RICERCA ITALIANA     

Tossine algali contaminanti i molluschi bivalvi nelle acque costiere italiane: caratteristiche, produzione, azioni e rischio per la salute umana

Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

Abstract

La contaminazione di molluschi bivalvi da parte di tossine d'origine algale (ficotossine) si manifesta con preoccupante regolarità nelle acque costiere di diversi Paesi europei. In Italia il fenomeno interessa il Mare Adriatico Settentrionale, dove negli ultimi dieci anni la contaminazione ha colpito i mitili. Le sostanze tossiche responsabili di tali contaminazioni sono primariamente le yessotossine (YTX), ma nuove tossine e alghe tossiche sono state individuate in materiale prelevato dal Mare Adriatico negli ultimi anni. Il progressivo ampliamento del numero e tipo di ficotossine identificate e caratterizzate in questi ultimi anni non è stato accompagnato da un'analoga espansione delle conoscenze su importanti aspetti del fenomeno, quali la produzione, il meccanismo d'azione e la tossicità dei diversi composti.
L'obiettivo generale di questo programma di ricerca è l'ottenimento di informazioni su caratteristiche, produzione, azioni e tossicità delle ficotossine lipofile a maggiore impatto sulla salute umana e la molluschicoltura in Italia. Tale obiettivo generale sarà articolato in diversi temi complementari, i cui elementi principali sono: l'isolamento in mare, la messa in coltura e la espansione di colture di alghe tossiche; la definizione del quadro sistematico delle alghe produttrici di YTX su base molecolare; la valutazione dei fattori che controllano la tossicità delle alghe e la produzione di tossine, incluso il ruolo dei batteri associati alle colture algali nella produzione di YTX; la individuazione del profilo trascrizionale dei geni la cui espressione è correlata alla produzione di YTX in Protoceratium reticulatum; la caratterizzazione dell'interazione fra YTX e il mollusco Mytilus galloprovincialis; la continua caratterizzazione delle ficotossine lipofile contaminanti i mitili nell'Adriatico Settentrionale e la preparazione di YTX; la caratterizzazione del meccanismo molecolare mediante il quale la YTX distrugge il sistema E-caderina-catenine e delle conseguenze di tale alterazione; la valutazione della tossicità delle YTX, con particolare riferimento all'evoluzione temporale delle alterazioni indotte nel topo dalla YTX assunta con gli alimenti, la capacità della YTX di indurre mutazioni, trasformazione neoplastica e promozione neoplastica in sistemi in vitro, l'attività pro-infiammatoria della YTX.
Le informazioni così ottenute contribuiranno alla migliore comprensione generale del fenomeno di contaminazione dei molluschi bivalvi da parte di ficotossine lipofile e saranno la base razionale di una più efficace analisi e gestione del rischio, nonché la elaborazione di decisioni rilevanti per la tutela della salute pubblica. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gian Paolo ROSSINI Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo generale di questo programma di ricerca è l'ottenimento di informazioni su caratteristiche, produzione e azioni delle ficotossine lipofile contaminanti i molluschi bivalvi nelle acque costiere del Mare Adriatico, con particolare riferimento alle YTX, che costituiscono i componenti a maggiore impatto sui molluschi destinati al consumo umano in Italia. Tale obiettivo generale sarà articolato in diversi temi complementari:
• Isolamento in mare, messa in coltura ed espansione di colture di alghe tossiche;
• Definizione del quadro sistematico delle alghe produttrici di YTX su base molecolare;
• Valutazione dei fattori che controllano la tossicità delle alghe e la produzione di tossine;
• Valutazione del ruolo dei batteri associati alle colture algali nella produzione di YTX;
• Individuazione del profilo trascrizionale dei geni la cui espressione è correlata alla produzione di YTX in Protoceratium reticulatum;
• Caratterizzazione dell'interazione fra YTX e il mollusco Mytilus galloprovincialis;
• Caratteristiche chimiche delle tossine lipofile contaminanti i mitili nell'Adriatico Settentrionale;
• Preparazione di tossine pure;
• Caratterizzazione del meccanismo molecolare mediante il quale la YTX distrugge il sistema E-caderina-catenine e delle conseguenze di tale alterazione;
• Caratterizzazione della evoluzione temporale delle alterazioni indotte nel topo dalla YTX assunta con gli alimenti;
• Studio della capacità della YTX di indurre mutazioni, trasformazione neoplastica e promozione neoplastica in sistemi in vitro. <<<

Risultati parziali attesi

Nella prima fase di questo progetto di ricerca ci attendiamo di ottenere prodotti e informazioni. In termini di prodotti, le attività previste consentiranno l'ottenimento di:
• Ceppi di alghe planctoniche e microbentoniche, comprendenti specie produttrici di YTX;
• Sostanze naturali purificate da alghe e mitili, fra le quali composti della classe delle YTX;
• Test genetici identificativi delle specie responsabili della produzione di YTX.
Le maggiori conoscenze che si prevede vengano ottenute in questa fase del progetto toccheranno parecchi aspetti della biologia, chimica e tossicologia della YTX. In primo luogo, si otterranno informazioni sulle alghe produttrici della YTX. Inoltre, si individuerà come venga influenzata la produzione di YTX nelle alghe da parte di rilevanti fattori ambientali. In questo contesto è opportuno sottolineare che nuove specie di alghe produttrici di YTX potrebbero essere identificate nel corso delle attività di monitoraggio.
Lo studio degli effetti della YTX su canali ionici nel mitilo fornirà informazioni più precise sui meccanismi d'interazione tossina-ospite. L'analisi del meccanismo molecolare mediante il quale la YTX distrugge il sistema E-caderina-catenine consentirà di meglio caratterizzare il meccanismo d'azione della YTX e, su un piano più vasto, di approfondire la conoscenza sulla biogenesi e turnover della E-caderina.
Informazioni rilevanti saranno ottenute anche sui potenziali rischi posti dalla YTX alla salute umana. In primo luogo, verrà caratterizzato lo sviluppo temporale delle alterazioni ultrastrutturali indotte dalla tossina, verificandone la loro permanenza, il loro aggravarsi o la loro regressione, in seguito alla sospensione del trattamento degli animali con la tossina. Inoltre, sarà possibile stabilire se la YTX possa essere un agente trasformante.Nella seconda fase del progetto si otterranno prodotti e informazioni in merito ai principali gruppi di ficotossine lipofile contaminanti i mitili nel Mare Adriatico Settentrionale.
Per quanto riguarda i prodotti, si otterranno altri ceppi e specie di alghe planctoniche e microbentoniche, e standard di YTX. Inoltre, l'inserimento dei mitili fra le fonti delle tossine lipofile rende altamente probabile che, sulla base del dato storico recente, vengano isolate nuove sostanze naturali dotate di attività biologica.
Le maggiori conoscenze che si prevede vengano ottenute in questa fase del progetto toccheranno diversi aspetti della biologia e chimica della YTX e altre tossine. In primo luogo, potrebbero essere individuate specie di Protoperidinium in grado di produrre azaspiracidi nelle acque costiere italiane. In questo caso, si otterrebbe una rilevante indicazione di una nuova fonte di rischio legata al consumo di molluschi eduli filtratori coltivati nel Mare Adriatico. Sarà anche chiarito se batteri associati alle popolazioni algali abbiano un ruolo nella produzione di YTX. L'analisi del profilo trascrizionale di ceppi di P. reticulatum, inoltre, consentirà di identificare geni codificanti enzimi della via metabolica di sintesi della YTX e fornirà indicazioni preliminari sui meccanismi genetici alla base della regolazione della produzione delle YTX.
La interazione fra YTX e mitilo verrà ulteriormente caratterizzata, ottenendo indicazioni sul potenziale ruolo stressogeno della tossina nel mollusco accumulatore.
Gli studi sul meccanismo d'azione e la tossicità delle YTX consentiranno, infine, di ottenere una notevole mole di informazioni sui rischi posti da queste tossine a consumatori e molluschicultori. I risultati ottenuti in merito alle conseguenze della distruzione del sistema E-caderina-catenine causata da YTX, infatti, forniranno informazioni su eventi molecolari riconducibili al fenomeno di progressione neoplastica e alla formazione di metastasi, che saranno complementati dalle informazioni dirette sull'attività mutagena e sulla sua capacità di promotore tumorale delle YTX. Conseguentemente, il complesso di queste informazioni consentirà di definire se le YTX possano rappresentare un nuovo gruppo di induttori e/o promotori di tumori, e costituire quindi un elevato rischio per la salute dei consumatori.
I risultati dello studio sugli effetti topici della YTX, per converso, fornirà indicazioni sul rischio di risposte dermotossiche in coloro che vengono a contatto con acqua di mare contenente YTX. Due categorie sarebbero primariamente interessate: i molluschicultori e i turisti della costa Adriatica, che, nell'insieme, costituiscono componenti di rilievo assoluto nell'economia delle regioni che si affacciano su questo mare.
I risultati di questo studio, quindi, fornirebbero informazioni rilevanti per la gestione del rischio biotossine e la elaborazione di decisioni rilevanti per la tutela della salute pubblica e la produttività della molluschicoltura in Italia. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La comparsa di episodi di intossicazione umana dovuti all'ingestione di molluschi lamellibranchi o pesci contaminati da alghe produttrici di biotossine è un fenomeno ripetutamente documentato nel passato (1), che negli ultimi trent'anni ha mostrato una preoccupante evoluzione a livello mondiale. Difatti, si è assistito all'aumento nella frequenza di tali episodi e alla loro espansione geografica in aree del pianeta in cui precedentemente non si ha traccia della loro manifestazione (1).
I primi casi documentati di intossicazione umana attribuibili a molluschi contaminati da tossine di origine algale in Italia risalgono al 1989, quando furono riportati episodi classificabili fra le intossicazioni di tipo diarroico da ingestione di molluschi (Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP) (2). La sintomatologia diarroica è sicuramente causata dall'acido okadaico (3), che agisce come inibitore delle fosfoproteine fosfatasi ser/thr 1 e 2A (4), alterando i meccanismi di regolazione dello stato di fosforilazione di un gran numero di proteine in vivo (5) e, conseguentemente, il normale funzionamento di molteplici popolazioni cellulari (6).
Sebbene non siano noti casi di morte conseguenti a DSP, tale intossicazione è rilevante per la salute pubblica ed è quindi l'oggetto di normative comunitarie (7,8) e nazionali (9) mirate alla sua prevenzione, che si realizza primariamente con il monitoraggio periodico della tossicità dei molluschi provenienti dall'acquacoltura, impiegando un saggio biologico. Questo comprende l'estrazione di sostanze lipofile dai molluschi, e l'iniezione dell'estratto nel topo, di cui vengono misurati i tempi di morte dal momento della iniezione dell'estratto. Questa modalità di valutazione della tossicità dei molluschi è indubbiamente aspecifica, ma è anche estremamente efficace per individuare l'esistenza di sostanze tossiche nel materiale d'origine, indipendentemente dalle loro diversità in termini di caratteristiche chimiche (10). Il monitoraggio della tossicità dei molluschi basata sul saggio biologico con il topo ha recentemente consentito di individuare nuovi composti naturali ad attività tossica, come gli azaspiracidi (11), che si aggiungono ad altre ficotossine lipofile già note, quali le dinofisistossine (DTX), le yessotossine (YTX) e le pectenotossine (PTX) (10). Inoltre, la continua attività di individuazione e caratterizzazione delle biotossine rilevabili in molluschi bivalvi nelle acque del mare Adriatico, condotta dal gruppo di Ernesto Fattorusso negli ultimi 15 anni, tuttavia, ha mostrato che il profilo delle tossine contaminanti si modifica nel tempo. Nuove tossine, infatti, sono state caratterizzate, quali l'oxazinina-1 (12) e due nuovi clorosolfolipidi (13,14), che sono completamente differenti dal punto di vista strutturale dalle tossine polieteree del complesso DSP isolate finora, ma che rappresentano un ulteriore motivo di allarme per la salute pubblica a causa della loro attività citotossica.
La perdurante rilevazione di elevati livelli di biotossine nei molluschi non costituisce soltanto un serio problema di salute pubblica, ma rappresenta anche la causa di un danno economico estremamente rilevante. Nell'Adriatico Settentrionale negli ultimi dieci anni, infatti, la raccolta dei mitili è rimasta chiusa dai tre fino ai dieci mesi all'anno, con gravi ripercussioni sulla redditività della molluschicultura, in quanto la produzione ha subito riduzioni fino al 70% (15,16).
In base a tali premesse, il mantenimento di un elevato livello di attenzione sulle ficotossine contaminanti i molluschi nell'Adriatico Settentrionale è pienamente giustificato e si riflette sulla necessità di continuare ad acquisire informazioni sul fenomeno nel suo complesso. Il progressivo ampliamento del numero e tipo di ficotossine identificate e caratterizzate in questi ultimi anni, infatti, non è stato accompagnato da un'analoga espansione delle conoscenze su importanti aspetti del fenomeno, quali la produzione, l'accumulo e l'azione delle tossine. Inoltre, la continua evoluzione dei profili tossinologici indica l'elevato grado di probabilità che nuove tossine vengano individuate in un prossimo futuro.
Una disamina, anche sommaria, delle lacune esistenti nella descrizione e comprensione di svariati aspetti del fenomeno deve necessariamente aprirsi con la menzione del fatto che le alghe produttrici delle ficotossine rinvenute nell'Adriatico Settentrionale non sono ancora state compiutamente individuate. Le conoscenze attuali consentono di concludere che svariate specie del genere Dinophysis, nonchè Prorocentrum lima, sono produttori di acido okadaico e DTX (17-19), e che Protoceratium reticulatum è produttore di YTX (20), ma non sono note le specie produttrici dei clorosolfolipidi, mentre sono comparse fioriture algali che appaiono responsabili di tossicità differenti dalla DSP, quali le diatomee del genere Pseudo-nitzschia (21) e alcune dinoflagellate bentoniche potenzialmente tossiche (Coolia monotis e Ostreopsis sp.) (22).
I fattori che regolano la produzione di tossine nelle alghe sono poco conosciuti, e questa carenza di informazione è particolarmente rilevante, se si considera che la presenza di alghe produttrici di tossine in un'area costiera non implica automaticamente la contemporanea tossicità dei molluschi viventi in quell'area (23,24).
Un altro aspetto scarsamente caratterizzato del fenomeno è l'interazione fra tossine e molluschi accumulatori. In questo ambito le conoscenze maggiori sono il riconoscimento che l'accumulo di tossine non avviene in tutte le diverse specie di molluschi che vivono nell'area costiera interessata dalla contaminazione (16,24,25), e il riconoscimento che le tossine lipofile vengono accumulate soprattutto nella ghiandola digestiva dei molluschi (26). Studi recenti, peraltro, hanno mostrato che la YTX è localizzata anch negli immunociti di Mytilus galloprovincialis (27).
La conoscenza degli effetti negli organismi e del meccanismo d'azione delle biotossine isolate dai molluschi bivalvi delle acque costiere del Mare Adriatico è estremamente eterogenea. Per quanto riguarda i meccanismi d'azione, a fronte della notevole quantità di informazioni esistente sull'acido okadaico e i suoi bersagli molecolari prossimali e distali, meno chiaro è il quadro in merito al meccanismo d'azione della YTX, mentre rimangono completamente ignoti i meccanismi d'azione di altre tossine, quali i clorosolfolipidi.
Se si considera la YTX, che è attualmente la tossina a maggiore impatto sanitario ed economico in Italia, l'impegno di diversi gruppi di ricerca ha consentito di identificare effetti molteplici in diversi tipi cellulari, ma un modello unitario del meccanismo d'azione dalla YTX non è ancora disponibile. Un primo studio ha mostrato che concentrazioni micromolari di YTX sono in grado di alterare i movimenti del Ca2+ fra i comparti extracellulare e intracellulare in linfociti umani (28). In questo sistema sperimentale il gruppo di Luis Botana ha anche mostrato la capacità della YTX di attivare attività fosfodiesterasiche, con la conseguente alterazione dei livelli intracellulari di cAMP (29). La YTX, a concentrazioni microM, appare in grado di influenzare canali del Ca2+ anche in immunociti da Mytilus galloprovincialis (27). In altre popolazioni cellulari, per converso, la YTX è in grado di indurre risposte a concentrazioni sensibilmente inferiori (nanoM). In cellule HeLa la YTX causa attivazione di caspasi e morte cellulare (30). In cellule MCF-7, invece, la YTX induce una caratteristica frammentazione della molecola di E-caderina (31,32).
La incompleta caratterizzazione della tossicità delle YTX negli organismi è infine elemento di preoccupazione. Benchè sia riconosciuto che la YTX può avere esiti letali quando iniettata i.p. nel topo, la sua somministrazione per os appare legata a una bassa tossicità acuta (33). Studi recenti, tuttavia, indicano la necessità di un'accurata ed estesa valutazione dei pericoli che potrebbero essere posti dalla YTX alla salute umana. I dati più rilevanti che hanno stimolato un più elevato livello di attenzione sulla tossicità delle YTX sono molteplici:
1. concentrazioni molto basse di YTX sono in grado di indurre la distruzione del sistema E-caderina-catenine in colture cellulari (32), un effetto che potrebbe rendere la YTX una sostanza stimolante la diffusione di tumori e la formazione di metastasi (34);
2. la somministrazione orale di YTX nei topi causa una risposta acuta di modifica dei miocardiociti in prossimità dei capillari (35);
3. la YTX appare in grado di indurre l'attivazione delle fosfodiesterasi, con conseguente riduzione dei livelli intracellulari di cAMP, in linfociti umani (28). Poiché l'aumento di cAMP si ritiene associato ad una inibizione di eventi coinvolti nel processo flogistico (36), è ipotizzabile che la YTX possa avere un effetto pro-infiammatorio. La dimostrazione che significativi livelli di YTX sono rintracciabili sia nell'acqua di mare (37), sia nel mezzo di coltura di Protoceratium reticulatum (Boni e Ciminiello, comunicazione personale), rende così verosimile che, nei periodi di elevata concentrazione di alghe produttrici di YTX nel mare, la cute dei bagnanti e/o di pescatori, esposta alla tossina, possa sviluppare reazioni dermotossiche.
Queste osservazioni, nel loro complesso, hanno reso urgente un ampliamento degli studi sulla tossicità delle YTX, con specifico riferimento allo sviluppo temporale delle alterazioni indotte dalla YTX, la loro possibile azione pro-infiammatoria, nonchè l'azione mutagena delle YTX, e la loro capacità di indurre e/o promuovere la trasformazione neoplastica.
Le carenze delineate per il complesso delle conoscenze sulle YTX e altre ficotossine contaminanti i molluschi dell'Adriatico Settentrionale sono estese. Data l'importanza dei problemi posti dalle biotossine algali in Italia, sembra particolarmente urgente uno sforzo integrato, mirato all'ottenimento di informazioni sull'evoluzione del profilo delle biotossine contaminanti i molluschi nel Mare Adriatico Settentrionale, complementate da una migliore comprensione della produzione, del meccanismo d'azione e gli effetti nocivi indotti da YTX negli organismi, che forniscano la base razionale di una più efficace analisi e gestione del rischio. <<<