RICERCA ITALIANA     

MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI COINVOLTI NELL'OMEOSTASI METABOLICA: ASPETTI FISIO-PATOLOGICI

Università degli Studi del Sannio di Benevento

Abstract

L'omeostasi energetica, una componente dell'omeostasi metabolica, è determinata da tre distinti fattori integrati tra loro:l'introito energetico, la spesa energetica e le vie endocrine ad essi associate. Una dissociazione tra questi fattori comporta squilibri fisiologici che sfociano in patologie quali l'obesità ed il diabete. Infatti, l'obesità è una situazione di alterata omeostasi energetica con conseguente accumulo di grasso nel tessuto adiposo ed a lungo andare anche in sedi ectopiche quali il fegato ed il muscolo scheletrico. Recentemente, è stata rivolta grande attenzione all'eccessivo accumulo di trigliceridi nel fegato (fegato grasso o steatosi epatica), in quanto associato a fattori di rischio cardiovascolare quali dislipidemia, insulino-resistenza e diabete. Nonostante ciò, non sono attualmente noti i meccanismi cellulari (e la relativa tessuto-specificità)coinvolti nell' omeostasi metabolica sebbene la ricerca di trattamenti farmacologici capaci di incrementare la spesa energetica stia diventando una problematica di crescente interesse per gli scienziati.I processi metabolici sono regolati da numerosi ormoni tra cui particolare rilevanza assumono le iodotironine (T3 e T2). E' ormai una nozione storica che la T3 stimola la termogenesi e la spesa energetica regolando l'espressione genica. Di recente,però, è stato dimostrato che anche la T2 (fino a poco fa ritenuto un derivato inattivo della T3) stimola il metabolismo energetico agendo direttamente a livello mitocondriale. I mitocondri sono centrali nell'omeostasi metabolica in quanto sede della trasduzione energetica ed il loro volume è importante per lo svolgimento delle loro attività. La recente scoperta delle acquaporine (AQP) (Peter Agre, Premio Nobel per la Chimica, 2003) e l'osservazione della loro presenza nei mitocondri apre,quindi, nuove prospettive nel campo dell'omeostasi energetica cellulare. Le ricerche previste saranno condotte sia su animali che sull'uomo e tenteranno di fornire indicazioni su fattori e meccanismi cellulari-molecolari coinvolti nell'omeostasi metabolica. Si valuteranno gli effetti delle iodotironine sull'adiposità e sui meccanismi ossidativi di vari tessuti e dei mitocondri (incluso l'espressione e l'attività dell'AQP8). Sei gruppi di differenti Università (Bari, Benevento, Genova, Pisa, Napoli e Napoli 2) eseguiranno le ricerche. Essi hanno competenze e background scientifici che si integrano tra loro e che vanno dalla Fisiologia alla Biologia Molecolare, alla Bioenergetica ed alla Medicina. I vari gruppi studieranno in particolare:
BARI (Dr. G. Calamita): 1) la relazione tra il trasporto osmotico di acqua attraverso la membrana mitocondriale interna e l'espressione dell'AQP8 ; 2) la regolazione trascrizionale e/o post-traduzionale di AQP8, in varie situazioni metaboliche e di stress ossidativi; 3) la possibile interazione dell'AQP8 con i pori di transizione della permeabilità (PTP).
BENEVENTO (Dr. F. Goglia): 1)l' effetto della T2 sull'adiposità e sull'ossidazione dei grassi su ratti in sovrappeso; 2) gli effetti cellulari della T2 sull'ossidazione degli acidi grassi in fegato steatosico ed i meccanismi molecolari coinvolti.
NAPOLI 2 (Dr. A Lanni): 1) gli effetti della T2 su tessuto adiposo bianco e bruno; 2) il meccanismo molecolare attraverso cui la T3 regola l'espressione di UCP3; 3) l'effetto della T3 sul profilo genico e biochimico-strutturale di differenti tessuti muscolari.
GENOVA (Dr. E. Fugassa): 1) l'effetto della T2 sul danno epatico indotto dall'alcool in fegato steatosico; 2) gli effetti delle iodotironine sulla capacità rigenerativa del fegato steatosico dopo epatectomia parziale.
PISA (Dr. A. Antonelli):1) gli effetti metabolici della T2 in pazienti in sovrappeso, con ipertrigliceridemia o con steatosi epatica.
NAPOLI (Dr. A. Barletta): 1) l' efficienza energetica di mitocondri isolati da fegato e differenti popolazioni mitocondriali di muscolo di ratto in diverse condizioni di efficienza metabolica. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Fernando GOGLIA Università degli Studi del SANNIO di BENEVENTO

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo della ricerca che si intende svolgere in questo progetto è quello di far luce sui meccanismi molecolari e cellulari che partecipano all'omeostasi metabolica in situazioni fisiologiche ed in quelle patologiche e che vedono interessati tessuti e sistemi quali il fegato, il muscolo scheletrico, il tessuto adiposo ed il sistema endocrino. Inoltre, si prevede di ottenere informazioni utili sui meccanismi cellulari coinvolti nell'omeostasi della spesa energetica dell'intero organismo. Ciò è di rilevante importanza considerato l'interesse sempre crescente da parte del mondo scientifico,e non, per le problematiche inerenti squilibri metabolici che conducono a problemi sociali sempre più in aumento. Recenti osservazioni, in particolare: 1) la scoperta della UCP3 quale proteina muscolare coinvolta nel metabolismo mitocondriale, 2) la scoperta che la T2, fino a poco tempo fa considerata una molecola biologicamente inattiva, è un composto capace di influenzare il metabolismo energetico con un meccanismo di azione diverso da quello della T3, 3)la scoperta della AQP8 nei mitocondri e, quindi, la possibilità che essa sia coinvolta nei meccanismi omeostatici di tali organuli, hanno aperto nuove ed interessanti prospettive circa i meccanismi molecolari che regolano il metabolismo energetico.Tuttavia, la loro importanza ed il loro coinvolgimento sono questioni ancora aperte e dibattute.Di particolare interesse è la possibiltà che la T2 possa ridurre l'adipostà sia corporea che ectopica. I principali obiettivi del presente progetto sono: 1) evidenzare la capacità da parte della T2 di influenzare l'adiposità stimolando l'ossidazione dei grassi senza indurre tireotossicosi; 2) verificare la possibilità che la T2 possa avere effetti benefici sull'adiposità epatica (steatosi), sul danno epatico indotto dall'alcool in fegato steatosico e sulla capacità rigenerativa del fegato steatosico dopo epatectomia parziale; 3) ottenere risultati che dimostrino la efficacia della T2 nel ridurre i livelli circolanti di LDL, di trigliceridi e della steatosi epatica in pazienti in sovrappeso, con alti livelli di LDL, con ipertrigliceridemia, e con steatosi epatica, tutti sottoposti a dieta normocalorica e con normale profilo serico di ormoni tiroidei; 4) evidenziare la via biochimica coinvolta negli effetti di ossidazione dei grassi da parte della T2 e quindi individuare il suo target cellulare sia nel fegato che nel tessuto adiposo bianco e bruno; 5) chiarire il meccanismo attraverso cui la T3 regola l'espressione di UCP3; 6) chiarire la correlazione esistente tra espressione di UCP3, metabolismo dei substrati e composizione delle fibre muscolari; 7) chiarire se l'efficienza metabolica mitocondriale rappresenti effettivamente un importante punto di controllo dell'omeostasi metabolica in risposta a variazioni dell'efficienza metabolica dell'organismo; 8) valutare la possibilità che AQP8 costituisca il canale molecolare dell'acqua della membrana mitocondriale interna(MMI) che abbia un ruolo chiave nel mantenimento del volume cellulare e che medii il movimento di piccoli metaboliti elettroliti o anaelettroliti attraverso la MMI;9) delineare la possibile interazione di AQP8 con i componenti molecolari del PTP e il ruolo che AQP8 svolge nell'omeostasi metabolica e nell'apoptosi.
Questi sono gli obiettivi a medio termine che si pensa di poter raggiungere nel giro di due anni. Tali obiettivi, però, ne includono altri a lungo termine. I risultati che si otterranno dalle ricerche proposte nel presente progetto, infatti, oltre a costituire un buon avanzamento nella conoscenza dei meccanismi di base della omeostasi metabolica potranno costituire la base di partenza per ricerche tese ad elaborare strategie applicative/terapeutiche mirate alla risoluzione di problemi di alterata omeostasi metabolica che hanno grossi risvolti sociali quali le dislipidemie, la steatosi epatica e l'eccesso di adiposità (sovrappeso corporeo o obesità). <<<

Risultati parziali attesi

Sulla base di quanto descritto, ci si attende di chiarire o acquisire importanti informazioni riguardo i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nell'omeostasi metabolica in situazioni fisiologiche ed in quelle patologiche. Ci si attende di ottenere risultati che permettano di stabilire: 1) l' influenza della T2 sull'adiposità sia nel ratto che nell'uomo; 2) l' efficacia della T2 nel ridurre i livelli circolanti di LDL, di trigliceridi e della steatosi epatica nell'uomo e nel ratto; 3) la possibilità che la T2 possa avere effetti benefici sul danno epatico indotto dall'alcool in fegato steatosico e sulla capacità rigenerativa del fegato steatosico dopo epatectomia parziale; 4) la via biochimica coinvolta negli effetti della T2 ed il sito cellulare target sia nel fegato che nel tessuto adiposo; 5) il meccanismo attraverso cui la T3 influenza l'espressione di UCP3; 6) la correlazione esistente tra espressione di UCP3, metabolismo dei substrati e composizione delle fibre muscolari; 7) il ruolo dei mitocondri di fegato e di muscolo scheletrico nell' omeostasi metabolica; 8) la possibilità che AQP8 medi il movimento acqua e di piccoli metaboliti elettroliti o anaelettroliti attraverso la MMI; 9) la regolazione dell'espressione di AQP8 da parte degli ormoni; 10) le possibili interazioni di AQP8 con il complesso PTP. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il metabolismo, meccanismo mediante il quale le cellule viventi ricavano e trasformano materia ed energia dai nutrienti, è un network complesso di reazioni chimiche cellulari costituito da molte vie biochimiche. Il controllo delle vie metaboliche può essere effettuato a tre livelli. Primo: espressione genica, traduzione e turnover proteico. Secondo: l'attività catalitica di enzimi (cioè attraverso modulatori allosterici, attivatori ed inibitori competitivi) e modificazioni post-traduzionali (quali fosforilazione, acetilazione e glicosilazione) generalmente sotto il controllo di ormoni, fattori di crescita e neurotrasmettitori. Terzo: disponibilità dei substrati, di solito controllata mediante equilibri in stato stazionario e compartimentalizzazione. L'ultimo dipende da sistemi di trasporti attivi di membrana e dalla diffusione passiva attraverso specifiche proteine di membrana.
Contrariamente ai sistemi fisici, i sistemi biologici presentano una complessa composizione, asimmetria strutturale ed il flusso di energia e le reazioni chimiche non sono mai all'equilibrio. Inoltre, gli organismi mantengono una struttura stabile per un lungo periodo di tempo. Questa stabilità delle grandi strutture con i componenti molecolari costantemente sostituiti e rigenerati è chiamata omeostasi, ossia mantenimento di uno "stato costante". Gli organismi viventi mantengono uno stato di omeostasi metabolica che può essere visto come uno stato-stazionario di bilancio tra l'ingresso e l'uscita di energia necessaria per sostenere le funzioni del corpo, strutture ed informazioni. Di conseguenza è possibile asserire che il metabolismo è un "processo dinamico di conversione energetica nelle cellule degli organismi viventi". In una rappresentazione più astratta, il metabolismo cellulare è un network spaziale e temporale di reazioni chimiche ed interazione molecolari vicine, ma mai all'equilibrio chimico.
Molti tessuti sono coinvolti nell'omeostasi metabolica. L'apparato muscolare, il fegato, il tessuto adiposo ed il sistema endocrino giocano un ruolo cruciale in questo network metabolico. I primi sono coinvolti nelle tappe che portano all'utilizzazione, alla trasformazione ed al deposito di energia mentre il sistema endocrino è principalmente coinvolto nel controllo e nella regolazione.
Il fegato svolge un ruolo centrale nell'omeostasi metabolica degli organismi superiori. La maggior parte dei carboidrati,dei lipidi e delle proteine è sintetizzata, metabolizzata e interconvertita nel fegato. I prodotti di tali trasformazioni sono rimossi o rilasciati nel circolo sanguigno in risposta alla necessità energetica e di substrati dei tessuti corporei. Il tessuto adiposo, che comprende il tessuto adiposo bianco (WAT) ed il bruno (BAT), gioca un ruolo cruciale nel metabolismo/bilancio energetico. Il WAT ha un ruolo fondamentale per il deposito di energia ed in situazioni di deficit energetici. Il BAT ha una capacità termogenica sostenuta da una elevata espressione a livello mitocondriale di enzimi coinvolti nell'ossidazione degli acidi grassi e di componenti della catena respiratoria. Tuttavia, l'aspetto distintivo principale del BAT è l'espressione di UCP1 che permette la dissipazione di energia attraverso il disaccoppiamento tra il consumo di ossigeno e la sintesi dell'ATP, e quindi la dissipazione di energia come calore. Il muscolo scheletrico, a causa della sua massa metabolica, (circa il 40 % del corpo completo), gioca un ruolo centrale nell'omeostasi metabolica, regolando il metabolismo energetico, il metabolismo glucidico e lipidico in risposta allo stato energetico dell'animale (1). Il muscolo gastrocnemio, in particolare, è altamente flessibile nel regolare la sua attività metabolica. A bassi livelli di ATP, esso devia verso il metabolismo ossidativo incrementando l'espressione di geni coinvolti nel metabolismo lipidico così come quella dei geni che dirigono la formazione di fibre di miosina "lente" (ossidative) (2). Quando i livelli energetici aumentano, il muscolo gastrocnemio può anche deviare verso un incrementato uptake e metabolismo di glucosio, regolando positivamente l'espressione di geni coinvolti nel metabolismo energetico e quelle delle fibre di miosina "veloci" (glicolitiche). Un aspetto interessante del metabolismo muscolare è la presenza,in tale tessuto, della proteina mitocondriale omologa di UCP1,"UCP3". È stato ipotizzato che UCP3 sia coinvolta nell'utilizzazione dei lipidi sebbene non sia chiaro se tale ruolo sia correlato al controllo dell'ossidazione lipidica o alla prevenzione della lipotossicità (3). E' stato inoltre suggerito che l'UCP3 sia coinvolta nella regolazione della produzione mitocondriale di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e dello stato redox e dello stress ossidativo nella cellula (3,4). La correlazione esistente tra espressione di UCP3 e metabolismo lipidico e tra metabolismo dei substrati e struttura muscolare rende particolarmente interessante studiare la relazione tra regolazione dell'espressione di UCP3 e composizione delle fibre muscolari. Tale aspetto è di notevole importanza considerato che il muscolo scheletrico insieme ad altri tessuti metabolicamente attivi, tra cui il fegato, svolge un ruolo fondamentale nella omeostasi metabolica. Diversi stimoli fisiologici, di cui due tra i principali sono rappresentati dalla quantità e qualità del cibo introdotto e dalla temperatura ambiente, influenzano lo stato metabolico dell'animale. Lo studio dei meccanismi che determinano l'efficienza energetica in tessuti quali il muscolo scheletrico e il fegato appare quindi importante anche allo scopo di acquisire nuove conoscenze sul ruolo svolto da tali tessuti nell'omeostasi energetica dell'organismo.

Uno dei più intriganti aspetti della moderna biologia è rappresentata dalla modulazione dell'espressione genica da parte di ormoni. I processi metabolici sono regolati da vari ormoni tra cui di particolare rilevanza sono le iodotironine (T4, T3 and T2). Nei vertebrati, la T3 (ritenuta la forma attiva delle iodotironine di cui la T4 è il precursore) è coinvolta nell'omoeostasi metabolica-energetica e nei processi di sviluppo e differenziamento agendo sulla differenziazione/proliferazione cellulare e su un network di pathway biochimiche integrate. Molti degli effetti attribuiti alla T3 sono esercitati attraverso la regolazione positiva o negativa di geni responsivi alla tiroide attraverso recettori per gli ormoni tiroidei (TRs). I TRs sono membri di una famiglia più ampia di recettori nucleari che, come ampiamente accettato, agiscono legandosi a specifici elementi di DNA (5-7), tuttavia è stato suggerito anche un meccanismo indipendente dal legame al DNA (8). Recentemente è stato dimostrato che l'espressione della proteina muscolare UCP3 incrementa nel ratto nella transizione ipo- eu- ipertiroidismo (9,10). Resta però da chiarire se tale regolazione associata allo stato tiroideo sia dovuta direttamente all'ormone o indirettamente dipenda dagli acidi grassi il cui livello incrementa nello stato ipertiroideo (11).

E' ben noto che gli ormoni tiroidei stimolano il metabolismo e allo stesso tempo riducono l'efficienza metabolica. Questo effetto è stato a lungo il centro delle ricerche sull'uso potenziale di ormoni tiroidei (THs) come droghe in grado di stimolare la perdita di peso. Tuttavia, la concomitante induzione di uno stato tireotossico ha fortemente limitato l'uso di T3 e T4 quali agenti riduttori di peso (Il termine "tireotossicosi" è usato secondo Braverman e Utiger (12) per intendere la sindrome clinica di ipermetabolismo che risulta quando la concentrazione serica di T3 libera (FT3) , T4 libera (FT4) o entrambe è incrementata come conseguenza della somministrazione esogena di questi ormoni). Alcuni segnali dello stato tireotossico sono: incremento della frequenza cardiaca, variazioni della massa della tiroide e del cuore, decremento della massa del muscolo scheletrico, e livelli serici di TSH che raggiungono valori minimi (12). In pazienti che ricevano THS, le variazioni nei parametri sovra citati (TSH, FT3 e FT4) costituiscono la conferma biochimica dello stato tireotossico.

Fino a tempi molti recenti, la T3 era comunemente ritenuta l'unica iodotironina attiva. Numerosi dati, comunque, hanno modificato questa visione ed è ora evidente che altre iodotironine, la T2 in particolare, hanno effetto biologico (13-18). Una singola dose di T2 (25 microgr/100g peso corporeo) stimola il metabolismo di riposo (RMR) di ratti ipotiroidei con un incremento (40%) analogo a quello indotto dalla stessa dose di T3; la T2, comunque, agisce attraverso un meccanismo diverso da quello della T3, meccanismo non coinvolgente la via nucleare (16). La T2, inoltre, induce inefficienza metabolica, stimolando la perdita energetica attraverso meccanismi di proton-leak/redox-slip mitocondriali (19,20). È ipotizzabile che tale inefficienza energetica possa indurre un ridotto accumulo energetico. Un tale effetto potrebbe essere di beneficio nella regolazione dell'adiposità corporea.
I lipidi possono trovarsi sia nel sangue che nei tessuti, dove essi sono presenti sia come acidi grassi (FA) che come trigliceridi. Il tessuto adiposo è il tessuto di riserva dove normalmente si accumulano i lipidi sotto forma di trigliceridi; i lipidi però si possono accumulare anche in altri tessuti (accumulo ectopico) quali il fegato ed i muscoli. In questi tessuti il loro accumulo può avere conseguenze patologiche molto gravi. Il soprappeso, la steatosi epatica, e la dislipidemia (incremento dei livelli di colesterolo e trigliceridi nel sangue) sono problemi crescenti nei paesi occidentali. La patologia del fegato grasso indotto da dieta e non da alcool (NAFLD) infatti è ormai molto diffusa e fino al 24% della popolazione ne soffre (21). Ciò è correlato all'incremento epidemico dell'obesità nelle nostre società. Sebbene la NAFLD sia asintomatica, fino al 20% dei soggetti affetti può progredire verso la cirrosi e necessitare poi di trapianto (21, 22). Nonostante che una riduzione significativa e prolungata dell'introito calorico possa alleviare la NAFLD, la guarigione è un evento raro nei casi reali. Tenuto conto di ciò, è evidente la necessità di una terapia farmacologica efficace. Visti gli effetti della T2 sul metabolismo, sarebbe interessante studiare gli effetti della somministrazione di T2 sull'adiposità corporea ed epatica e valutare la possibilità che tale iodotironina abbia un ruolo citoprotettivo nel danno indotto da alcool in fegato steatosico e nella rigenerazione del fegato steatosico.

I mitocondri, importanti siti della traduzione energetica cellulare, svolgono un ruolo fondamentale negli effetti che gli ormoni tiroidei svolgono sul metabolismo energetico. Notevoli variazioni avvengono nel compartimento mitocondriale in risposta sia agli ormoni tiroidei che a stati fisiologici in cui si modifica l'attività della ghiandola (10). Il metabolismo cellulare genera calore e i mitocondri sono il sito cellulare in cui la maggior parte dell'ossigeno è utilizzato. Negli animali, l'energia libera è ricavata dall'ossidazione dei nutrienti: grassi, zuccheri e proteine. Nella cellula, l'ossidazione dei substrati è accoppiata all'ossido-riduzione dei coenzimi, tra cui il NAD/NADH. Il completamento dell'ossidazione dei substrati è opera della catena di trasporto degli elettroni mediante la quale il processo è accoppiato alla costruzione di un gradiente protonico ai lati della membrana mitocondriale interna. Tale gradiente fornisce la forza che spinge i protoni a rientrare nella matrice mitocondriale attraverso il complesso dell'ATP sintetasi, creando l'accoppiamento tra ossidazione dei substrati e sintesi di ATP. Sebbene si sia ritenuto a lungo che il metabolismo energetico fosse completamente accoppiato alla produzione di ATP, è ora ben chiaro che il sistema descritto non è perfettamente efficiente, esistendo, ai lati della membrana mitocondriale interna, una perdita protonica (proton-leak)non associata a sintesi di ATP o una ridotta efficienza di pompaggio protonico (redox-slip), processi che dissipano parte dell'energia del gradiente elettrochimico in forma di calore(vedi schema).



La morfologia mitocondriale e lo stato di idratazione della matrice mitocondriale sono fattori critici per la funzionalità del mitocondrio (23,24) visto che alterazioni del volume mitocondriale compromettono fortemente la fosforilazione ossidativa sfociando spesso in risposte apoptotiche (23). La modulazione a breve termine del volume cellulare dell'epatocita rappresenta un potente segnale influenzante il metabolismo cellulare e l'espressione genica (25,26). Anche lo stato metabolico della fibra muscolare scheletrica è stato riportato essere fortemente influenzato dallo stato di idratazione cellulare (27).Sebbene il volume dei mitocondri dipenda dalla quantità di acqua che transita attraverso le membrane mitocondriali, la via molecolare attraverso cui l'acqua segue osmoticamente il movimento netto di ioni attraverso la membrana mitocondriale interna non è nota. Una pietra miliare nella conoscenza delle vie e dei meccanismi con cui l'acqua è trasportata sotto la spinta osmotica attraverso le membrane degli organismi viventi è stata rappresentata dalla scoperta delle acquaporine (AQP) (Premio Nobel per la Chimica 2003, Peter Agre). Più recentemente, in particolare, è stata caratterizzata la AQP8 (28,29), in grado di modulare la secrezione o l'assorbimento di fluidi da parte di epiteli riproduttivi (30) e gastrointestinali (31), e l'omeostasi metabolica in quanto: 1)localizzata in compartimenti cellulari ad azione metabolica quali mitocondri e reticolo endoplasmatico liscio (32), 2)correlata trascrizionalmente all'accumulo di glicogeno epatico (32) e 3)regolata post-traduzionalmente da parte di ormoni ad azione metabolica quali il glucagone (33). Data la centralità nel metabolismo cellulare della regolazione del volume mitocondriale diventa interessante caratterizzare biofisicamente il trasporto d'acqua attraverso i mitocondri, valutare la possibilità che AQP8 costituisca il canale molecolare dell'acqua a livello mitocondriale e valutare possibili regolazioni della proteina da parte di ormoni ad azione metabolica quali gli ormoni tiroidei.
Di rilevante importanza sarebbe lo studio della possibile interazione della AQP8 con i componenti del Poro di transizione di Permeabilità (PTP)coinvolto nell'apoptosi (vedi schema). Infatti, uno dei primi eventi che si osserva durante i processi apoptotici è lo swelling della matrice mitocondriale(34,35), il che rende possibile che l'attivazione e/o l'induzione dell'espressione di AQP8 costituisca uno degli eventi precoci innescati nei processi apoptotici (indotti da vari tipi di stress incluso quello ossidativo).

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