RICERCA ITALIANA     

Meccanismi di regolazione della proliferazione delle cellule germinali maschili

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

Il presente progetto di ricerca ha lo scopo di investigare nei vertebrati, a livello comparativo, i meccanismi neuroendocrini e molecolari della proliferazione e del differenziamento cellulare durante la spermatogenesi.
- Si studierà l'espressione e la regolazione di alcuni geni coinvolti nell'attività testicolare, sia nell'adulto nelle diverse fasi del ciclo riproduttivo annuale sia durante l'embriogenesi (fRLX, Protimosina-alfa, Aurora A e B)allo scopo di chiarire il loro ruolo.
- Si verificherà l'azione locale della melatonina isolando e caratterizzandone i recettori testicolari.
- si cercherà di indagare sui meccanismi molecolari che sono coinvolti nella proliferazione e nella dinamica delle cellule spermatogoniali staminali e degli spermatociti.
- si chiarirà il coinvolgimento diretto e/o indiretto delle cellule di Leydig e di Sertoli nella regolazione della rimozione apoptotica delle cellule germinali.
Si utilizzeranno tecniche di Northern blot, RT-PCR, ibridazione in situ, innunoistochimica, TUNEL, microscopia ottica ed elettronica. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Michela D'ISTRIA Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo del programma di ricerca è quello di investigare nei vertebrati, a livello comparativo, i meccanismi neuroendocrini e molecolari della proliferazione e del differenziamento cellulare durante la spermatogenesi. In particolare:
- di ottenere maggiori informazioni riguardo la proliferazione e la dinamica delle cellule spermatogoniali staminali e degli spermatociti;
- studiare l'espressione di alcuni geni (Relaxina, Protimosina alpha, Aurora A e B) coinvolti nella spermatogenesi per chiarire il loro ruolo specifico;
- studiare il coinvolgimento diretto e/o indiretto delle cellule di Leydig e di Sertoli nella regolazione della rimozione apoptotica delle cellule germinali.

Tutte e tre le Unità di ricerca utilizzeranno per il raggiungimento degli obiettivi proposti modelli sperimentali comuni (lucertola, Podarcis sicula; rana, Rana esculenta; zebrafish, Danio rerio; torpedine, Torpedo marmorata) che presentano una particolare organizzazione strutturale del testicolo che facilita la comprensione di processi anche più complessi. In particolare, lo zebrafish Danio rerio è facilmente allevabile e si presta a studi di embriogenesi potendo ottenere popolazioni di embrioni sincrone. Inoltre il genoma di Danio rerio, completamente sequenziato permette l'isolamento di sequenze genomiche di cDNA di interesse.

Infine, viene sottolineato che le Unità di ricerca di questo programma hanno già collaborato ottenendo buoni risultati scientifici, pubblicati su qualificate riviste internazionali. Questa peculiarità potrebbe favorire ed accelerare il raggiungimento degli obiettivi preposti. <<<

Risultati parziali attesi

Dopo il primo anno di attività dovranno essere raggiunti i seguenti obiettivi:
1. Definizioni delle condizioni di crescita degli embrioni di zebrafish Danio rerio.
2. Definizione di un protocollo di RT-PCR per la determinazione dell'andamento temporale dell'espressione dei diversi tipi di relaxine, del recettore LGR7 e delle due prothymosine α.
3. Definizione di un protocollo di RT-PCR per la determinazione dell'andamento temporale dell'espressione dell'fRLX e della Protimosina alfa in Rana durante il ciclo riproduttivo.
4. Clonaggio dell'intera sequenza codificante dei vari mRNA e relativa produzione di proteine in batteri.
5. Produzione di anticorpi contro le proteine espresse in vitro per zebrafish.
6. Definizione di un protocollo di ibridazione in situ per la determinazione dell'andamento spaziale dell'espressione dei diversi tipi di relaxine, del recettore LGR7 e delle due prothymosine α durante lo sviluppo embrionale di zebrafish ed in animali adulti.
7. Verificare l'azione della melatonina sull'attività testicolare in Rana.
8. stabilire l'influenza degli ormoni steroidei (androgeni, estrogeni e melatonina) sull'espressione di fRLX in Rana.
9. verificare l'espressione e localizzazione del gene Bak in torpedo e Podarcis.
10 valutare il pattern di espressione delle caderine tra le cellule di Sertoli e cellule germinali.
11. identificare i tipi cellulari che esprimono le chinasi Aurora nell'epitelio germinativo di Rana e Podarcis.
12. identificare le cellule mitoticamente labili nei diversi compartimenti delle cellule germinali e tra le cellule di Leydig e Sertoli.
13. identificare l'apoptosi di cellule nei compartimnti germinali e nongerminali del testicolo di lucertola, rana e torpedo.
14. identificare alcuni markers chimici per la divisione ed il differenziamento delle cellule germinali, e nelle cellule di Sertoli e Leydig.I risultati attesi nella seconda fase del progetto sono riassunti nei seguenti punti:
1. Definizione di un protocollo per la localizzazione dei diversi tipi di proteine nei vari tipi cellulari con l'uso degli anticorpi prodotti nella precedente fase sperimentale.
2. Definizione di un protocollo per interferenza con la funzione dei geni di interesse mediante l'introduzione in uova fecondate di zebrafish di anticorpi policlonali o mediante oligonucleotidi antisenso (morpholino).
3. Definizione di un protocollo per l'overespressione generale o tessuto-specifica dei diversi geni in esame mediante la microiniezione di costrutti plasmidici.
4. identificazione degli eventuali segnali chimici che regolano l'attività chinasica di Aurora A e B.
5. identificare i tipi cellulari testicolari target della melatonina.
6. chiarire quali fattori esogeni e/o endogeni regolano l'espressione dell'fRLX e della protimosina alfa in Rana.
7. identificare i tipi cellulari che esprimono gli eventuali nuovi geni clonati nella prima fase.
8. Identificazione delle molecole segnale che caratterizzano la divisione, il differenziamento e l'apoptosi degli spermatogoni staminali. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La spermatogenesi è un processo differenziativo complesso che richiede la sintesi coordinata di diverse proteine stadio specifiche ed interazioni funzionali tra cellule germinali e una o più tipi di cellule somatiche (Setchell, 1978; Skinner, 1991). Tale differenziamento dipende dall'espressione successiva ed ordinata di molti geni specifici che promuovono la proliferazione degli spermatogoni, la meiosi degli spermatociti e la spermioistiogenesi. Queste tappe rappresentano processi altamente conservati nei vertebrati (Roosen-Ringe, 1977) con alcune differenze specie-specifiche (eg. il numero degli spermatogoni, il numero delle generazioni spermatogoniali che si differenzieranno in spermatozoi). Dal punto di vista morfologico tali tappe sono ben caratterizzate in quasi tutti i gruppi dei vfertebrati, ma molti interrogativi restano sui meccanismi che regolano l'intero processo. Sono, infatti, in gran parte sconosciuti i meccanismi di innesco, i geni coinvolti ed i fattori molecolari che consentono la progressione delle cellule germinali da una stadio all'altro. Poiché nel testicolo dei vertebrati non mammiferi, l'organizzazione degli stadi maturativi delle cellule germinali e degli elementi somatici è molto meno complessa di quella dei mammiferi (Roosen-Ringe, 1977) uno studio comparativo, che si avvale di modelli sperimentali più facilmente manipolabili, permette la comprensione di processi anche più complessi.
L'utilizzo di animali a riproduzione stagionale costituisce una particolare strategia di indagine sui mutamenti fisiologici della gonade ed il monitoraggio di possibili "pathways" molecolari che regolano la progressione di eventi che coinvolgono fasi mitotiche (moltiplicazione degli spermatogoni), meiotiche (formazione degli spermatici) e morfogenesi (formazione degli spermatozoi).
La relaxina e il relaxin-like factor (RLF) sono ormoni proteici appartenenti alla famiglia delle relaxine/insuline. Tutti gli ormoni appartenenti a questa famiglia presentano un'organizzazione molto simile: sono tradotti come pre-proormoni formati da un peptide segnale seguito da una catena B, un peptide di congiunzione C e una catena A. Nei mammiferi la relaxina è un ormone di 6 kDa che è secreto prevalentemente dall'ovario che ed ha molte funzioni associate con la fisiologia della riproduzione (Sherwood, 1994). Normalmente nei mammiferi sono presenti soltanto due geni per la relaxina con eccezione per l'uomo dove ne sono presenti tre, H1 (Hudson et al. 1983), H2 (Hudson et al. 1984) e H3 che corrisponde a M2 per nel topo, è espressa in molti tessuti quali timo, milza, polmone e testicolo e nel talamo (Bathgate, et al. 2002). Nei mammiferi è presente anche il Relaxin-like factor (RLF) conosciuto come Leydig insulin-like peptide (Ley-I-L) o INSL-3. Il cDNA codificante RLF è stato clonato dal testicolo di cinghiale e il cDNA e la corrispondente proteina sono ora conosciuti per molte specie come uomo (Ivell et al. b1997), topo (Zimmerman S. et al. 1997), scimmia (Zarreh-Hoshyari-Khah et al. 1999) e bovino (Bathgate et al. 1999). Il cDNA per RLF di topo codifica per una proteina di 122 amminoacidi. In tutte le specie studiate RLF è altamente espresso nelle cellule di Leydig pre- e postnatali, ma anche a livelli inferiori nelle cellule della teca luteali e postnatali dell'ovario (Balvers et al. 1998; Zarreh-Hoshyari-Khah et al. 1999). La funzione di RLF non è ancora nota. Dati recenti ottenuti dal knock-out in topo per il gene di RLF indicano che la proteina ha un ruolo centrale nella discesa dei testicoli nello scroto durante l'embriogenesi (Zimmermann et al. 1999; Nef and Parada 1999). La relaxina di rana (fRLX) è la prima forma di relaxina isolata e caratterizzata a livello molecolare da vertebrati non mammifero. fRLX è prodotta ad alti livelli dalle cellule di Leydig ed a bassi livelli nell'ovario, inoltre la sua espressione è variabile durante il ciclo riproduttivo annuale ben correlandosi con l'attività testicolare dell'anfibio. Sulla base della sua localizzazione cellulare si potrebbe considerare fRLX omologo del relaxin-like factor (RLF) di mammifero. Tuttavia analisi filogenetiche indicano che fRLX si raggruppa meglio con la relaxina dei marsupiali e di squalo suggerendo che essa possa essere considerata una forma di relaxina ancestrale (De Rienzo et al. 2001). L'espressione di fRLX sembra essere sotto il controllo degli ormoni ipofisari poiché esperimenti di ibridazione in situ eseguiti su sezioni di testicolo di animali ipofisectomizzati hanno evidenziato una sensibile diminuzione del livello del segnale di ibridazione. Recentemente, sia mediante analisi di RT-PCR sia mediante ibridazioni in situ, è stato osservato che fRLX è espresso precocemente durante lo sviluppo di Rana, infatti la sua espressione si evidenzia già nelle gonadi dei girini allo stadio 28-30.
Negli ultimi anni utilizzando le nuove tecniche di ricerca nel campo della biologia molecolare si è cercato di individuare geni specificamente o altamente espressi nelle gonadi che potessero avere un ruolo critico nella spermatogenesi ed essere utilizzati come markers dell'attività testicolare (Srinivasan et al., 1998; Kobayashi et al., 1998; Poorafshar and Hellman, 1999; Miura et al., 1999). Da una cDNA-teca di testicolo di Rana è stato isolato un cDNA clone con una regione codificante di 155 aa. La proteina putativa, chiamata "frog relaxin, fRLX", ha una bassa omologia di sequenza amminoacidica con le proteine della famiglia delle relassine (De Rienzo et al., 2001). L'analisi morfologica ha evidenziato che il fRLX mRNA è espresso solo nel tessuto interstiziale e specificamente nelle cellule di Leydig (De Rienzo et al., 2001). Inoltre, per la prima volta in un vertebrato nonmammifero, è stato isolato un cDNA codificante per la protimosina alfa (PT-alfa) nel testicolo di rana. Tale proteina è considerata la più acida proteina trovata nelle cellule di mammifero, su un totale di 110 amminoacidi più del 50% sono acido aspartico e/o acido glutammico (Pineiro et al., 2000). Esperimenti di RT-PCR e Northern blot hanno dimostrato che la PT-alfa è espressa ad alto livello nel testicolo di Rana nel periodo di attiva spermatogenesi (bassa moltiplicazione spermatogoniale) e a basso livello nei periodi di scarsa attività spermatogenica (attiva proliferazione spermatogoniale) esperimenti di ibridazione in situ confermano tali risultati e evidenziano la presenza del trascritto specificamente negli spermatociti di primo e secondo ordine (Aniello et al., 2002)
E' noto che la fosforilazione di diverse proteine riveste un evento importante nei meccanismi di regolazione della citochinesi (Adams et al., 2001; Chieffi et al., 2002; Chieffi, 2003). A tale proposito la famiglia Aurora (Aurora A/STK-15, Aurora B/Aim-1 ed Aurora C/AIK-3) costituisce un gruppo di proteine (protein-chinasi dei residui di treonina e serina) importanti nel ciclo cellulare ed in particolare nella progressione della fase G2/M. Le isoforme della famiglia Aurora sono ben conservate in tutte le cellule eucariotiche. Potrebbe essere interessante ampliare le conoscenze sul ruolo di questa famiglia di chinasi implicata nella divisione cellulare durante i processi di divisione mitotica e meiotica che si realizzano durante la spermatogenesi.
Nei bassi vertebrati pesci, anfibi e rettili diversi fattori esogeni quali fotoperiodo, temperatura ambientale ed una gran varietà di ormoni (GnRH, FSH/LH, ormoni steroidei, melatonina, prolattina, ormoni tiroidei) sono coinvolti nel controllo dell'attività testicolare. L'inizio dell'ondata spermatogenetica in alcuni gruppi di bassi vertebrati è solitamente basata su stimoli ambientali che vengono trasdotti in segnali ormonali. L'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) ha un ruolo primario nel funzionamento dell'asse ipotalamo-ipofis-gonade. Esiste una chiara evidenza della presenza di GnRH e/o dei suoi recettori nelle gonadi di alcuni vertebrati e protocordati. L'evidenza indiretta indica un effetto diretto delle sostanze GnRH-simili sull'attività della gonade, le variazioni di sviluppo e stagionali nel contenuto di GnRH del cervello, sono correlate all'attività gonadica. Gli analoghi del GnRH potrettebo aumentare l'attività mitotica spermatogoniale nella rana (Minucci et al., 1986; Rastogi e Iela, 1994; Stojikovich et al., 1994; Di Fiore et al., 2000; Rastogi et al., 1997; Schoenfeld et al., 2001). Le gonadotropine ipofisarie e gli steroidi sessuali sono fattori ormonali importanti coinvolti nella regolazione della spermatogenesi in molti vertebrati. Ci sono prove evidenti del sinergismo degli androgeni (e degli estrogeni) con le gonadotropine ipofisarie nel controllo della proliferazione degli SPG staminali. Infatti, in alcune specie, il picco stagionale di androgeni circolanti spesso coincide con l'attività proliferativa spermatogoniale la meiosi e/o la spermioistogenesi, mentre in altre specie, sono gli estrogeni ad influenzare tale attività. L'estradiolo stimola la proliferazione spermatogoniale e questo effetto può essere efficacemente contrastato da un altro ormone, la melatonina. Nella rana, inoltre, è stata studiata di recente, la presenza di alcune molecole in stadi spermatogenetici, compresi gli spermatogoni, di molecole tipo la protimosina alpha, activita/relaxina, MAPK ERK1 o 2, che possono rappresentare il marker di stadi specifici di spermatogenesi. L'FSH può aumentare la sintesi di DNA nelle cellule del Sertoli e l'innalzamento dei livelli di cAMP in tali cellule è probabilmente seguito dall'attivazione di una cascata di segnali di trasduzione che stimolano le cellule staminali spermatogoniali a proliferare e a differenziarsi. Inoltre, il ruolo delle cellule del Sertoli, rispetto alla loro capacità di stimolare la proliferazione degli spermatogoni, potrebbe essere stadio-specifico. Le cellule del Sertoli sono intimamente legate alle cellule spermatogenetiche e mostrano trasformazioni strutturali associate allo stadio delle cellule spermatogenetiche con le quali si trovano a contatto (Rastogi et al., 1988; Angelini and Botte, 1992; Bagnara e Rastogi, 1992; Rastogi e Iela, 1992; Abe e Ji, 1994; Maekawa et al., 1995; Minucci et al., 1997; Meehan et al., 2000; Chieffi et al., 2000; Prisco et al., 2002;d'Istria et al., 2003; Ferrara et al., 2004).
Le cellule di Leydig e le cellule di Sertoli sembrerebbero svolgere un importante ruolo nel controllo nel processo apoptotico che assume un ruolo importante nella omeostasi spermatogenetica in definite condizioni ormonali e ambientali. Il monitoraggio dei processi apoptotici delle cellule spermatogenetiche nelle diverse specie dei bassi vertebrati potrebbe fornire importanti informazioni sui meccanismi di regolazione.
Riassumendo, questo progetto di ricerca vede coinvolte tre unità che sono complementari tra di loro per lo svolgimento della ricerca proposta. L'utilizzo di modelli sperimentali quali lucertola, rana, zebrafish e torpedo non è una semplice casualità bensì è correlata con le linee di ricerca e le esperienze della maggior parte dei componenti delle unità di ricerca coinvolte in questo programma. <<<