RICERCA ITALIANA     

APPRENDIMENTO E MEMORIA: STUDIO NEUROFISIOLOGICO E MOLECOLARE

Università di Pisa

Abstract

Il presente Programma di Ricerca ha lo scopo di investigare, comparativamente in vari modelli animali, alcuni meccanismi comuni della memoria (MEM) e la loro capacità di essere modulati. A tal fine si sono aggregati ricercatori con differente "background" culturale e diversificato approccio metodologico.
La ricerca sui meccanismi cellulari e molecolari che sono alla base dell'apprendimento (APPR) e di MEM ha ottenuto rilevanti risultati attraverso lo studio di modelli elementari di Invertebrati in cui è possibile analizzare durante APPR, in parallelo, le modificazioni del comportamento ed i cambiamenti plastici che si instaurano nei circuiti neurali.
Nei Vertebrati, invece, l'indagine si è focalizzata su modelli neurali di plasticità sinaptica attività-dipendente quale la "Long Term Potentiation" (LTP) e i rapporti tra questa e l'APPR associativo.
Il piano di ricerca si può così sintetizzare:
1. Studio di APPR non associativo (ANA) a breve (BT) e a lungo termine (LT) nella sanguisuga "Hirudo medicinalis". Nei neuroni sensoriali T di Hirudo, abbiamo osservato che la modulazione della Na+/K+ATPasi, studiata come variazione dell'iperpolarizzazione postuma (AHP), si è rivelata alla base dell'abitudine (Abt) e della sensitizzazione (Ses) nel modello comportamentale dell'induzione al nuoto. La Na+/K+ATPasi è inibita dalla 5HT, tramite cAMP, ed è invece potenziata dalla stimolazione ripetuta a bassa cadenza delle cellule T. E' stata studiata, a livello elettrofisiologico e comportamentale, la catena di eventi che dalla stimolazione elettrica ripetuta, attraverso la possibile attivazione della fosfolipasi A2 (PLA2) e la formazione di metaboliti dell'acido arachidonico, conduce alla facilitazione della Na+/K+ATPasi. Si approfondirà questa analisi molecolare indagando il ruolo del Ca++ dei compartimenti intracellulari, dell'attività mitocondriale, dei metaboliti della via 5-lipoossigenasica, della tirosin kinasi nel potenziamento della Na+/K+ATPasi. Si studieranno le modificazioni sinaptiche tra le cellule T e i loro "followers" correlate alle variazioni dell'ampiezza dell'AHP (e quindi dell'attività della Na+/K+ ATPasi).
2. Si analizzerà se alcuni trasmettitori e il protoormone PACAP influenzino Abt e Ses in Hirudo e nella risposta olfatto-cardiaca del dittero P. terraenovae.
3. Si chiarirà se la modulazione della Na+/K+ATPasi nei neuroni piramidali dell'ippocampo influenzi la LTP.
4. Si analizzerà il ruolo delle neurotrofine PAF, TGF beta1, BDNF, FMFR ammide, nelle forme di ANA in Hirudo e nelle forme di APPR Associativo legate al "fear conditioning"(FC) nel ratto.
5. Si identificheranno i meccanismi molecolari che sostengono la trasformazione di APPR BT in APPR LT, chiarendo, in Hirudo, la cascata di eventi che tramite PKA e MAPK portano ad Abt LT.
6. Si identificherà il ruolo di APPR nella neurogenesi nel ratto adulto e si chiarirà se processi di APPR siano in grado di inserire in circuiti funzionali, con capacità plastiche, i neuroni che continuamente si formano e vanno incontro a morte. Si identificherà il ruolo del PACAP nella neurogenesi.
7. Si chiariranno i meccanismi alla base della riattivazione della traccia mnemonica (retrieval) nelle forme di ANA di Hirudo e nel FC a stimolo condizionato acustico e al contesto.
8. Si chiarirà il ruolo che la proteina prionica (PrPc) ha nella funzione sinaptica e in particolare nelle reazioni mnemogeniche in neuroni di Hirudo e in neuroni ippocampali in coltura che over-esprimono PrPc. In questi ultimi si studieranno le variazioni del Ca++ citosolico.
9. Si sintetizzeranno gli oligonucleotidi antisenso e siRNA contro mRNA di ERK1/2, Fyn chinasi e PrPc da utilizzare intracerebralmente in forme di APPR nei ratti.
10. Tramite ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH) si identificheranno i geni che codificano, sia nell'invertebrato sia nel ratto, per le proteine coinvolte in APPR LT.
11. Si identificheranno gli effetti del PACAP sull'amigdala durante il FC e il contextual FC nel ratto. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Marcello BRUNELLI Università di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto di ricerca è una diretta prosecuzione del precedente progetto 2001 finanziato dal MIUR. Esso prevede di continuare lo studio dei meccanismi neurofisiologici cellulari e molecolari che sono alla base dell'Apprendimento (APPR) e della Memoria (MEM).
Ricercatori con diverso "background" culturale e diversificato "training" metodologico si sono aggregati allo scopo di analizzare i meccanismi cellulari e molecolari di APPR nei vari modelli di studio con l'intento di potenziare anche in Italia questo tipo di ricerche ampiamente sviluppate nei laboratori internazionali di maggiore prestigio. Pertanto, gruppi da tempo attivi nel campo dei modelli neurali elementari (es. invertebrati) si sono uniti a "teams" che stanno affrontando anche altre tematiche, ma che possono portare nuove idee allo studio di APPR (come per es. i rapporti tra neurogenesi e APPR e MEM o il ruolo della proteina prionica nella plasticità neurale).
In sintesi gli obiettivi del progetto sono:
A. Approfondire i meccanismi alla base di forme di APPR non associativo (ANA) a breve termine (BT) e a lungo termine (LT) nel modello comportamentale e neurale della sanguisuga Hirudo medicinalis e nel dittero Protophormia terraenovae.
B. Confrontare i meccanismi alla base della plasticità neurale attività-dipendente, quale LTP nell'ippocampo e nell'amigdala, con i processi di APPR e MEM in forme di APPR associativo nel ratto.
A) Si studieranno forme di ANA BT e LT nel sistema nervoso gangliare della sanguisuga Hirudo medicinalis. Nei neuroni sensoriali T di Hirudo, i ricercatori dell'U.O. di Pisa hanno individuato nella modulazione dell'attività della NA+/K+ATPasi, responsabile dell'iperpolarizzazione postuma (AHP), un nuovo meccanismo di plasticità attività-dipendente correlabile all'ANA BT. La 5HT, via cAMP, inibisce la Na+/K+ATPasi che è, invece, potenziata dalla stimolazione intracellulare ripetuta del neurone T. L'aumento di ampiezza dell'AHP si è dimostrato correlato al decremento dell'attività sinaptica dei neuroni T e ciò potrebbe essere alla base dell'abitudine (Abt) nel modello comportamentale dell'induzione al nuoto.
Nel corso del precedente progetto è stata individuata la catena molecolare intracellulare alla base dell' aumento dell'AHP nel neurone T. La stimolazione elettrica ripetuta porta all'entrata di Ca++ tramite canali Ca++ nifedipina-sensibili. L'aumento del Ca++ citosolico attiva la fosfolipasi A2 (PLA2) che promuove la liberazione di acido arachidonico (AA) e la formazione di metaboliti derivati dalla via 5-lipoossigenasica, che probabilmente vanno a potenziare la Na+/K+ATPasi che si è dimostrata responsabile dell'aumento dell'AHP. La stessa catena di eventi, a livello comportamentale, si è dimostrata avere un ruolo nella Abt BT.
Nel presente progetto si vuole indagare:
1) se la 5HT e il cAMP nell'indurre riduzione dell'AHP producono un aumento degli EPSP allo scopo di chiarire se cambiamenti in ampiezza dell'AHP si traducono in modificazioni dei potenziali sinaptici;
2) se i prodotti della via 5-lipoossigenasica inducono un potenziamento della Na+/K+ATPasi. Verranno perciò condotti esperimenti di stimolazione diretta della Na+/K+ATPasi tramite iniezione intracellulare di Na+ in presenza dei vari metaboliti dell'acido arachidonico;
3) con l'U.O. di Bologna il ruolo della PLA2 citosolica (cPLA2) utilizzando oligonucleotidi antisenso e siRNA diretti contro la cPLA2;
4) il coinvolgimento del Ca++ dei depositi intracellulari e dell'attività mitocondriale nell'incremento dell'AHP dopo stimolazione ripetuta.
Verranno inoltre eseguite determinazioni biochimiche dell'attività della Na+/K+ATPasi in preparati sottoposti a stimolazione ripetuta o a trattatamenti con 5HT.
- L'U.O. di Cagliari studierà l'ANA nell'insetto "Protophormia terraenovae". In particolare, la dinamica di sensitizzazione (Ses) e di Abt della risposta olfatto-cardiaca, analizzando il coinvolgimento di secondi messaggeri in queste forme di APPR; il ruolo che il Pituitary Adenylate Cyclase-activating Polypeptide, PACAP, può rivestire nei processi mnemonici di Protophormia in condizioni di integrità.
La trasformazione dell'ANA BT in ANA LT è stato studiato in alcuni invertebrati (es. Aplysia) dove si è visto che la PKA, attraverso l'attivazione del fattore di trascrizione CREB1 e l'inibizione del repressore CREB2, porta alla formazione di nuove proteine. Utilizzando tecniche di genetica molecolare (SSH, "subtractive subtraction hybridyzation") si cercherà di individuare i geni espressi durante la formazione di MEM LT e responsabili della sintesi di nuove proteine in Hirudo e, in un secondo tempo, in Protophormia.
Inoltre, verrà indagato il ruolo delle thyrosin-chinasi e delle MAP chinasi nelle di forme di APPR LT.
Poco si sa su Abt LT e sui meccanismi che portano alla neoformazione di proteine in questa forma di APPR LT. Verranno indagati, sia in Hirudo, sia in Protophormia, gli effetti di alcuni neuropeptidi quali il protoormone PACAP, il PAF ("Platelet Activating Factor"), Il TGF beta1 e la FMFR ammide nel passaggio da MEM BT a MEM LT.
Con un esperimento originale si cercherà di indagare il recupero dell'engramma nella MEM LT sia in Hirudo, sia nel SNC di ratto. Verrà studiato, anche a livello cellulare, il perché della labilità delle risposte LT.
Inoltre, una serie di esperimenti sarà volta a studiare, in Hirudo, l'APPR associativo utilizzando un apparato Skinneriano messo a punto dal gruppo di ricerca di Pisa.
B) APPRENDIMENTO NEI VERTEBRATI
Visti i risultati ottenuti nell'invertebrato, nel SNC di Vertebrato (ratto) verrà analizzato l'eventuale coinvolgimento della pompa Na+/K+ ATPasi nell'induzione e nel consolidamento della LTP (U.O. di Pisa). Si indagherà, "in vivo", il ruolo delle MAPKs negli eventi che portano alla formazione della traccia mnemonica del "contextual fear conditioning" (U.O. di Firenze) e "in vitro", su "slices" ippocampali il ruolo delle MAPKs e della PLA2 negli eventi che portano al consolidamento della LTP (U.O. di Pisa), utilizzando vari approcci tra cui l'uso di oligonucleotidi antisenso diretti contro PLA2 e MAPKs (in collaborazione con U.O. di Bologna).
Sempre nel "contextual fear conditioning" verrà indagato se questa forma di APPR influenzi la LTP in amigdala.
L'U.O. di Urbino studierà i meccanismi attraverso i quali forme di APPR inducono cambiamenti nella sopravvivenza delle cellule neonate e se agenti modulanti APPR (es. PACAP) abbiano un ruolo nel migliorare la performance dell'APPR mediante modulazione quantitativa della neurogenesi.
L'effetto di neuromodulatori quali il PACAP e il TGF beta1 verrà analizzato sull'induzione di LTP anche in singoli neuroni ippocampali e dell'amigdala. Si è già dimostrato che il PACAP, a bassissime dosi, induce fenomeni di potenziamento dei fEPSPs nell'ippocampo.
Un'indagine di grande interesse condotta dall'U.O. di Bologna mirerà a studiare il ruolo della proteina prionica PrPc, oggi considerata anche una proteina sinaptica capace di reazioni mnemogeniche, sulle forme di APPR in studio. Su cellule di ippocampo che abbiano incorporato PrPc verranno condotti esperimenti di spettrofluorimetria (in collaborazione con l'U.O. di Pisa) e di elettrofisiologia (in collaborazione con l'U.O. di Urbino).
Sarà studiato il ruolo dell'ippocampo nella riattivazione della traccia mnemonica del fear conditioning ad un CS acustico ed al contesto.
Si studierà anche l'espressione di sequenze geniche durante la memorizzazione del fear conditioning nel ratto.
Si studierà (U.O. di Firenze) il ruolo dell'input sinaptico sulle cellule in via di differenziazione di tipo neurale nella memorizzazione del "trace fear conditioning" nel ratto adulto (in collaborazione con l'U.O. di Urbino).
Altri esperimenti saranno descritti in dettaglio nella Descrizione del Programma di Ricerca. <<<

Risultati parziali attesi

I principali risultati che si vogliono ottenere nel corso della prima fase possono essere così schematizzati:
1. Chiarire se il Ca++ dei depositi intracellulari sia coinvolto nella catena di eventi molecolari alla base di Abt BT in Hirudo.
2. Individuare quali metaboliti della via 5-lipoossigenasica inducono potenziamento della Na+/K+ATPasi.
3. Osservare se la diminuzione di ampiezza dell'AHP indotta da 5HT si traduca in un aumento dell'efficacia sinaptica tra i neuroni T e i loro "followers".
4. Chiarire se l'attività della Na+/K+ATPasi sia regolata dalle tirosin-chinasi.
5. Osservare se alcuni neurotrasmettitori o il cAMP siano coinvolti in ANA in Protophormia, e analizzare l'eventuale ruolo del PACAP in Ses e Dsb in questo modello.
6. Chiarire se la modulazione della Na+/K+ATPasi nei neuroni piramidali dell'ippocampo intervenga nell'induzione e consolidamento di LTP.
7. Analizzare il ruolo delle neurotrofine PAF, TGF beta1, BDNF, FMFR ammide, nelle forme di ANA in Hirudo e nelle forme di APPR associativo legate al "fear conditioning" nel ratto.
8. Identificare i meccanismi molecolari che sostengono la trasformazione di APPR BT in APPR LT, chiarendo, in Hirudo, la cascata di eventi che tramite PKA e MAPK portano ad Abt LT.
9. Identificare il ruolo di APPR nella neurogenesi nel ratto adulto e chiarire se processi di APPR siano in grado di inserire in circuiti funzionali con capacità plastiche i neuroni che continuamente si formano e vanno incontro a morte.
10. Identificare il ruolo delle MAPKs negli eventi che portano alla formazione della traccia mnemonica del "contextual fear conditioning".
11. Chiarire i meccanismi alla base della riattivazione della traccia mnemonica (retrieval) nel "fear conditioning" a CS acustico e al contesto.
12. Determinare il ruolo dell'input sinaptico sulle cellule neonate durante i tempi precoci del differenziamento neuronale. L'input sinaptico potrebbe produrre aumento del Ca++ citosolico che può dare effetti citotossici e morte cellulare.
13. Chiarire il ruolo che la proteina prionica (PrPc) ha nella funzione sinaptica e in particolare nelle reazioni mnemogeniche in neuroni di Hirudo e in neuroni ippocampali in coltura.
14. Sintetizzare gli oligonucleotidi antisenso contro mRNA di ERK1/2, Fyn chinasi e PrPc da utilizzare intracerebralmente in forme di APPR nei ratti.I risultati attesi nella seconda fase sono qui riassunti.
1. Chiarire il coinvolgimento mitocondriale e il ruolo del Ca++ citosolico nell'aumento dell'AHP nei neuroni T indotto da stimolazione ripetuta
2. Chiarire, mediante determinazioni biochimiche, se l'attività della Na+/K+ATPasi viene modulata dalla stimolazione ripetuta e/o dalla 5HT.
3. Chiarire il ruolo della cPLA2 nei processi di APPR.
4. Individuare l'eventuale ruolo di alcune neurotrofine nel passaggio da APPR BT ad APPR LT.
5. Dal momento che esperimenti preliminari hanno rilevato una forte espressione di PrPc nei gangli di Hirudo, ci si attende di identificare una relazione tra l'espressione di PrPc e i meccanismi di ANA e MEM.
6. Individuare gli effetti prodotti dall'applicazione di PACAP nella risposta olfatto-cardiaca di Protophormia.
7. Tramite la metodica dell'ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH) si intende chiarire la cascata genica che porta all'espressione di determinati geni che conducono, sia nei modelli di invertebrato, sia nel ratto, alla sintesi delle proteine necessarie al consolidamento di APPR.
8. Chiarire i meccanismi che consentono il recupero della traccia mnemonica (retrieval) nelle forme di ANA in Hirudo.
9. Identificare gli effetti del PACAP sull'amigdala basolaterale durante il "fear conditioning" nel ratto.
10. Chiarire se il "contextual fear conditioning" influenzi la LTP nell'amigdala.
11. Verificare se il PACAP abbia un ruolo anche nella regolazione della neurogenesi ippocampale adulta.
12. Verificare se l'afferenza glutammatergica sulle cellule in via di differenziazione di tipo neuronale del giro dentato sia necessaria nella memorizzazione del "trace fear conditioning" nel ratto adulto.
13. Studiare la capacità delle cellule ippocampali neoformate in corso di differenziamento neuronale a indurre e sostenere LTP. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Nelle numerose malattie degenerative del SNC e nell'Alzheimer primariamente, l'incapacità di trattenere le informazioni, di riconoscere il piccolo mondo di oggetti, ambienti e persone che costituiscono la cornice al proprio io, apre uno scenario di tragica solitudine e di irreversibile frammentazione della personalità.
Per risolvere questi problemi patologici è necessario conoscere come le informazioni che giungono dall'esterno vengono ritenute dalle cellule nervose e come questi engrammi persistano a lungo. Risolvere questi problemi richiede perciò livelli multipli di analisi e la convergenza di diversi approcci metodologici.
Scuole di ricerca prestigiose hanno fornito notevoli contributi allo studio dei meccanismi cellulari e molecolari dell'apprendimento (APPR) e della memoria (MEM) attraverso l'analisi di modelli elementari. In particolare, nel sistema nervoso gangliare degli Invertebrati si possono identificare tutte le cellule che costituiscono le reti neurali alla base di ogni atto comportamentale e identificare i siti molecolari a livello dei quali intervengono i cambiamenti plastici che sottendono alle varie forme di APPR. In Italia, pochi sono i gruppi di ricerca operanti nel settore di APPR in modelli elementari.
Le varie UU.OO. del nostro progetto, con ricercatori esperti e con diverse competenze, condurranno esperimenti sia su modelli di Invertebrato sia di Vertebrato allo scopo di comparare i meccanismi che sono alla base delle diverse forme di APPR. Lo studio di semplici forme di Apprendimento non Associativo (ANA) quali l'Abitudine (Abt) e la Sensitizzazione (Ses) o la Disabitudine (Dsb) in modelli neurali elementari ha permesso di individuare alcuni meccanismi dell'alfabeto molecolare comune ai diversi fenomeni mnestici che si riscontrano invariati lungo la scala filogenetica.
L'analisi più completa dei meccanismi di ANA è stata realizzata sul riflesso di retrazione del sifone nel mollusco marino Aplysia per merito del premio Nobel 2000 E. Kandel e della sua Scuola. In particolare, è emerso che Ses e Dsb a breve termine (BT) si realizzano attraverso un potenziamento della sinapsi tra i neuroni sensoriali e quelli motori, dovuto a vie serotoninergiche che, attraverso l'incremento di cAMP e l'attivazione di PKA, inducono un aumento del rilascio di trasmettitore (1).
In Abt si osserva un progressivo decremento dell'efficacia sinaptica tra neuroni sensoriali e motori. La catena di eventi molecolari è ancora poco conosciuta.
Il nostro gruppo di ricercatori ha identificato i meccanismi cellulari alla base dell'ANA nel modello sperimentale dell'induzione al nuoto nella sanguisuga H. medicinalis. La stimolazione tattile e/o elettrica della cute, attivando neuroni meccanocettivi (cellule T) induce un episodio di nuoto con latenza costante. La stimolazione ripetuta ad intervalli costanti porta ad un incremento della latenza, Abt (2); al contrario, una stimolazione nocicettiva causa una netta riduzione della latenza, sia in animali naif, Ses, sia in animali precedentemente abituati, Dsb.
Così come in Aplysia, in Hirudo la 5HT via cAMP è coinvolta in Ses e in Dsb (3). L'aspetto originale emerso in Hirudo è che la 5HT, via cAMP, va ad inibire la Na+/K+ATPasi dei neuroni T (4,5), che, in queste cellule, è responsabile dell'iperpolarizzazione postuma (AHP) associata ad ogni scarica di potenziali d'azione. A livello neuroetologico, iniezioni di 5HT o di analoghi del cAMP inducono Ses e Dsb.
Si è poi osservato che la stimolazione ripetuta ad intervalli costanti del neurone T (primo elemento cellulare attivato nell'induzione al nuoto) porta ad un progressivo aumento dell'ampiezza dell'AHP per potenziamento dell'attività della Na+/K+ATPasi.
Il lavoro sperimentale sviluppato nel precedente progetto finanziato dal MIUR ha fornito risultati nuovi ed originali:
a)la stimolazione ripetuta innesca una cascata di eventi molecolari intracellulari che portano al potenziamento dell'attività della Na+/K+ATPasi e ad una riduzione della risposta sinaptica tra i neuroni sensoriali T e i loro "followers"(6).
b) La modulazione della Na+/K+ATPasi, in direzioni opposte da parte di differenti "inputs" rappresenta un meccanismo fondamentale per la formazione di ANA.
La Na+/K+ATPasi è una pompa trasduttrice di energia inserita nelle membrane cellulari. I nostri esperimenti hanno messo in evidenza una funzione importantissima della Na+/K+ATPasi quale mediatore e trasduttore di segnali. L'enzima, nel microambiente cellulare, diviene un centro fondamentale che riceve segnali esterni e, consente la trasduzione di questi segnali orientandoli verso diversi targets intracellulari andando ad influenzare eventi fondamentali (soprattutto a lungo termine) quali il trofismo e i cambiamenti funzionali plastici, anche attraverso meccanismi di espressione genica. Per interazione tra la Na+/K+ ATPasi e le caveoline (proteine costituenti le caveole della membrana plasmatica) si ha trasduzione del segnale. La subunità alfa della Na+/K+ ATPasi umana contiene 2 caveolin-binding motifs (CBM), importanti affinché la Na+/K+ ATPasi possa trasdurre segnali extracellulari.
L'interazione Na+/K+ ATPasi-proteine serve a concentrare l'enzima e altre proteine segnale nelle caveole, formando un complesso definito "segnalosoma" (7). È da questa struttura complessa della membrana cellulare che partono i segnali per le modificazioni cellulari LT.

APPR BT (minuti/ore) può trasformarsi in APPR LT. Inibitori della sintesi proteica o dell'RNA messaggero impediscono questo processo LT. Ciò suggerisce che negli eventi di MEM LT c'è la formazione di nuove proteine per attivazione di meccanismi di trascrizione e trasduzione. Questi meccanismi sono stati ampiamente studiati in Ses e in Dsb
Nella Dsb LT l'attivazione di una PKA provoca la fosforilazione di un fattore altamente conservato, il CREB ("cAMP responsive element binding protein"), che determina l'aumento della trascrizione di geni cAMP-inducibili (7, 8). In Drosophila e in Aplysia, nella fase d'inizio, l'attivazione di fattori come CREB1 e/o l'inattivazione di fattori inibitori come CREB2 (che ha la funzione di repressore) favoriscono l'immagazzinamento LT (9,10). CREB2 non contiene siti di fosforilazione per PKA ma ha siti per PKC e per MAPK. In Aplysia, in seguito ad applicazione ripetuta di 5HT, MAPK trasloca nel nucleo dei neuroni sensoriali e fosforila ApC/EBP. Recentemente, è stato osservato (13) che la 5HT attiva e rilascia fattori di crescita neurotrofine-simili (BDNF) che via tirosin-chinasi attivano le MAPKs che fosforilano CREB2 bloccando la sua inibizione su CREB1.
Poco si sa, invece, sugli eventi che trasformano Abt BT in Abt LT.
L'insetto "Protophormia terranovae", se sottoposto a stimoli olfattori, mostra risposte dirette comportamentali e risposte cardiache per via nervosa riflessa di tipo "heart beat reversal" (12). La risposta può essere monitorata elettrofisiologicamente simultaneamente all'input sensoriale. Si è visto che in Protophormia una serie di stimolazioni olfattorie inducono Abt e MEM Bt e LT. L'U.O. di Cagliari intende analizzare la catena di eventi molecolari che permettono il consolidamento di MEM. Verranno studiati gli effetti del protoormone PACAP sull'APPR della risposta olfatto-cardiaca.
Nel presente progetto verrà affrontato uno studio di biologia molecolare, inizialmente in Hirudo e successivamente in Protophormia, in animali addestrati a LT, allo scopo di individuare i geni differenzialmente espressi nei processi di memorizzazione.
Nella MEM LT i neuroni riacquisterebbero la capacità che hanno durante lo sviluppo come per esempio l'elaborazione di neurotrofine (NTF). Nel presente studio si indagheranno gli effetti di alcune neurotrofine (PAF, TGF b1, BDNF, FMFR-ammide) nei processi di APPR LT. Una certa rilevanza ha il protoormone PACAP, che, isolato dal tessuto ipotalamico di ovino (13) è presente nel cervello dei mammiferi. Da studi condotti in Drosophila su mutanti del gene "amnesiac" (incapaci di apprendere semplici atti comportamentali) è emersa l'omologia di un neuropeptide con il PACAP, che attiva i sistemi colinergici. Da studi effettuati in collaborazione tra l'U.O. di Pisa e quella di Firenze è emerso che, in ratti giovani, il PACAP38, somministrato nei ventricoli cerebrali alla concentrazione di 5nM, produce un significativo miglioramento nei test di ritenzione in un paradigma di "passive avoidance response" (14). Applicato in "slices" di ippocampo a basse dosi produce un potenziamento della LTP bloccato dagli inibitori dei recettori muscarinici (15). Il PACAP potrebbe allora essere utile nel trattamento del morbo di Alzheimer dove c'è un chiaro deficit dell'attività colinergica.

MODELLI DI APPR NEI VERTEBRATI
Nel SNC dei Vertebrati lo studio sui meccanismi della MEM si è concentrato sulla LTP. La LTP ippocampale è un evento di plasticità neurale attività-dipendente che si osserva sia in "vivo" sia in "vitro", dopo stimolazioni ad alta frequenza delle fibre collaterali di Schaffer che produce nei neuroni ippocampali piramidali CA1 un aumento persistente dell'ampiezza dei "fields"EPSP (fEPSP). Treni ad alta frequenza producono L-LTP che perdura per almeno 8 ore. L'L-LTP può essere indotta anche da applicazioni ripetute di analoghi del cAMP ed è bloccata da inibitori di PKA e della sintesi proteica (16). Risultano quindi indispensabili per l'instaurarsi dell'L-LTP sia la sintesi "ex novo" di proteine che l'espressione genica cAMP-mediata indotta dall'attivazione del CREB. Importante è inoltre l'inibizione di soppressori quali il complesso CREB2, che è noto essere fosforilato in "vitro" da MAPKs e PKC.
La collaborazione tra le UU.OO. di Pisa e Firenze proseguirà sui seguenti argomenti:
1) Approfondire lo studio delle modificazioni dell'induzione della LTP durante il "fear conditioning".
2) Chiarire il legame tra l'LTP e i cambiamenti di comportamento dovuti a APPR e MEM. Nell' ippocampo sarà interessante studiare il consolidamento dell'LTP con vari approcci: a) interferendo con l'attività di PKA, di PLA2 e di MAPKs; b) Tramite l'uso di oligonucleotidi antisenso o siRNA per la PLA2 e MAPKs.
3) Lo studio del ruolo delle MAPKs ERK nell'amigdala in correlazione ad APPR e MEM.
4) Lo studio dell'espressione di sequenze geniche durante eventi di memorizzazione.
La memoria, inizialmente, si trova in una forma labile, dopo di che viene "consolidata" e "fissata" in una forma stabile e permanente. Alcuni agenti amnesici, quali lo shock elettroconvulsivo e l'inibizione della sintesi proteica, sono efficaci nell'indurre amnesia se vengono somministrati durante le prime ore successive all'esperienza da apprendere (17,18). La riattivazione della memoria, mediante un reminder, la rende nuovamente sensibile a quelle stesse manipolazioni che causano perdita della memoria dopo APPR iniziale, suggerendo che vi sia un processo di "riconsolidamento" simile o identico a quanto avviene durante il consolidamento iniziale (19-22). In molte specie di mammiferi, incluso l'uomo, l'ippocampo mantiene la possibilità di dare origine a nuovi neuroni per tutta la vita adulta (23, 24). Infatti, precursori primari, localizzati al bordo dello strato dei granuli identificati come cellule simili agli astrociti (25), proliferano. Un numero di cellule figlie muore precocemente (26), mentre altre si differenziano morfologicamente, biochimicamente e funzionalmente in neuroni maturi dei granuli (27).
Shors et al. (30, 31) hanno recentemente dimostrato che i nuovi neuroni dei granuli sono necessari per un certo tipo di APPR ippocampo-dipendente (trace fear conditioning).
Affinché le cellule neonate possano essere coinvolte nei processi di APPR, esse devono essere salvate dalla morte e devono diventare parte di networks funzionali.
L'U.O. di Urbino ha dimostrato che APPR ippocampo-dipendente (32) aumenta la sopravvivenza delle cellule neonate negli stadi precoci di differenziamento, mentre APPR induce la morte cellulare se viene eseguito nella seconda settimana dopo la mitosi, quando il periodo di morte naturale delle cellule si è concluso. Ciò porterebbe a sopravvivenza dei neuroni molto immaturi e a morte dei neuroni meno immaturi. Pertanto, in questa ricerca, sarà studiato l'input sinaptico su cellule neonate in via di differenziamento. Inoltre, sarà indagato il ruolo delle sinapsi sui neuroni immaturi nella forma di APPR neurogenesi-dipendente (trace fear conditioning), in collaborazione con l'U.O. di Firenze.
I peptidi attivanti l'adenilato ciclasi pituitaria, come il PACAP, influenzano la sopravvivenza e il differenziamento neuronale (33). Il PACAP migliora l'APPR della risposta di evitamento passivo a bassi dosaggi (14) ed aumenta l'LTP nelle cellule dei granuli del giro dentato (36). Pertanto, il PACAP potrebbe aumentare anche la neurogenesi nell'ippocampo adulto migliorando così l'APPR neurogenesi-dipendente.
Eventi come la LTP o la Long Term Depression (LTD) coinvolgono varie protein chinasi (PKA, PKC, CAMKII) e MAPKs (in particolare ERK1/2). Mentre CAMKII partecipano alle fasi precoci della memorizzazione, le MAPKs sembrano implicate nel passaggio da MEM BT a MEM LT.
Roberson e Sweatt (37) propongono che la MEM si basi su reazioni che stabilizzano il turnover cellulare. Queste reazioni mnemogeniche possono coinvolgere anche la proteina prionica cellulare (PrPc). In accordo con questa ipotesi, la forma infettiva del prione (scrapie o PrPsc) possiede la capacità di trasformare la controparte fisiologica PrPc attraverso la reazione: PrPc + PrPsc à 2PrPsc, che ha la forma tipica di una reazione mnemogenica. Interessanti reazioni affini a questa, nel lievito, trasmettono informazioni da una cellula ad un'altra.
a) Nel cervello, la PrPsc tende a formare aggregati ad alto peso molecolare (placche) associate principalmente alla BSE (bovine spongiform encephalopathy, encefalite spongiforme bovina) e parzialmente alla sindrome di Creutzfeldt-Jacob. In tutti questi casi le prime alterazioni anatomo-funzionali appaiono nell'ippocampo. Un fenotipo per i topi Prnp0/0 consiste nella riduzione della "after-hyperpolarization" lenta, evocata da treni di impulsi di potenziali d'azione (39). Vi sono dati che indicano un coinvolgimento di PrPc nella trasmissione sinaptica e nel mantenimento della MEM LT nei neuroni ippocampali (40, 41).
b) la PrPsc reagisce con la forma cellulare della proteina prionica (PrPc) privando i neuroni di un segnale connesso alla sopravvivenza (40;42;43). Più evidenze sperimentali suggeriscono che la perdita delle funzioni della PrPc causata dalla presenza della PrPsc, possa essere la causa principale delle malattie prioniche (40). Abbiamo proposto che una delle principali funzioni della PrPc, almeno nelle cellule dove i geni della caveolina sono espressi e dove si possono formare le caveole, sia di associarsi alla cav-1 e di reclutare Fyn (43). La probabile interazione tra la PrPc e la caveolina-1(cav-1), è possibile solo quando il rame è legato agli octarepeats N-terminali; altrimenti in assenza di rame, il crosslinking della PrPc potrebbe causare una massiva endocitosi favorendo per esempio apoptosi neuronale (39). La nostra ipotesi di lavoro è che in assenza di rame la PrPc rimanga localizzata nei rafts della membrana senza partecipare alla trasduzione del segnale e sia pronta a reagire con la PrPsc, causando una sindrome da perdita di funzione (vedi sopra). La proiezione di questi esperimenti potrebbe anche riverberarsi verso lo studio della sindrome di Alzheimer.
In molti organismi, l'RNA a doppia elica regola il silenziamento genico post-trascrizionale, definito anche RNA interference (34). L' esistenza di piccoli RNA interferenti (siRNA) fu scoperta inizialmente in C.elegans (35). L'introduzione di brevi duplex sintetici di RNA (21-23 nt.) all'interno di cellule di mammifero, ha una funzione specifica di silenziamento genico. Questi siRNA possono rappresentare uno strumento efficace per lo studio del ruolo di geni specifici nel funzionamento neuronale. <<<