RICERCA ITALIANA     

Studi strutturali su proteine che legano molecole idrofobiche

Università degli Studi di Verona

Abstract

Il programma riguarda la caratterizzazione a livello molecolare di una famiglia di proteine che hanno in comune la funzione di legare molecole lipofile e verra' condotto combinando metodologie che sono in grado di fornire informazioni strutturali molto dettagliate, quali la cristallografia a raggi X, tecniche spettroscopiche, in modo particolare NMR, la spettrometria di massa, tecniche elettroforetiche non convenzionali e la determinazione della sequenza aminoacidica. Le proteine prese in esame sono rappresentative di un numero molto limitato di folds differenti e, per due di questi, nell'elenco vi e' piu' di una proteina. Inoltre uno degli aspetti presi in esame riguarda il ruolo cruciale svolto da alcune delle proteine di questo gruppo nell'importante funzione di trasporto di vitamine nei vertebrati. Il nostro programma prevede lavoro sperimentale su due trasportatori di vitamine : la riboflavin-binding protein e il fattore intriseco, trasportatore della vitamina B12 (cobalamina). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Ugo Luigi MONACO Università degli Studi di VERONA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo programma di ricerca e' la continuazione di una proposta gia' finanziata tre volte nell'ambito dei PRIN e quindi le diverse unita' operative hanno stabilito collaborazioni consolidate che hanno gia' prodotto risultati apprezzabili nel campo. Lo scopo di questo programma di ricerca e' stato ed e' quello di combinare tecniche diverse e complementari disponibili presso le unita' partecipanti e di applicarle allo studio delle interazioni fra alcune proteine che hanno la proprieta' di legare piccole molecole idrofobiche e ligandi specifici o composti ad essi strutturalmente correlati. Le tecniche disponibili sono quelle piu' utilizzate dalla moderna analisi strutturale delle macromolecole biologiche e cioe' la cristallografia a raggi X, la spettroscopia NMR, UV, visibile e di fluorescenza, la spettrometria di massa, il mappaggio di epitopi ed altri metodi immunologici oltre ai metodi elettroforetici sofisticati e ai metodi chimici convenzionali di sequenza. Le proteine scelte, che nell'evolversi del programma hanno visto la sostituzione di alcuni membri della lista con altri nuovi, rappresentano un ampio spettro di proteine leganti molecole idrofobiche e sono oggetto di intensa attivita' di ricerca da parte di molti gruppi importanti di tutto il mondo. In questo progetto verranno studiate le proprieta' della siero albumina umana, che costituisce probabilmente l'esempio piu' studiato di proteina di trasporto. La nostra lista comprende inoltre quattro lipocaline, membri di una famiglia strutturale molto nota, l'alfa 1 microglobulina, la beta-lattoglobulina, l'apolipoproteina D e la prostaglandina D sintetasi (beta-trace). Quest'ultima proteina e' la prima lipocalina per la quale sia dimostrata attivita' enzimatica. Le bile acid-binding proteins, trasportatori di acidi biliari, appartengono ad una famiglia vicina strutturalmente alle lipocaline. In questo progetto, intendiamo continuare il nostro lavoro strutturale sulla fatty acid-binding protein (basica) da fegato di pollo che e' una piccola proteina appartenente alla famiglia dei trasportatori di lipofili intracellulari (le lipocaline citate sono infatti extracellulari) ed includere nella ricerca la ileal lipid-binding protein umana che è correlata sia strutturalmente che funzionalmente alla precedente. La riboflavin-binding protein appartiene ad una diversa famiglia strutturale che comprende anche i recettori del folato, proteine estrinseche di membrana coinvolte nell'assimilazione del folato e alterate in alcuni processi neoplastici. Di questa famiglia di proteine, la piu' nota e' la riboflavin-binding protein dell'albume di uovo di gallina che e' anche l'unica della quale sia stata determinata la struttura tridimensionale per diffrazione dei raggi X. Anche se la cobalamina non può essere definita un ligando idrofobico, abbiamo deciso di dedicare parte dei nostri sforzi a cercare di caratterizzare uno dei suoi trasportatori specifici, il fattore intrinseco, perchè nessun tipo di informazione strutturale su nessun trasportatore di questa importante vitamina è al momento disponibile. Infine, una nuova molecola aggiunta alla nostra lista è la astaxanthin-binding protein di Velella velella, una molecola di intenso colore blu dovuto alla presenza del carotenoide e la cui sequenza non è nota. I pochi dati esistenti in letteratura suggeriscono che potrebbe essere strutturalmente correlata alle lipocaline che, da anni, rappresentano un argomento di ricerca da parte dei nostri gruppi.
Ad ognuna delle proteine citate cercheremo di applicare tutte le tecniche di cui disponiamo con lo scopo finale di descriverne nel modo piu' dettagliato possibile la struttura ed il meccanismo di riconoscimento o del ligando. <<<

Risultati parziali attesi

a) Albumina.
La caratterizzazione della modificazione post-traduzionale dell'abumina isolata dal liquido amniotico verrà inizialmente condotta sulla base dell'ipotesi che il composto legato sia un derivato del metabolismo del triptofano. Al termine del primo anno questa ipotesi sarà stata verificata e, se risulterà vera, anche la definizione delle proprietà strutturali dell'addotto sarà completata. Se invece i dati riveleranno una modificazione differente durante la prima fase avremo completato con analisi spettrofotometriche UV-vis di fluorescenza e CD la definizione delle sue proprietà ottiche. Inoltre l'indagine mediante spettrofotometria di massa dei frammenti triptici della proteina avrà individuato quelli coinvolti e saranno disponibili informazioni sul ligando. Prevediamo di definire sia i difetti molecolari che causano analbuminemia ed ipoalbuminemia, se quest'ultima è una condizione congenita, sia le sostituzioni aminoacidiche delle bisalbumine isolate dai campioni di siero pervenuti.
b) Beta-Lattoglobulina.
Durante la prima fase ci aspettiamo di produrre le beta-lattoglobuline bovina e porcina (BLG, PLG) doppiamente arricchite (13C e 15). Contiamo inoltre di avere a disposizione tutti i mutanti descritti nel progetto oltre ai nuovi selezionati sulla base dei risultati di folding e interazione. Pensiamo inoltre di completare la determinazione della struttura tridimensionali, tramite NMR e simulazioni di dinamica molecolare, di PLG. Contemporaneamente, ci aspettiamo di completare la determinazione dei parametri termodinamici relativi alla denaturazione della PLG e la caratterizzazione degli stati denaturati della proteina, in modo da evidenziare eventuali residui capaci di giocare un ruolo fondamentale nella determinazione del meccanismo di folding.
Per la BLG il docking molecolare permetterà una miglior conoscenza delle proprietà del calice e delle caratteristiche rilevanti a livello dei ligandi. Si prepareranno nuovi complessi della BLG con farmaci scelti sulla base dei risultati degli esperimenti di docking.
Si chiarirà il comportamento anomalo della BLG in DGGE a pH 5.
c) Alfa-1-Microglobulina.
Durante la prima fase avremo isolato il dimero e gli oligomeri ed avviato la caratterizzazione dei residui coinvolti nei cross-links. Le condizioni ottimali per deglicosilare la proteina, già in fase di studio, saranno state definite e prevediamo di poter avere un'aliquota della proteina per avviare prove di cristallizzazione.
d) Apolipoproteina D.
I problemi che bisognerà risolvere per ottenere quantità adeguate di proteina ricombinante saranno stati individuati.
e) Prostaglandina-D-Sintetasi.
La sua purificazione dal liquido amniotico sarà condotta in parallelo con quella dell' alfa-1-microglobulina, e pertanto la proteina sarà disponibile.
Si valuterà l'affinità della PGDS umana per sostanze idrofobiche in paragone alla PGDS murina, già caratterizzata. Questi risultati miglioreranno la conoscenza del ruolo di questa proteina nei fluidi biologici chiarendone le caratteristiche in rapporto a quelle di altre lipocaline.
f) Bile Acid-binding Proteins.
Ci sarà nuova informazione disponibile sui co-cristalli della Lb-FABP di pollo.
Durante la prima fase ci aspettiamo inoltre di produrre Lb-FABP doppiamente arricchita (13C e 15) e di determinare le sue strutture tridimensionali tramite NMR e simulazioni di dinamica molecolare, sia in forma apo che olo. Si completerà inoltre la determinazione delle proprietà dinamiche della proteina nelle forme apo e olo, ottenuta tramite l'analisi dei parametri di rilassamento NMR acquisiti a diversi campi magnetici. Tali dati permetteranno di chiarire il ruolo della dinamica nell'interazione. Avremo inoltre la caratterizzazione strutturale dei mutanti
L'analisi bioinformatica sulla famiglia delle fatty acid binding protein contribuirà alla definizione delle proprietà del calice. Specificamente, si identificheranno gli aminoacidi coinvolti in interazioni dirette con i ligandi e se ne descriverà il ruolo nel legame e nella selettività. Per la Lb-FABP si valuterà l'affinità nei confronti di vari acidi biliari in paragone a quella per ligandi già noti. Paragonare i risultati teorici e sperimentali aiuterà ad identificare i ligandi naturali e i determinanti dell'affinità (bilancio tra sostituenti idrofobici ed idrofili).
g) Riboflavin Binding Protein.
Probabilmente potremo disporre di anticorpi specifici per la proteina ricombinante di Xenopus laevis prodotti nel topo e/o nel coniglio.
h) Fattore Intrinseco Umano.
I primi passi verso la produzione di quantità adeguate di proteina ricombinante saranno stati compiuti.
i) Astaxanthin Binding Protein.
Durante il primo anno avremo isolato le subunità che sono complessate con il carotenoide a formare i dimeri. Il problema principale che abbiamo incontrato è proprio l'elevata affinità del ligando per cui la sua rimozione richiede condizioni che portano ad una bassa resa di proteina.a) Albumina.
I risultati attesi nel secondo anno dipenderanno dall'identità della molecola che altera le proprietà spettrali della proteina amniotica: pertanto sarà o completata la caratterizzazione della proteina modificata dai derivati del triptofano o identificato il composto e la natura del legame. Lo studio delle proprietà di legame delle varianti genetiche caratterizzate permetterà di stabilire se ed in qual misura i residui sono coinvolti nell'interazione con il ligando.
b) Beta-Lattoglobulina.
Durante la seconda fase si completerà l'analisi dei residui determinanti per il folding tramite l'utilizzo combinato di metodi computazionali e di esperimenti di mutagenesi sito-diretta. Sarà inoltre completata l'analisi dell'effetto dell'"affollamento molecolare" sul folding. Lo studio dettagliato del comportamento dell'apo-BLG e dei suoi complessi ad alta temperatura chiarirà le condizioni per la complessazione dopo perturbazione termica della BLG in presenza di specifici ligandi.
Complessi BLG-farmaco verranno valutati per stabilità chimico-fisica (pH, forza ionica) e biologica (proteolisi): questi risultati confermeranno la possibilità di impiegare la BLG come veicolo per l'assorbimento intestinale di farmaci idro-insolubili o acido-labili.
c) Alfa-1-Microglobulina.
Saranno state definite le condizioni che promuovono la formazione di complessi della lipocalina con albumina, IgA ed anche con altre proteine plasmatiche. La disponibilità di tirosinasi, da noi isolata in forma omogenea da Agaricus bisporus, che determina la ossidazione della 3-OH-chinurenina a xantommatina consentirà di stabilire se gli addotti sono substrati delle monofenolo-ossidasi. Saranno completate le prove di cristallizzazione sulla proteina amniotica deglicosilata.
e) Prostaglandina-D-Sintetasi.
Le condizioni ottimali per il trattamento con acido trifluorometansolfonico saranno state applicate anche alla prostaglandina-D-sintetasi, naturale e ricombinante. La stabilità condizionale dei complessi più interessanti caratterizzati durante il primo anno sarà paragonata a quella dell'apoproteina e si chiariaranno i cambiamewnti strutturali determinati dall'interazione.
f) Bile Acid-binding Proteins.
Ci sarà nuova informazione su co-cristalli di diversi complessi della Lb-FABP di pollo. Per i complessi più stabili si valuteranno con prove spettroscopiche e biologiche cambiamenti in accessibilità e flessibilità di regioni specifiche della proteina che subentrano dopo l'interazione. Si calcoleranno le pKhalf e si valuteranno le curve pKa vs pH per residui con pKhalf anomale. Si confermerà l'ipotesi dell'interazione contemporanea con ligandi diversi. Si valuterà la possibilità che il legame delle vastatine alle lipid binding protein possa mediarne gli effetti avversi nel corso di terapia ipolipidemizzante. Verranno inoltre caratterizzate le proprietà di folding ed il ruolo della dinamica nell'interazione.
g) Riboflavin Binding Protein.
Sulla base delle informazioni ottenute dall'elettroforesi 2D risolta in Western blot avremo definito il pI, la massa molecolare e l'abbondanza relativa della proteina nelle uova di Xenopus laevis ed avremo sviluppato un protocollo per la sua purificazione da questa fonte.
i) Astaxantin Binding Protein.
Avremo purificato i monomeri che costituiscono la proteina che, probabilmente, sono due ed hanno sequenze molto omologhe. Questo ci permetterà di raggiungere il primo obiettivo rappresentato dalla definizione della struttura primaria completa. Inoltre l'unità di Napoli avrà completato la caratterizzazione assegnando i ponti disolfuro. Sulla base dei dati in letteratura riguardanti la alfa-crustacianina, prevediamo di poter ricostituire il complesso e speriamo di avere ottenuto cristalli con buone proprietà di diffrazione ai raggi X. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La partecipazione di metaboliti idrofobici alle reazioni biochimiche che si svolgono in un ambiente acquoso richiede che essi vengano resi solubili in acqua e trasportabili nei vari compartimenti acquosi. Il meccanismo che si e' sviluppato nel corso dell'evoluzione si basa sul legame tra questi composti e proteine solubili. Pertanto la prima funzione di queste molecole, che di seguito indicheremo come proteine che legano molecole idrofobiche, e' quella di rendere possibile la disponibilita' di queste sostanze nell'ambiente acquoso dove sono necessarie. Nonostante la solubilizzazione ed il trasporto siano le funzioni piu' studiate e meglio definite delle proteine che legano molecole lipofile, esse non rappresentano sicuramente l'unico ruolo proposto per queste macromolecole. Per molte di esse infatti e' stata descritta la capacita' di riconoscere altre macromolecole e, in alcuni casi, quella di svolgere il ruolo di regolatori metabolici.
La siero albumina rappresenta il prototipo dei trasportatori di sostanze lipofile ed appartiene ad una famiglia di proteine i cui componenti non sono altrettanto noti. E' una delle proteine piu' studiate con la maggior parte delle tecnice chimico-fisiche disponibili (a1). La sua struttura tridimensionale e' stata risolta mediante diffrazione di raggi X (a2, a3) e le coordinate del modello dell'apoproteina e quelle del complesso con gli acidi grassi (a4) e con il warfarin (a5) sono state depositate. Le sue proprietà di legame nei confronti di molte molecole esogene ed endogene non sono ancora state definite ed i suoi mutanti naturali, con sostituzioni note nei siti di legame, rappresentano un utile strumento per studiare il ruolo dei residui coinvolti.
Le lipocaline costituiscono un'altra famiglia di proteine, alcune delle quali con struttura tridimensionale nota, che condividono lo stesso fold nonostante non abbiano sempre un'elevata omologia di sequenza (1). Il loro caratteristico ripiegamento, identificato per la prima volta nella retinol binding protein, e' una struttura a botte beta-antiparallela che, in tutte le lipocaline finora studiate, accoglie al suo interno il ligando idrofobico. Il nostro progetto di ricerca riguarda quattro lipocaline, tre delle quali, la beta-lattoglobulina, l'alfa 1 microglobulina e l'apolipoproteina D con funzione non ancora definita, mentre la quarta, la prostaglandina D sintetasi o beta-trace, e' una delle poche proteine di questa famiglia ad avere attivita' enzimatica.
La beta-lattoglobulina non e' presente nel latte di tutti i mammiferi e la sua funzione biologica resta da definire, ma, data la sua abbondanza e la facilita' di purificazione, costituisce un modello che e' stato studiato con ogni tecnica chimico-fisica (b1). Sono state determinate le strutture a raggi X di varie forme cristalline dell'apoproteina e dei suoi complessi con alcuni ligandi idrofobici (b2, b4, b4). In tutti questi complessi il ligando si colloca all'interno della cavita' a botte beta, analogamente a quanto avviene per le altre lipocaline e l'unità operativa Milano ha dimostrato che l'affinità per gli acidi grassi è modulata dal pH e dalla forza ionica. L'unita' operativa di Verona 2 ha determinato la struttura della proteina mediante NMR e condotto studi sul processo di legame (b5) e unfolding (b6) che, unitamente a calcoli teorici, stanno fornendo informazioni molto dettagliate sul comportamento di questa proteina modello.
L'alfa 1 microglobulina e' stata inclusa nella famiglia delle lipocaline sulla base della sua omologia di sequenza con le altre proteine del gruppo ed in particolare con quella della epididymal retinoic acid-binding protein (c1, c2). E' una delle lipocaline glicosilate e lega covalentemente un cromoforo la cui struttura è stata determinata dall'unità di Pavia durante il progetto precedente. Rimane però sconosciuta la sua funzione biologica e non e' noto se abbia affinita' per uno specifico ligando lipofilo.
L' apolipoproteina D (ApoD) è una glicoproteina di 29 KDa che si ritiene appartenga alla famiglia delle lipocaline in base alla sua sequenza aminoacidica (d1, d2). Non ci sono attualmente informazioni sperimentali sulla sua struttura tridimensionale. Anche se è stato verificato che la proteina può legare colesterolo, progesterone (d2), bilirubina (d3), acido arachidonico (d4) e una sostanza odorante lipofilica delle ascelle umane che si crede funga da feromone (d5), il suo ligando fisiologico specifico non è stato ancora identificato. Il relativo gene è espresso in molti tessuti e variazioni significative del livello di espressione sono state osservate nel liquido cerebro spinale e/o nel plasma in diverse patologie (d6), comprese malattie del sistema nervoso di grande importanza come l'Alzheimer.
La prostaglandina D sintetasi (PGDS) e' la sola lipocalina tra quelle che studieremo che abbia funzione enzimatica. E' abbondante nel liquido cerebro-spinale ed e' presente in quantita' significative anche nei liquidi seminale ed amniotico(e1, e2, e3). Catalizza la conversione della prostaglandina H2 (PGH2) in prostaglandina D2 (PGD2). Quest'ultima rappresenta una delle principali PG del sistema nervoso centrale dei mammiferi dove svolge numerose funzioni, tra cui l'induzione del sonno e dell'ipotermia, ed e' stato suggerito che possa essere un nuovo tipo di neuromodulatore o neurotrasmettitore (e2, e3). E' stato dimostrato che la proteina ricombinante lega diverse molecole idrofobiche, quali retinoidi, pigmenti biliari, ed ormoni tiroidei, (d3) ma non e' stato identificato un ligando fisiologico non substrato. L'omologia di struttura primaria consente di includerla con certezza tra le lipocaline ma la sua struttura tridimensionale non e' nota.
La famiglia delle proteine intracellulari che legano i lipidi e' correlata alle lipocaline dalle quali si differenzia per la presenza di 10, anziche' 8, motivi a struttura-beta nel fold a botte-beta (f1). E' stata determinata la struttura tridimensionale di diversi componenti di questa famiglia ed in particolare e' stata studiata quella della fatty acid binding protein da fegato di ratto (FABP) (f2) che, a differenza delle altre, lega due molecole di acidi grassi anziche' una sola. Qualche anno fa abbiamo scoperto, purificato, cristallizzato (f3) e determinato la struttura ai raggi X di una proteina di questa famiglia che ha un valore di punto isoelettrico insolitamente elevato (f4). E' stata denominata fatty acid binding protein (basica) da fegato di pollo. La presenza di una proteina analoga e' stata dimostrata nel fegato di altri vertebrati (f2) ma finora non e' stata riscontrata nei mammiferi. Durante il progetto precedente, l'unità di Verona 1 ha dimostrato che la proteina lega due molecole di acidi biliari, proprietà che la rende simile alle ileal lipid-binding proteins (o gastrotropine) dei mammiferi con le quali condivide anche una significativa omologia di sequenza (f5). Ci sono attualmente due strutture NMR delle ileal lipid-binding proteins ma non c'è nessuna struttura cristallografica.
Le riboflavin binding proteins specifiche (RfBPs) appartengono ad un'altra famiglia strutturale. E' opportuno indicare che si tratta di trasportatori specifici poiche' vi sono anche altre proteine che nel plasma legano la riboflavina, come l'albumina. Le RfBPs sono essenziali durante la gravidanza quando quantita' adeguate di vitamina sono indispensabili per la sopravvivenza del feto (g1, g3). L'unica RfBP della quale sia nota la struttura tridimensionale e' quella isolata dall'albume di uovo. Presenta un nuovo tipo di fold che e' caratterizzato dalla presenza di ben nove ponti disolfuro (g2). Nonostante vi siano molti dati che suggeriscono l'esistenza di RfBPs non aviarie, nessuna di queste e' stata caratterizzata a livello molecolare.
L'assorbimento della cobalamina (Cbl, vitamina B12) è mediato nei mammiferi da una serie di proteine specifiche. La vitamina è inizialmente legata nello stomaco all'aptocorrina e dopo la degradazione proteolitica di quest'ultima viene trasferita al fattore intrinseco (IF) nel duodeno. Il complesso fattore intrinseco-Cbl viene quindi assorbito dal bordo apicale delle cellule e dopo un certo tempo la vitamina è liberata nel sangue dove circola legata ad un altro trasportatore specifico, la transcobalamina II (TC II). Entrambi IF e TC II legano la vitamina con un'alta affinità e le due proteine condividono alcune caratteristiche strutturali anche se i loro livelli di espressione nei diversi tessuti sono completamente differenti (h1, h2, h3). Anche il recettore per il complesso IF-Cbl, la cubilina, è stato oggetto di numerosi studi ed alcuni modelli sono stati proposti per la sua struttura (h4). Nonostante il cDNA codificante per l'IF umano sia disponibile da parecchio tempo (h5) e la proteina sia già stata espressa in Pichia pastoris (h6), non c'è ancora alcuna informazione riguardante la sua struttura tridimensionale. La TC II è stata cristallizzata ma la sua struttura cristallina non è ancora stata risolta e quindi non ci sono attualmente informazioni strutturali su nessuno di questi importanti trasportatori di vitamina.
Le carotenoproteine sono responsabili delle variegate colorazioni di molti invertebrati e si caratterizzano per una grande variabilità nelle loro caratteristiche fisiche e chimiche. Ad eccezione dell'alfa crustacianina, la proteina blu che lega l'astaxantina del guscio dell'aragosta, non c'è attualmente nessuna informazione sulla struttura dei membri di questa famiglia proteica. L'unità Pavia ha isolato in modo omogeneo la astaxanthin-binding protein da Velella velella, un condroforo che vive sulla superficie oceanica di caratteristico colore blu (i1). La proteina è un'oligomero di struttura primaria non nota ma, sulla base delle sue proprietà di legame, si ritiene appartenga alla famiglia delle lipocaline. L'unità ha iniziato la caratterizzazione strutturale della carotenoproteina da Velella velella e ha trovato che, sulla base della sequenza parziale degli aminoacidi, non ha omologia di struttura primaria con l'alfa crustacianina di aragosta ne con altre proteine di sequenza nota. Un'altro obiettivo di questo programma sarà quindi quello di caratterizzare da un punto di vista strutturale questa proteina e di stabilire quale sia il suo rapporto con le altre proteine della nostra lista. <<<