macromolecolari formati da proteoglicani (PG) che lo legano specificamente (principalmente l'aggrecano, il PG-M/versicano, il neurocano ed il brevicano), o glicoproteine come TSG6, bikunin e HABP1-3, assicurando cosi un corretto assemblaggio e organizzazione macromolecolare della matrice extracellulare (ECM) dei tessuti connettivi. Oltre a questa funzione, l'HA può svolgere anche un ruolo come molecola segnale legandosi a recettori di membrana o intracellulari come CD44, RHAMM, Lyve-1, HARE, Stabilin-1 e 2 che inoltre contribuiscono anche allo smaltimento di frammenti di HA tramite il microcircolo sanguigno e linfatico [1-3].
L'HA è stato dimostrato essere coinvolto nella regolazione di vari processi cellulari durante lo sviluppo embrionale tra cui la migrazione e il differenziamento cellulare, che sono alla base della formazione del muscolo scheletrico e dei nervi periferici. Numerose osservazioni in vitro ed in vivo suggeriscono un ruolo importante dell'HA nella miogenesi precoce, imputando la funzione del glicosaminoglicano (GAG) in tre distinte fasi di questo processo: (I) durante il movimento dei precursori delle cellule muscolari [4-6]; (II) nell'ambito della fusione dei mioblasti in miotubi [7-8]; e (III) come potenziale supporto molecolare per il differenziamento finale dei miotubi [9, 10]. Durante i movimenti di riarrangiamento dei mioblasti l'HA sembra essere rilevante per lassemblaggio di una ECM che risulti permissiva per la migrazione delle cellule. E' anche noto che un basso livello pericellulare di HA sia un prerequisito importante per l'addensamento dei mioblasti e la loro successiva fusione. Queste osservazioni non tengono, però, conto della possibilità che durante la miogenesi (come pure in altri eventi morfogenetici), l'HA possa modulare il comportamento cellulare mediante l'attivazione di specifiche cascate di trasduzione del segnali intracellulare che sottendono alla regolazione di questi fenomeni [11-13]. L'importanza dell'HA durante la miogenesis embrionale ci fa inoltre supporre che vi possa essere un collegamento diretto tra patologie umane che colpiscono i tessuti muscolari scheletrici e la modulazione della sintesi e/o deposizione dell'HA durante i processi di miogenesi fetale.

Diversi studi hanno evidenziato negli anni un ruolo fondamentale dell'HA durante la neurogenesi periferica ed in particolare nei processi di migrazione delle cellule della cresta neurale (NC). Nonostante le modalità precise attraverso cui l'HA controlla i movimenti delle cellule delle NC non siano conosciute, una serie di studi sperimentali effettuati negli anni dall'Unità 2 e altri investigatori hanno condotto l'Unità a formulare un modello che possa spiegare il coinvolgimento dell'HA nella neurogenesi precoce, ed in particolare nel processo di "homing" dei precursori neurali. Si pensa che grazie alla sua espressione in cellule della NC in fase premigratoria, l'HA associato allo loro superficie possa mediare l'interazioni delle cellule migranti con i due principali PGs delle vie migratorie delle cellule, l'aggrecano e de il PG-M/versicano. Questo affinché le cellule possano discriminare le vie preferenziali di migrazione, evitando pertanto di diffondere in zone non permissive dell'embrione [14, 15]. Accumuli localizzati di complessi HA-versicano sembrano contribuire a creare un microambiente all'interno del quale le cellule della NC si muovono in base alle diverse concentrazioni di questi complessi, rispondendo ad un meccanismo che abbiamo definito "aptotassi inversa" [16]. Rimane ad oggi da stabilire se il comportamento migratorio delle cellule della NC sia regolato dalla struttura della ECM, in base alla diversa concentrazione e distribuzione dei complessi HA-versicano, o se sia influenzato da una diretta interazione delle NC con questi componenti [17, 19].

La caratterizzazione strutturale e funzionale e definizione delle proprietà biochimiche delle tre sintasi dell'HA attualmente note nei vertebrati (HAS1-3) ha recentemente aperto nuove vie per studiare il ruolo dell'HA in vitro ed in vivo. Questo sia durante lo sviluppo embrionale che negli organismi adulti, incluso in condizioni patologiche come le neoplasie [20, 22]. Le tre sintasi differiscono sia per la loro distribuzione tissutale che a livello funzionale essendo capaci di sintetizzare catene di HA di diverse lunghezze. Sono state create linee di topo mutanti, "knock-out" per ciascuna delle sintasi. La delezione genica di HAS1 e HAS3 non sembra causare evidenti alterazioni embrionali (J. McDonald e A. Spicer, comunicazione personale) mentre, l'abrogazione genetica di HAS2, causa gravi difetti nella fase iniziale di gestazione conducendo gli embrioni alla morte prenatale a causa di gravi alterazioni nella morfogenesi cardiaca [23, 24].

Le suddette limitazioni contingenti che impediscono un'analisi accurata della funzione dei geni HAS mediante transgenesi nel topo hanno indotto a dirigere gli studi in sistemi modello più favorevoli per l'analisi dell'embriogenesi precoce tramite manipolazioni geniche controllate sia nello spazio che nel tempo, come ad esempio i pesci e gli anfibi. Recentemente è stata determinata la sequenza nucleotidica delle tre sintasi dell'HA dello zebrafish e questo embrione sono anche stati effettuati esperimenti di abrogazione dell'HAS2 mediante l'ulizzo di sonde morpholino. I fenotipi risultanti da queste manipolazioni mostrano un'alterazione nei movimenti delle cellule mesodermiche durante la gastrulazione ed evidenziano pertanto un ruolo dell'HA nell'embriogenesi precoce che appare evoluzionisticamente conservato [25].

In stretta collaborazione le Unità 2 e 3 di questo Progetto hanno recentemente clonati gli omologhi delle tre sintasi del rospo Xenopus laevis determinandone anche una dettagliata espressione spazio-temporale durante lo sviluppo embrionale [26, 27]. Altri ricercatori hanno contemporaneamente dimostrato che XHAS1 e XHAS2 sono in grado di sintetizzare molecole di HA di diverse lunghezze dimostrando una conservazione funzionale anche a livello biochimico/enzimatico di queste sintasi [28]. Un dato emerso dallo studio condotto dalle Unità 2 e 3 che risulta essere particolarmente interessante è l'espressione focalizzate dell'XHAS3 a livello della vescicola otica. Infatti, un recente studio parallelo mostra che l'omologo dello zebrafish di uno dei geni "deafness", dfna5, codifica per l'enzima uridina-5'-difosfato-glucosio deidrogenasi coinvolto nella sintesi dell'HA ed è fondamentale per la corretta morfogenesi dell'orecchio durante lo sviluppo [29]. Questi dati unitamente alla localizzazione dell'espressione di XHAS3 e la diversa lunghezza delle catene di HA sintetizzate da questa sintasi lasciano supporre un ruolo peculiare di XHAS3/HA nella formazione dell'organo vestibolare.

E' inoltre anche interessante notare che le malformazioni cardiache riscontrate nel topo mutante HAS2-/- si presentano palesemente simili a quelle che si manifestano nel topo mutante per il gene Cspg2 codificante per il versicano e ottenuto mediante mutagenesi inserzionale nel cromosoma 13 [30]. Questa scoperta conforta l'ipotesi che i PGs, ed in particolare il versicano, svolgano un ruolo cruciale durante lo sviluppo del cuore [31, 32]. Collegando le due osservazioni si può presumere che i complessi HA-versicano siano essenziali per una corretta cardiogenesi sia nei mammiferi che in altri vertebrati. L'esatta funzione esplicata da complessi HA-versicano in questo contesto rimane però da chiarire.

E' ormai ben documentata la capacità dei recettori di membrana CD44 e RHAMM di tradurre segnali intracellulari in seguito a legame con HA che coinvolgono, da un lato, i sistemi Ras-MEK1/ERK e PI3-chinasi-Akt atti a promuovere la proliferazione e prevenire l'apoptosi attraverso un meccanismo mediato da Bad [33-36] e, dall'altro, ingaggiano l'apparato responsabile per la motilità cellulare attraverso l'attivazione del sistema Rac-Rho/EMR (Ezrin-Moesin-Radyxin) via cSrc/FAK/ROK (Rho-associata chinasi) per il controllo della membrana cellulare e delle dinamiche del citoscheletro responsabili della motilità cellulare [37, 38]. Questi dati ci permettono di ipotizzare che CD44 e RHAMM possano esercitare un ruolo importante nella traduzione del segnale attivato da HA durante lo sviluppo embrionale. L'Unità 2 di questo Progetto ha recentemente clonato l'omologo di CD44 nello Xenopus e ne ha definito l'espressione genica e distribuzione tissutale durante lo sviluppo [39]. In parallelo, l'Unità si sta adoperando per terminare il clonaggio di RHAMM dello Xenopus e definire il suo pattern d'espressione durante le prime fasi embrionali. Questi sforzi ci consentono di avviare studi funzionali di questi recettori durante lo sviluppo embrionale e pertanto contribuire a definire il loro ruolo in vivo.

Oltre alla sua presenza durante lo sviluppo embrionale di tutti i vertebrati, l'HA rappresenta il GAG predominante, nonché più abbondante, fra tutte le componenti della gelatina di Wharton del cordone ombelicale dei mammiferi e dell'uomo. Si hanno, comunque, informazioni limitate circa il ruolo giocato dall'HA nella ECM di questa struttura e quali siano le dinamiche di questa ECM durante le gravidanze normali e aberranti, come nelle gestazioni di feti che vanno incontro a malformazioni. Per diversi decenni, l'aspetto morfologico del cordone ombelicale veniva correlato retrospettivamente dopo il parto, ovvero dopo aver esaminato il neonato e la madre [40-44]. Tradizionalmente, la possibilità di valutare a livello prenatale il cordone ombelicale era stata limitata ad analisi di ultrasonografia per la verifica del numero di vasi e mediante analisi Doppler per l'accertamento della resistenza al flusso sanguigno nelle arterie ombelicali [45, 46]. Più recentemente evidenze cliniche e sperimentali hanno mostrato che la morfologia e la composizione strutturale del cordone ombelicale possono influenzare il corso della gravidanza e l'andamento neonatale [46-48]. L'introduzione di nuove e più sofisticate tecniche di indagine, unitamente ad un crescente interesse per un'attenta valutazione dello stato del cordone ombelicale e l'ultrastruttura della placenta, hanno portato a una migliore conoscenza dei meccanismi che governano lo sviluppo del feto umano. Difatto, è stato recentemente dimostrato che una composizione alterata ed un metabolismo improprio del cordone ombelicale sono frequentemente riscontrati in alcuni disturbi che originano durante la gravidanza (i.e., ristretta crescita fetale, preeclampsia, diabete, morte fetale) e durante il travaglio (i.e., sofferenza fetale, mecomium, tachicardia e aritmie fetali). Inoltre, la presenza di parametri morfometrici anomali del cordone ombelicale sembrano costituire un parametro diagnostico di notevole precocità per la rivelazioni di eventuali disturbi nella crescita fetale. Tali alterazioni sono attualmente facilmente rilevabili tramite un esame sonografico mirato e di più accurata interpretazione rispetto a misurazioni biometriche fetali o parametri di flusso sanguigno all'interno di arterie ombelicali accertati mediante analisi Doppler [46, 49].

Recentemente, l'Unità 3 di questo progetto ha messo in evidenza alterazioni nella struttura del cordone ombelicale di feti affetti da sindrome di Down. Anomalie sono state riscontrate sia nelle dimensioni del cordone che nel suo contenuto di HA [50, 51] e risulta interessante notare che alcune delle caratteristiche di questa sindrome, come l'apparenza translucida delle nuca e all'assottigliamento dell'epidermide in questa regione possono essere attribuite a cambiamenti nella composizione della ECM del cordone ombelicale. Dato che biopsie epidermiche della nuca di feti malati confermano l'aberrante composizione dell'ECM ed implicano l'HA come uno dei componenti maggiormente alterati di questa matrice [52, 53], è ragionevole ipotizzare una diretta correlazione clinica con le variazioni di contenuto dell'HA trovate nell'epidermide di feti con la presenza di trisonomia 21. In questo contesto, è anche interessante notare che in topi in cui l'espressione di CD44 è stata geneticamente abrogata si è rilevata un'alterazione fenotipica a carico dell'epidermide che risulta più soffice e parzialmente tumefatta (Ivan Stamenkovic, comunicazione personale). Inoltre, considerando che feti con sindrome di Down hanno un rischio 500 volte maggiore a feti normali di sviluppare malformazioni cardiache e che, come precedentemente descritto, abrogazioni del gene HAS2 nel topo e nello Xenopus provocano alterazioni nella formazione del cuore, è plausibile che questa condizione patologica possa essere associata a difetti nel metabolismo dei GAGs ed in particolare dell'HA.

Nella vita adulta, livelli tissutali di HA e di PGs della ECM possono fluttuare in varie condizioni patologiche come una causa diretta dello stato della malattia, o in seguito al tentativo dell'organismo di riparare un eventuale danno tissutale o fermare la crescita di una lesione neoplastica. Infatti, la trascrizione e la secrezione di alcuni componenti dell'ECM è frequentemente alterata durante i processi infiammatori e fibrotici e specialmente durante questi ultimi, rappresenta una peculiarità di questa condizione. E' anche ben noto che alcuni pazienti con tumore e individui affetti da malattie degenerative, ereditarie o acquisite, possono mostrare livelli anormali di queste componenti nel sangue periferico e in altri fluidi corporei dove essi vengono frequentemente riscontrati in forme degradate. Ad esempio, durante la cancerogenesi si sospetta che l'accresciuta concentrazione plasmatica di HA, frammenti di questo e altri GAGs, PGs ed i loro prodotti di degradazione sia causata da un rilascio di questi componenti da parte delle cellule tumorali (che producono sia alte quantità di queste molecole che degli enzimi capaci di degradarle) in crescita e/o in fase di diffusione. Quindi sia macromolecole prodotte dalle cellule tumorali stesse e molecole prodotte dai tessuti adiacenti, incluso lo stroma intratumorale, possono essere ulteriormente e aberrantemente processate dai numerosi enzimi degradanti l'ECM e rilasciati in queste neoformazioni.

Nel caso di malattie degenerative, l'incremento di livelli dell'HA circolante, il rilascio di GAGs dalla componente proteica di vari PGs e la presenza di frammenti proteolitici di queste proteine centrali mettono chiaramente in luce lo stato di degradazione del tessuto. Risulta quindi di grande importanza mettere a punto protocolli e strategie per monitorare questi cambiamenti nel siero in modo efficace, riproducibile e combinabile con approcci di proteomica e glicomica. E' auspicabile che tali sistemi possano far emergere nuovi parametri diagnostici e/o prognostici non invasivi per il trattamento di tali patologie. <<<