RICERCA ITALIANA     

Caratterizzazione strutturale e funzionale di proteinchinasi con potenziale oncogenico.

Università degli Studi di Padova

Abstract

Quasi tutti gli aspetti della vita sono controllati dalla fosforilazione di proteine catalizzata da proteinchinasi, enzimi normalmente quiescenti e attivati solo in risposta a determinati stimoli. Una loro alterata regolazione, come quella che ne determina un'elevata attività basale, è causa di molte malattie e, in particolare, delle neoplasie. Questo progetto è stato concepito per riunire gli sforzi di quattro laboratori, già legati da una consolidata collaborazione, allo scopo di approfondire i rapporti struttura-funzione di alcune proteinchinasi potenzialmente oncogeniche. La caratterizazione biochimica e funzionale dei meccanismi molecolari alla base della loro specificità di substrato, dell' interazione con partners cellulari e della modulazione della loro attività catalitica verrà eseguita in due laboratori che vantano una lunga esperienza nel campo della fosforilazione proteica e che si appoggiano, per quanto riguarda la sintesi chimica e le analisi di tipo strutturale, sulla collaborazione di due altre Unità esperte, rispettivamente, in sintesi organica e in cristallografia. La ricerca si focalizzerà su cinque proteinchinasi sia Ser/Thr (CK1 e CK2) che Tyr-specifiche (NPM/Alk, RET e FLT3), tutte con documentata implicazione in patologie di tipo tumorale. La CK1 rappresenta un bersaglio interessante di svariati processi cellulari tra cui la trasduzione del segnale Wnt e la risposta immunitaria dei linfociti. Il suo meccanismo di azione si avvale spesso della fosforilazione gerarchica ma i determinanti della specificità di sito e i suoi partners cellulari sono ancora poco conosciuti. Sarà pertanto uno dei primi obiettivi di questo progetto quello di capire le basi molecolari del legame con i substrati fosfodonatori e fosfoaccettori della CK1. Nel caso della CK2, una chinasi pleiotropica con un'attività basale insolitamente elevata, si sono ottenute molte informazioni in questi ultimi anni proprio attraverso la collaborazione tra alcune delle Unità partecipanti al progetto. Ora, con l'obiettivo di ottenere nuovi e più potenti inibitori permeabili alla cellula, si cercherà di confermare in vivo il ruolo antiapoptotico di CK2 e di indagare sui processi in cui essa è implicata. Le tirosine chinasi NPM/Alk e RET rappresentano un chiaro esempio di proteine oncogeniche di fusione che risultano specificamente espresse in cellule neoplastiche e legate a processi di trasformazione. La prima di esse, come Bcr/Abl, porta alla trasformazione maligna di linfociti normali ed è responsabile di circa il 5% di tutti i linfomi non-Hodgkin. Forme alterate di RET, d'altra parte, sono state associate a circa il 30% dei carcinomi papillari sporadici e al 70% di quelli indotti da radiazioni. Un primo obiettivo per Alk sarà la messa a punto di un saggio di attività da utilizzare in studi di biologia cellulare per identificare nuovi partners e per monitorare la risposta a stimoli esterni e/o a inibitori. Si cercherà anche di allestire esperimenti per la cristallizazione di Alk e dell'altra proteina oncogenica di fusione, RET, per le quali mancano ancora informazioni strutturali di tipo 3D. Infine si cercheranno di ottenere informazioni sul meccanismo di auto-inibizione di FLT3, una tirosina chinasi recettoriale con un ruolo chiave nell'ematopoiesi e le cui forme mutate sono state identificate in varie leucemie. Ciò sarà possibile attraverso la definizione della struttura 3D del dominio chinasico completo di FLT3, comprensivo anche della regione KID, che era assente in una struttura risolta recentemente. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Flavio MEGGIO Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto si articola in quattro linee di ricerca integrate e complementari aventi in comune l'obiettivo di sviluppare strategie per modulare l'attività in vivo di alcune proteinchinasi con potenziale oncogenico e, precisamente, due chinasi Ser/Thr-specifiche (CK1 e CK2) e tre tirosine chinasi (NPM-Alk, RET e FLT3). Il raggiungimento di questo obiettivo sarà realizzabile sfruttando le competenze delle unità partecipanti al progetto la cui integrazione dipende strettamente dalla sequenza temporale dell'approccio scientifico: la caratterizzazione biochimica dei rapporti struttura-funzione delle chinasi, condotta soprattutto da parte delle Unità di Padova 1 e Milano, richiede effettori/modulatori prodotti dall'Unità di Venezia ed entrambe queste fasi sono preliminari per offrire materiale e informazioni all'Unità di Padova 2 coinvolta in esperimenti di co-cristallizzazione. L'Unità di Venezia si occuperà pertanto della parte di sintesi e contribuirà alla preparazione e purificazione di nuovi composti organici che serviranno per portare a termine l'intero programma previsto dal progetto. A loro volta, informazioni derivanti dall'approccio strutturale in 3D condotto dall'Unità di Padova 2 saranno utili per pianificare nuovi composti da utilizzare negli esperimenti in vivo eseguiti anche in questo caso dalle Unità di Padova 1 e di Milano. Fondamentali per il raggiungimento dell'obiettivo finale sono una serie di goal intermedi che di per sé rappresenterebbero già un notevole progresso verso una migliore comprensione delle caratteristiche strutturali e funzionali che sono alla base del potenziale oncogenico delle chinasi oggetto di questo studio.
In particolare, nel caso della proteinchinasi CK2, questi saranno i sotto-obiettivi:
a) un sostanziale miglioramento nell'efficacia e selettività di inibitori attraverso sia modifiche chimiche di inibitori già disponibili e ispirate da modeling computerizzato di strutture 3D sia con la sintesi di nuove molecole. In particolare, la progettazione e sintesi di inibitori di CK2 si focalizzerà sulla struttura del nuovo potente e specifico inibitore identificato da Novartis, (acido (5-oxo-5,6-diidroindolo[1,2-a] chinazolin-7-il)acetico). Le molecole saranno studiate in base alle considerazioni fornite dalla struttura del cristallo CK2/inibitore, così come determinata dall'Unità di Padova 2. I test di attività su questa chinasi saranno effettuati dall'Unità Operativa di Padova 1.
b) l'analisi 3D di complessi tra CK2 e alcuni composti scelti in grado di mettere in luce gli aspetti molecolari dell'inibizione.
c) la produzione di nuovi mutanti di CK2 resistenti a specifici inibitori da utilizzare per la validazione in vivo delle risposte cellulari mediate dalla CK2 con particolare riguardo al suo potere antiapoptotico.
La caratterizzazione strutturale e funzionale della proteinchinasi CK1 si propone soprattutto di:
a) produrre mutanti dell'isoforma alfa della CK1 di D. rerio che siano difettosi nel riconoscimento del substrato e che permettano di mappare le interazioni tra i determinanti di specificità e il sito catalitico della chinasi. Obiettivo prioritario, da questo punto di vista, sarà quello di identificare i residui della CK1 implicati nel riconoscimento del fosfato durante il processo di fosforilazione gerarchica.
b) definire la struttura cristallina di una forma troncata C-terminale della CK1 delta di D. rerio sia da sola che in complesso con peptidi o inibitori. La produzione di quantità di CK1 adeguate per prove di cristallizzazione è già attualmente in corso.
Infine, nel caso delle tirosine chinasi NPM-Alk, RET e FLT3, che saranno prodotte come proteine ricombinanti dall'Unità di Milano e messe a disposizione delle Unità di Padova 1 e Padova 2 per studi a carattere biochimico e strutturale, rispettivamente, verranno perseguiti i seguenti sotto-obiettivi:
a) identificazione di nuovi partners cellulari di NPM-Alk attraverso esperimenti di co-immunoprecipitazione.
b) valutazione della rilevanza delle tre tirosine presenti nell'activation loop di Alk, nonché della loro cinetica di fosforilazione.
c) produzione di una forma ricombinante funzionalmente attiva della tirosina chinasi umana RET da impiegare in esperimenti di cristallizzazione da parte dell'Unità di Padova 2.
c) la determinazione della struttura tridimensionale di alcune chinasi tirosiniche conivolte in processi oncogenici, come RET, NPM-Alk ed il dominio chinasico di FLT3 comprensivo dell'inserto KID.
d) Sintesi di nuovi inibitori di tirosin chinasi: i) la sintesi di una serie di omologhi di STI-571 (Gleevec), basati sulla struttura fondamentale dell'inibitore, ma modificati sulla base di simulazioni di modellistica molecolare sarà principalmente rivolta alla sostituzione dell'anello benzoico, legato alla funzionalità piperazinica di Gleevec, con anelli nicotinici opportunamente sostituiti. Lo schema retrosintetico proposto permetterà di ottenere diverse funzionalità modificate a partire dallo stesso precursore. ii) verrà avviata la sintesi di una serie di nuovi inibitori potenziali della proteina di fusione oncogenica NPM-Alk, identificati nell'ambito della collaborazione tra le U.O. di Milano, Venezia e Padova. La struttura generale dei target sintetici consiste in due serie di tre anelli insaturi con gruppi accettori e donatori di legami idrogeno opportunamente locati. Strutture che presentano una funzionalità amminica sugli anelli terminali sono considerate di particolare interesse.
Un ulteriore aspetto di questa linea di ricerca consisterà nel processo di generazione di librerie di prodotti a partire sia dai nuovi composti appena descritti, che da molecole commercialmente disponibili. <<<

Risultati parziali attesi

- determinazione delle costanti cinetiche per i nuovi inibitori di CK2 (e/o di CK1).
- produzione di mutanti di CK2 resistenti a specifici potenti inibitori.
- identificazione di residui del sito catalitico di CK1 implicati nel riconoscimento del <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La regolazione dell'attività delle macromolecole biologiche si esplica essenzialmente attraverso due meccanismi: l'allosterismo e la modifica covalente di cui la fosforilazione proteica costituisce l'esempio più diffuso e utilizzato. L'importanza di tale modalità di regolazione è stata ulteriormente avvalorata dalle recenti definizioni del genoma di vari organismi che hanno messo in evidenza come non meno del 2% dei geni totali di un organismo codifichi per proteinchinasi. Tuttavia, da quando nel 1978 il fattore trasformante del virus del sarcoma di Rous fu dimostrato essere una proteinchinasi e, alcuni anni dopo, si scoprì che gli esteri del forbolo, causa di tumori, erano dei potenti attivatori della PKC, le proteinchinasi sono diventate il secondo più importante target farmacologico dopo i recettori associati alle G-proteine (1). E' facile comprenderne la ragione per svariati motivi. Innanzitutto, le protein chinasi sono responsabili della fosforilazione delle proteine che è il meccanismo più frequente e generale che controlla pressochè tutte le funzioni cellulari. In secondo luogo le protein chinasi giocano un ruolo fondamentale nella trasduzione del segnale e nella regolazione dell'espressione genica e del turnover delle proteine, cioè eventi cruciali per la proliferazione, differenziazione e morte cellulare. Non deve sorprendere quindi che da un lato più di metà dei protooncogeni codifichino protein chinasi, e dall'altro alterazioni strutturali o funzionali di protein chinasi siano spesso responsabili di patologie umane, con particolare riguardo a neoplasie (2). Come regola generale il potenziale oncogenico è proporzionale all'aumento o alla intempestiva comparsa di attività di protein chinasi, il che conferisce ipso facto agli inibitori di protein chinasi interesse come potenziali farmaci antineoplastici. In terzo luogo le protein chinasi sono enzimi, il che significa che, indipendentemente dalla complessità della loro struttura, la loro attività biologica può venire spenta in un modo semplice e diretto andando a colpire un sito catalitico ben conservato le cui caratteristiche strutturali o sono già note o possono essere conosciute in dattaglio. In quarto luogo, benchè tutte le protein chinasi catalizzino la stessa reazione - il trasferimento di un fosfato dall'ATP (o raramente il GTP) al substrato proteico fosfoaccettore - esse presentano sottili differenze strutturali che riflettono le variabili proprietà di ciascuna. Ciò può essere sfruttato per progettare inibitori specifici, capaci di agire solo sulla chinasi di interesse, se si conoscono dettagliatamente le differenze strutturali che determinano le proprietà più peculiari di questa. A tutt'oggi nel Protein Data Bank sono presenti solamente una trentina di strutture di differenti proteine chinasi molte delle quali in complesso con piccole molecole di inibitori ATP-mimetici legati nella tasca catalitica del nucleotide. Il successo del Gleevec (un inibitore della chinasi Bcr/Abl) nel trattamento della leucemia mieloide cronica rappresenta un risultato esemplare a sostegno di questo tipo di approccio (3). Piccole molecole capaci di inibire in maniera potente e selettiva l'attività catalitica di questi enzimi sono necessarie per indagare le funzioni cellulari delle diverse protein chinasi e valutarne le potenzialità come target terapeutici; la caratterizzazione funzionale e strutturale dei complessi proteina/inibitore è infatti di grande importanza per identificare il ruolo esatto delle chinasi attivate od inibite in condizioni cellulari normali o patologiche, e per individuare caratteristiche strutturali che possano portare allo sviluppo di nuovi inibitori più potenti e selettivi. Dal punto di vista della struttura chimica, molti inibitori di proteinchinasi sono caratterizzati da uno scheletro centrale costituito da uno o più sistemi aromatici planari coniugati o fusi, con sostituenti alifatici che si estendono fuori dal piano e presentano a volte una stereochimica e una configurazione assoluta predefinite. Queste molecole rappresentano quindi obiettivi sintetici non banali, che richiedono sia l'adozione di efficienti procedure di accoppiamento per generare lo scheletro centrale, che tecniche avanzate di sintesi diastereoselettiva e/o asimmetrica, al fine di produrre le funzionalità alifatiche con la corretta configurazione assoluta.
Sulla base di tutte queste considerazioni, la protein chinasi CK2 (un acronimo che deriva dal vecchio termine fuorviante "casein kinase 2") rappresenta un modello interessante e stimolante al tempo stesso, per svariati motivi. i) Si tratta della più pleiotropa tra le protein chinasi note (>300 substrati) responsabile della fosforilazione di molte proteine che partecipano alla trasduzione del segnale ed all'espressione genica. (4); ii) in tutti i tipi di cancro dell'uomo la sua attività è significativamente aumentata (5), ed è stato confermato sia il suo potere trasformante se le sue subunità catalitiche vengono sovraespresse in topi transgenici (6) ed in linee cellulari (7,8) che la sua attività antiapoptotica in cellule tumorali (9,10). Non sono d'altra parte conosciuti tumori dovuti a mutazioni di CK2 o a riarrangiamenti genici che la riguardino. L'idea corrente è che sia l'elevata attività costitutiva di CK2, per altro essenziale nelle cellule normali (11), che, in particolari condizioni, soprattutto in cooperazione con certi oncogeni, provoca un drammatico aumento del fenotipo tumorale (12,13). Interventi di tipo molecolare mirati a interferire con l'attività di CK2 potrebbero di conseguenza avere un valore terapeutico nel trattamento dei tumori. iii) le basi strutturali della sua singolare specificità di sito sono già state delucidate mediante analisi mutazionale (14,15) e la struttura del cristallo della sua subunità catalitica con legati l'ATP ed il GTP (eccezionalmente altrettanto buon donatore di fosfato dell'ATP in questo caso) e dell'oloemzima composto da sue subunità catalitiche e da due regolatorie, è stata risolta (16,17). iv) sono già noti alcuni inibitori di CK2 competitivi nei confronti dell'ATP/GTP e di alcuni di essi, l'emodina (18), il TBB (19), l'IQA (20) e tre composti di natura antrachinonica (21), si è anche risolta la struttura in complesso con la subunità catalitica di CK2 di mais (>70% identica all'umana). La specificità del TBB e, ancora di più, dell'IQA per CK2 è particolarmente notevole (20,22) e sembra dipendere dalle dimensioni e dalla forma di una tasca idrofobica che nella CK2 accoglie quasi perfettamente la molecola di TBB mentre nelle altre chinasi è più ampia e non trattiene l'inibitore. In effetti l'ampliamento di questa cavità di CK2 mutando in alanina due residui voluminosi di Val e Ile, produce dei mutanti meno suscettibili all'inibizione (20,22). Sia il TBB che l'IQA sono già stati usati con successo per inibire la CK2 endogena in cellule intatte (20,22) e si sono rivelati utili per dimostrare l'attività antiapoptotica di CK2 in cellule Jurkat (10,20).
Ubiquità, pleiotropia ed elevata attività basale sono anche tra le caratteristiche dell'altra "casein chinasi" multifunzionale, la CK1 (anch'essa nota all'inizio come "casein chinasi-1"), una famiglia di enzimi monomerici che nei mammiferi annovera 7 distinte isoforme (23). Tra le molteplici implicazioni fisiologiche della CK1 vi è l'organizzazione dei microtubuli, l'adesione e la motilità cellulare dal momento che essa è stata riscontrata in associazione con i centrosomi, con i microtubuli e con il fuso mitotico. Recentemente è stato provato il coinvolgimento della CK1 nella trasduzione del segnale Wnt (24) in quanto si è visto che la CK1, con una modalità inconsueta di riconoscimento del substrato (25), "sostiene" la fosforilazione da parte della GSK-3 della beta-catenina (26). Questa porta alla sua degradazione, APC-mediata, attraverso la via di ubiquitinazione. Inoltre, la CK1 è una delle chinasi implicate nella fosforilazione di NF-AT4 (27) che controlla, insieme con la fosfatasi calcio-dipendente calcineurina, la localizzazione cellulare di questo fattore di trascrizione e, di conseguenza, l'attivazione o la quiescenza delle cellule T e la relativa risposta immunitaria della cellula. Tuttavia, i determinanti strutturali della specificità di sito di CK1 non sono ancora del tutto chiariti e, in particolare, non è noto se i residui implicati nella fosforilazione fosfato-diretta siano gli stessi che controllano il legame del substrato non pre-fosforilato. Le strutture tridimensionali di forme troncate della CK1 da Schizosaccharomyces pombe e da Rattus norvegicus in forme attive non fosforilate sono già state determinate (28,29). Non sono invece note strutture di complessi con eventuali inibitori.
Un altro importante potenziale bersaglio terapeutico è rappresentato dalle proteine oncogeniche di fusione (OFP) cioè la controparte molecolare delle traslocazioni cromosomiche riscontrate in svariati tumori dell'uomo. La generazione delle Proteine di Fusione Oncogeniche (OFP) rappresenta un chiaro esempio di proteine strutturalmente anormali che sono espresse in modo specifico nelle cellule neoplastiche e che sono legate causalmente ai processi di trasformazione maligna (30). A causa della loro relazione causale con i processi di trasformazione maligna, le OFP rappresentano un bersaglio importante per strategie terapeutiche specifiche (31). Sfortunatamente, ad eccezione della LMC (32-34) , questa non è la situazione attuale. La comprensione del ruolo che le OFP svolgono nella patofisiologia di diversi tipi di tumore ha fornito strumenti diagnostici e prognostici migliori, ma, ad oggi, non ha fornito modalità di trattamento sostanzialmente innovative. La mancanza di nuove terapie che abbiano come bersaglio le alterazioni molecolari, in grado di trasformare le cellule normali, rappresenta, al momento, un problema comune nel campo dell‚oncologia molecolare. Tali risultati negativi possono, in parte, essere spiegati con la mancanza, in diversi progetti "translazionali", di focalizzazione su bersagli espressi in modo specifico dai tumori e collegati causalmente al fenotipo maligno. Un'altra spiegazione risiede nella conoscenza incompleta sulla funzione e struttura di svariate OFP (e delle loro controparti normali). Infatti, mentre per alcune OFP (come Bcr/Abl) sono disponibili approfondite conoscenze strutturali e funzionali, per altre OFP questo livello di conoscenza non è oggi disponibile. Questo è il caso di NPM/Alk, RET e FLT3, le tre tirosine chinasi oggetto del presente studio. Invece, molto poco si conosce dei substrati di Alk e delle sue proprietà biochimiche. Di conseguenza non è ancora disponibile un saggio di attività da impiegarsi routinalmente per dosare Alk, una circostanza che rende ancora impossibili esperimenti cinetici per valutare l'efficacia di eventuali inibitori e per definirne il modo di azione. L'unione del gene della chinasi Alk con quello della proteina nucleolare NPM origina una proteina di fusione NPM/Alk permanentemente attiva, responsabile di un linfoma anaplastico non-Hodgkin (35). La struttura tridimensionale di questa proteina non è stata ancora determinata e veramente poche sono le informazioni a livello molecolare oggi disponibili su Alk. Nel caso di Alk quindi un primo passo importante è la messa a punto di un metodo di dosaggio pratico e sensibile basato sull'impiego di un substrato peptidico specifico. Questo consentirà di identificare inibitori il cui interesse pratico come base di partenza per lo sviluppo di farmaci in grado di curare i linfomi anaplastici è evidente. Ancora meno conosciuta è la tirosina chinasi RET sia sotto l'aspetto biochimico che strutturale. Nel sistema nervoso la tirosin chinasi recettoriale RET si autofosforila a seguito di un processo di dimerizzazione indotto da fattori neurotrofici come i GLF (36,37). Mutazioni nella proteina RET sono causa di gravi patologie come il carcinoma papillare della tiroide, neoplasie endocrine multiple di tipo 2A e 2B e la sindrome di Hirschsprung. (38). Nessuna informazione è disponibile riguardo alla struttura tridimensionale di questa proteina chinasi. Qualcosa di più è noto, invece, riguardo FLT3 (Fms-like tyrosine kinase III) viene prodotta principalmente da cellule ematopoietiche immature e costituisce un fattore chiave nel normale sviluppo di cellule staminali e del sistema immunitario. Mutazioni di FLT3 che la rendono costitutivamente attiva sono state associate con alcune forme di leucemie acute come la leucemia mielogena acuta (AML), la leucemia linfocitica acuta (ALL) o la sindrome mielodisplastica (39). Le basi strutturali del meccanismo di autoinibizione sono state svelate dalla determinazione della struttura tridimensionale della forma non-fosforilata autoinibita (40). In tale struttura il dominio chinasico è privo dell'inserto KID ed è stabilizzato nella forma non attiva dall'interazione col dominio JM. <<<