RICERCA ITALIANA     

INGEGNERIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI METALLOPROTEINE IN SOLUZIONE ED IMMOBILIZZATE SU SUPERFICI

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Il presente progetto è finalizzato a produrre varianti di citocromi della classe c e del citocromo P450 allo scopo di ottenere (i) una migliore comprensione dei meccanismi che controllano il folding di metalloproteine attraverso lo studio di intermedi conformazionali, e (ii) una ottimizzazione del processo di immobilizzazione di questi biosistemi su superfici solide o sol-gel, mostrando i citocromi interessanti potenzialità d'impiego in area biosensoristica.
(i) Studi di folding hanno mostrato che il processo di ripiegamento delle proteine nella loro forma nativa avviene in più stadi, con formazione di pochi intermedi caratterizzati da brevissimo tempo di vita. Una valida alternativa agli studi di cinetica rapida, è lo studio all'equilibrio di mutanti stabili come modelli di specie transienti. Le metalloproteine che verranno studiate in questo progetto sono i citocromi di lievito, equino, e il P450, nelle loro varianti.
Citocromi della classe c - Studi recenti (Sinibaldi et al. (2003) Biochemistry 42, 7604-7610) hanno mostrato che la mutazione sito-specifica H26Y induce nel cyt c di lievito (iso-1-cyt c) la formazione del molten globule a pH neutro, con spiazzamento della M80 dalla sesta posizione di coordinazione del Fe-eme ad opera di una lisina. Ciò ha indotto ad ipotizzare un ruolo importante di questo residuo per la stabilizzazione della proteina nativa. Si intende dunque produrre i seguenti mutanti: H26Y/H33Y, H26Y/H39K, H33Y/H39K, H26Y/H33Y/H39K e H26Y/M80A dell'iso-1-cyt c, che permetteranno di determinare il ruolo di ciascuna istidina sulla struttura e la funzionalità della proteina, e la capacità della macromolecola a ripiegare in una forma compatta anche in assenza di due residui invarianti quali la H26 e la M80. Lo studio di questi mutanti fornirà informazioni su: (i) il ruolo di singoli residui nel modulare le proprietà strutturali e funzionali della proteina, (ii) la transizione alcalina dell'iso-1-cyt c.
I mutanti multisito che saranno ottenuti dal cyt c equino saranno studiati anche come analoghi del derivato umano (che si differenzia dall'equino per soli 11 residui) le cui proprietà sono ancora poco conosciute. I citocromi c e le loro varianti verranno studiati sia in soluzione che immobilizzati in vetri sol-gel.
Citocromo P450 BM3 (P450 BM3) - Il cyt P450 BM3, studiato nel presente progetto, è una monoossigenasi degli acidi grassi, solubile e cataliticamente autosufficiente, isolata da B. megaterium. Esso è composto da tre dominii fusi nella stessa catena polipeptidica di 1048 residui. Nonostante la sua origine batterica, il P450 BM3 è stato classificato come enzima P450 di classe II, tipica dei P450 microsomiali degli eucarioti. Di questa proteina e delle sue varianti verrà studiato il processo di folding/unfolding, nonchè la relazione struttura-funzione.
(ii) le varianti verranno studiate anche nella prospettiva di loro applicazioni in area biotecnologica. E' in fase di progettazione la costruzione di un biosensore elettrochimico in grado di rivelare la presenza di specie inquinanti.dal momento che il cyt P450 può attaccare frazioni aromatiche ed alifatiche di inquinanti. L'ingegneria proteica si muoverà su due fronti: (a) ingegnerizzazione di nuove specificità di substrato; (b) ingegnerizzazione delle proprietà di superficie per l'ancoraggio a superfici di elettrodi.
In parallelo saranno studiate nuove molecole sintetiche. In particolare, saranno sviluppate molecole con strutture a sandwich "helix-heme-helix", denominati Mimochromes. Queste molecole sono sistemi semplici, strutturalmente definiti, ottimi modelli minimali della tasca dell'eme che contribuiranno a chiarire meglio aspetti strutturali e funzionali dei sistemi naturali nativi o varianti, tra i quali il comportamento redox. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Roberto SANTUCCI Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto è finalizzato a produrre varianti di citocromi della classe c e del citocromo P450 allo scopo di ottenere (i) una migliore comprensione dei meccanismi che controllano il folding di metalloproteine attraverso la caratterizzazione di intermedi conformazionali ottenuti mutando residui ritenuti importanti per la stabilità della forma nativa, e (ii) una ottimizzazione del processo di immobilizzazione di questi biosistemi su superfici solide (che mimano la superficie elettrodica) o sol-gel, mostrando i citocromi interessanti potenzialità d'impiego in area biosensoristica.
(i) Studi di folding hanno mostrato che il processo di ripiegamento delle proteine nella loro forma nativa avviene in più stadi, con formazione di intermedi caratterizzati da brevissimo tempo di vita (transienti); ciò rende difficoltoso lo studio di questi transienti per via cinetica. Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano il processo di folding può essere ottenuta attraverso lo studio all'equilibrio di mutanti stabili con conformazione intermedia tra la nativa e la denaturata; in molti casi, questi sistemi rappresentano dei validi modelli di specie transienti. Le metalloproteine che verranno studiate sono i citocromi equino, di lievito, e il P450, nelle loro varianti. Le proprietà dei due citocromi della classe c sono ben note; molto meno conosciute sono le proprietà degli intermedi transienti che si formano nel processo di folding. E' stato osservato che la mutazione sito-specifica H26Y induce nel cyt c di lievito (iso-1-cyt c) la formazione del molten globule a pH neutro, con spiazzamento della M80 dalla sesta posizione di coordinazione del Fe-eme ad opera di una lisina. Ciò ha indotto ad ipotizzare un ruolo importante di questo residuo (invariante) per la stabilità della proteina nativa. Si intende qui produrre i mutanti H26Y/H33Y, H26Y/H39K, H33Y/H39K, ciascuno dei quali contiene una sola delle tre istidine non legate al metallo nella forma nativa (H26,H33,H39), allo scopo di studiare l'effetto di ciascuna istidina sulla struttura e la funzionalità della proteina. Si intende ottenere anche il mutante H26Y/H33Y/H39K che manca, rispetto alla forma nativa, delle tre istidine sopra citate. Lo scopo è osservare il tipo di transizioni conformazionali che interessano la struttura terziaria della proteina, e l'influenza sulle proprietà funzionali (come il potenziale redox). Si intende ottenere il doppio mutante H26Y/M80A (la M80 è un ligande assiale del ferro-eme nella proteina nativa) per osservare se questa variante mostra, con un residuo misligato alla sesta posizione di coordinazione del ferro, una struttura compatta. Sarà anche possibile stabilire se il conformero alcalino della proteina può stabilizzarsi a pH neutro. Attualmente è in nostro possesso il plasmide del citocromo c equino, che si differenzia nella struttura primaria da quello umano, per soli 11 residui. Questo permetterà, attraverso opportune mutazioni effettuate sulla proteina equina ricombinante, studi sul derivato umano, ancora poco investigato. I citocromi c e le loro varianti verranno studiati sia in soluzione che immobilizzati in vetri sol-gel. Dagli studi in sol-gel si otterranno informazioni sull'effetto indotto dalla matrice vetrosa sulla struttura e stabilità delle proteine e delle varianti studiate.
Il citocromo P450 BM3 (P450 BM3), studiato nel presente progetto, è una monoossigenasi degli acidi grassi, solubile e cataliticamente autosufficiente, isolata da B. megaterium. E' particolarmente interessante poiché composto da tre dominii: un dominio FAD, uno FMN ed un dominio eme (chiamato BMP), fusi nella stessa catena polipeptidica di 1048 residui. Inoltre, nonostante la sua origine batterica, P450 BM3 è stato classificato come enzima P450 di classe II, tipica dei P450 microsomiali degli eucarioti. Condivide 30% di identità di sequenza con con la idrossilasi microsomiale degli acidi grassi, 35% di identità di sequenza con la reduttasi NADPH:P450 microsomiale, e solo il 20% di omologia con altri P450 batterici. Queste caratteristiche hanno suggerito l'uso di P450 BM3 come surrogato per i P450 di mammifero. Di questa proteina e delle sue varianti verrà studiato il processo di folding/unfolding, nonchè la relazione struttura-funzione.
(ii) le varianti verranno caratterizzate anche nella prospettiva di una loro utilizzazione in area biotecnologica. Si intende infatti progettare biosensori da utilizzare in campo clinico e ambientale. Nel caso del citocromo P450, si è osservato che questa proteina è in grado di attaccare frazioni aromatiche ed alifatiche di inquinanti prelevati in siti industriali contaminati. E' in fase di progettazione la costruzione di un biosensore elettrochimico in grado di rivelare la presenza di specie inquinanti. Nello studio del citocromo P450, l'ingegneria proteica si muoverà su due fronti: (a) ingegnerizzazione di nuove specificità di substrato; (b) ingegnerizzazione delle proprietà di superficie per l'ancoraggio a superfici di elettrodi. Punto (a) - Le mutazioni saranno indirizzate alle regioni coinvolte nel legame con il substrato: il loop F-G, l'elica B' e, in parte, l'elica I. Numerosi mutanti sono già stati ottenuti nel laboratorio dell'UO di Torino per direct evolution e si sono dimostrati in grado di attaccare composti poliaromatici e policlorurati. Punto (b) - L'ingegnerizzazione delle proprietà di superficie per l'ancoraggio a superfici di elettrodi verrà ottenuta tramite rational design sulla base delle strutture 3D esistenti del dominio eme, e tramite mutagenesi sito specifica. Gli studi elettrochimici saranno effettuati sul dominio eme del P450 BM3 (definito BMP) e la flavodossina (FLD), da noi scelti come moduli per generare assemblaggi elettrochimicamente attivi. Verranno ingegnerizzati mutanti con singole cisteine sulla superficie, allo scopo di fornire punti di attacco diretto o indiretto agli elettrodi. Due residui esposti sulla superficie della FLD, in particolare S35 e S64, sono già stati separatamente mutati in cisteine. Il legame su superfici d'oro di mutanti con cisteina unica della FLD, soli o in combinazione con BMP-FLD, e l'effetto dell'orientazione sulle velocità di trasferimento elettronico verranno studiati mediante voltammetria ciclica; la flessibilità e l'accessibilità dei centri redox verranno invece affrontati posizionando le cisteine in differenti parti dell'assemblaggio. Delle proteine immobilizzate, verranno esaminate, tra l'altro, le proprietà morfologiche e spettroscopiche.
Al fine di dare un contributo alla comprensione a livello atomico delle forze responsabili della stabilità e/o del folding delle metallo-proteine naturali, in parallelo saranno studiate nuove molecole sintetiche. Saranno sviluppate molecole con strutture a sandwich "helix-heme-helix", denominati Mimochromes. Queste molecole sono sistemi semplici, strutturalmente definiti, che risultano adatti a valutare come variazioni nelle cariche, polarità e nell'accessibilità del solvente all'eme influenzino le proprietà del gruppo prostetico. Lo studio di questi sistemi, modelli minimali della tasca dell'eme, (il cui sito attivo è strettamente correlato ai citocromi studiati nell'ambito di questo progetto) contribuirà a chiarire meglio aspetti strutturali e funzionali dei sistemi naturali, tra i quali il comportamento redox. Ad esempio, usando la struttura dei modelli Mimochrome, sarà possibile analizzare le proprietà di differenti sistemi al variare dei leganti assiali dell'eme. In particolare, la sostituzione di una istidina coordinante con una lisina sarà in grado di fornire informazioni sulla conformazione della tasca dell'eme in intermedi strutturali dei citocromi di classe c, essendo stata rivelata, da esperimenti di cinetica rapida, l'esistenza di intermedi di folding con coordinazione non-nativa. <<<

Risultati parziali attesi

A) Produzione di proteine
Cyt c di lievito. (UO di Roma). Ottenimento dei doppi mutanti H26Y/H33Y, H26Y/H39K, H33Y/H39K, H26Y/M80A ed del triplo mutante H26Y/H33Y/H39K.
Cyt P450 BM3. (UO di Torino). Ottenimento di mutanti random selezionati con tecniche di direct evolution . I seguenti mutanti sono già disponibili in forma attiva: variante A2 (D251G, Q307H), variante P2 derivato da A2 (N192I, P193E, D194T, D195T, D208R, D251G, I254K, Q307H, K312T, G315R, M316V, V317G), variante M3 derivato da A2 (K210R, A225Q, S226A, D251G, S270E, Q307H), variante K4 derivata da M3 (V317C). Come si può vedere, cicli successivi di evoluzione diretta determinano mutazioni superflue mantenendo solo quelle che conferiscono un'attività selezionata.

B) Studi spettroscopici e funzionali.
Mutanti di citocromo c di lievito in soluzione:
- caratterizzazione spettroscopica e di dinamica molecolare simulata
- valutazione del ruolo delle istidine nella stabilizzazione della forma nativa
- caratterizzazione di eventuali fenomeni di parziale unfolding
- ruolo delle singole istidine nella transizione alcalina
- caratterizzazione strutturale a vari pH
- caratterizzazione delle proprietà redox.
Mutanti del citocromo P450:
- caratterizzazione spettroscopica e di dinamica molecolare simulata
- effetto delle mutazioni sulla struttura
- caratterizzazione delle proprietà redox

C) Sviluppo di emoproteine miniaturizzate e caratterizzazione con metodi teorici e sperimentali:
- Progettazione molecolare al computer di 4 eme-proteine miniaturizzate. Sintesi delle stesse,
purificazione, analisi.
- Studio delle proprietà spettrali (UV e CD)
- Caratterizzazione delle proprietà redox.A) Studi su proteine immobilizzate in gel di silice.
- confronto tra le proprietà spettroscopiche delle proteine in soluzione ed immobilizzate
- confronto della stabilità delle varianti in soluzione e immobilizzate
- variazioni della velocità di unfolding/refolding in soluzione e in vetri sol-gel
- caratterizzazione della topologia mediante AFM, e relativa modellizzazione mediante MD
B) Studi su film proteici adsorbiti
- confronto del segnale di voltammetria ciclica ottenuto con diverse condizioni adsorbimento;
- confronto dei segnali di corrente catalitica ottenuti con diversi substrati e selezione delle migliori condizioni;
- applicazione di tecniche cronoamperometriche nelle condizioni ottimali trovate sopra;
- ottenimento delle tipiche curve corrente-substrato;
- calcolo del livello di accoppiamento segnale dalla concentrazione di prodotto liberato (tecniche LC-MS)
- caratterizzazione topologica mediante AFM e delle proprietà conduttive mediante STM ed AFM
conduttivo
C) Studi su film di proteine orientate e covalentemente legate
- confronto del segnale di voltammetria ciclica ottenuto con diversi mutanti e con diversi gruppi
spaziatori;
- confronto del segnali di corrente catalitica ottenuti con diversi substrati e selezione delle migliori condizioni;
- caratterizzazione topologica mediante AFM e delle proprietà conduttive mediante STM ed AFM conduttivo
- applicazione di tecniche cronoamperometriche nelle condizioni ottimali trovate sopra;
- calcolo della 'coverage' delle proteine sulle superficie;
- ottenimento delle tipiche curve corrente-substrato;
- calcolo del livello di accoppiamento segnale dalla concentrazione di prodotto liberato (tecniche LC-MS)
D) Ingegnerizzazione del citocromo c umano
- caratterizzazione spettroscopica a pH neutro
- caratterizzazione strutturale a vari pH
- comportamento nella transizione alcalina
- caratterizzazione delle proprietà redox.
E) Analisi strutturale di emoproteine naturali e artificiali
- Risoluzione della struttura mediante NMR di due sistemi modello.
- Risoluzione della struttura mediante NMR di mutanti del Cyt P450.
- Risoluzione della struttura mediante NMR di citocromo equino.
- Determinazione di pK di particolari gruppi di interesse, mediante metodi computazionali
- Determinazione dal punto di vista teorico di valori di chemical shift. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Negli ultimi anni, lo studio del ripiegamento (folding) proteico che segue la biosintesi ha conosciuto un enorme sviluppo. L'interesse si è focalizzato principalmente verso proteine monomeriche delle quali si conosce la struttura tridimensionale; la mioglobina ed i citocromi della classe c ne rappresentano tipici esempi (1-4). Un significativo miglioramento nelle conoscenze del processo di ripiegamento proteico è dovuto sia al drammatico sviluppo delle tecniche di cinetica rapida, che ha permesso di osservare fenomeni che avvengono nei primi attimi seguenti la biosintesi della macromolecola (5-9), sia allo studio strutturale di intermedi di equilibrio che hanno rappresentato, in molti casi, degli ottimi modelli di specie transienti che si formano prima della stabilizzazione della conformazione nativa (la conformazione favorita termodinamicamente) (10-14).
Per la gran parte delle proteine, il processo di ripiegamento avviene attraverso più stadi, alcuni dei quali sono comuni a molte proteine, mentre altri sono prettamente specifici. Gli studi effettuati hanno permesso di ottenere una descrizione piuttosto dettagliata delle variazioni strutturali che hanno luogo in piccole proteine, come la mioglobina e il citocromo c (15-18). Sulla base di questi risultati è stata ipotizzata l'esistenza di una molteplicità di percorsi nel ripiegamento proteico, che prevedono la formazione di intermedi caratterizzati da struttura terziaria fluttuante e mislegati alla sesta posizione di coordinazione dell'eme. Un contributo importante a chiarire aspetti strutturali di intermedi di folding è stato fornito dallo studio di mutanti di piccole proteine (come il citocromo c, 19-21) e del molten-globule stabilizzato dagli anioni a pH acido, chiamato stato-A (1,22-24). La più dettagliata conoscenza dei meccanismi molecolari che sono alla base del processo di ripiegamento proteico, ha sollecitato studi teorici atti a spiegare tali osservazioni (25,26) e studi su proteine intrappolate in matrici solide o sol-gel, che hanno il vantaggio di aumentare la stabilità dei biosistemi immobilizzati e di rallentare la velocità di reazione con i leganti (27,28). Attualmente, l'interesse è diretto soprattutto ad ottenere una più approfondita conoscenza dell'intero processo e a teorizzare un modello termodinamico e cinetico in grado di descrivere adeguatamente questo evento fondamentale. La caratterizzazione di sistemi all'equilibrio con struttura intermedia tra la nativa e la denaturata, rappresenta un approccio importante nella prospettiva di raggiungere un più alto grado di comprensione degli eventi che caratterizzano il processo di folding proteico. In questo contesto, l'ingenerizzazione mirata di proteine nelle loro varianti gioca un ruolo fondamentale, queste ultime rappresentando in molti casi dei validi modelli di intermedi di folding. Appare quindi evidente che i processi di folding sono basati su fenomeni estremamente complessi e sinergici nei quali convergono molteplici fattori. Inoltre, l'intriseca complessità delle strutture proteiche rappresenta uno dei maggiori ostacoli per la comprensione delle basi molecolari del folding. Un approccio complementare allo studio di questo problema è rappresentato dallo sviluppo di sistemi modello basati su polipeptidi di dimensioni ridotte. Questo tipo di approccio ha trovato particolare applicazione nel campo delle metalloproteine. Infatti, a causa delle dimensioni e della complessità delle metalloproteine, la correlazione tra struttura (inclusa la geometria di coordinazione) e altre proprietà quali lo stato di spin, il potenziale redox, ecc., risulta spesso molto ardua. E' quindi vantaggioso ricorrere a sistemi sintetici più semplici quali modelli per lo studio dei sistemi naturali. Un analogo sintetico costituisce quindi un approccio sinergico nello studio di un metalloenzima, in quanto consente la determinazione di proprietà specifiche difficilmente ricavabili da indagini sull'intera proteina. Una delle piu' interessanti caratteristiche delle metalloproteine è il meccanismo grazie al quale la matrice proteica modula il potenziale redox del centro metallico, determinando effetti micro- e macro-ambientali. Da questo punto di vista l'eme è uno degli esempi piu' interessanti. Questo gruppo prostetico è in grado di esplicare una varietà di funzioni, quali trasporto e accumulo di ossigeno, trasferimento di elettroni, idrossilazione ed ossidazione di substrati organici e la disproporzione del perossido di idrogeno, grazie alla matrice proteica che modula il potenziale redox dell'eme. Proteine e peptidi sintetici che legano l'eme ed assumono un'unica, stabile, struttura, sono stati estensivamente progettati e caratterizzati. Gli studi effettuati hanno permesso di ottenere importanti informazioni sulla relazione struttura-funzione di emoproteine (32). Gran parte dei fattori che modulano le proprietà dell'eme sono ormai conosciuti, ed è ora chiaro che piccole differenze nell'impacchettamento, nella idrofobicità, nell'accessibilità del sito e nella orientazione dei ligandi possono influenzare significativamente le caratteristiche delle emoproteine. Ciò ha permesso lo sviluppo di nuovi interessanti modelli di emoproteine (32), sebbene la specificità funzionale di tali sistemi sia ancora significativamente inferiore a quella delle proteine naturali. Una delle sfide piu' stimolanti del futuro prossimo è lo sviluppo di molecole artificiali in grado di riprodurre i complessi meccanismi che controllano le funzioni dell'eme e che sono alla base della selettività funzionale dei sistemi naturali. Questo ambizioso obiettivo potrà essere il risultato di un processo coordinato di progettazione, calcolo e rigorosa caratterizzazione strutturale.

Le conoscenze acquisite sulle proprietà di intermedi stabili di metalloproteine (ottenuti con varie modalità, tra cui l'ingegnerizzazione mirata delle stesse) sono state utilizzate da molti laboratori per scopi applicativi in area biotecnologica. Negli ultimi anni, l'interazione sempre più frequente tra la chimica dei materiali inorganici e la biochimica ha permesso lo sviluppo di tecnologie in grado di produrre nuove matrici di supporto per l'utilizzazione di macromolecole organiche in campo applicativo (vedi, per esempio, 33-35). Questi nuovi prodotti rivestono un duplice interesse scientifico di base; da un lato, il loro sviluppo è essenziale per applicazioni in campo biomedico, dall'altro esse giocano un ruolo importante nella realizzazione di biosensori e biocatalizzatori (36,37). In area biosensoristica, le metalloproteine redox sono molto utilizzate, e gli studi effettuati hanno contribuito ad approfondire in modo significativo le conoscenze sugli aspetti base della chimica redox coinvolta (per una review, vedi (38)). Negli organismi viventi, i fenomeni redox coinvolgono un trasferimento elettronico a lungo raggio tra un accettore ed un donatore, e sono descritti quantitativamente dalla teoria di Marcus (39). Le tecniche elettrochimiche hanno permesso di studiare il processo di trasferimento elettronico di tipo eterogeneo tra una proteina redox e la superficie elettrodica, di grande importanza perché coinvolge un sistema biologico come uno dei partners; in condizioni appropriate, i metodi electrochimici permettono di mimare in vitro reazioni redox che avvengono in natura. Lo studio elettrochimico di metalloproteine può essere effettuato in soluzione oppure immobilizzando il biosistema in matrici solide (polimeriche o metalliche (38)) o sol-gel (27,28). L'immobilizzazione delle proteine comporta grandi vantaggi, dal momento che evita molti dei problemi che sorgono con le proteine in soluzione (denaturazione delle stesse quando contattano l'elettrodo, la loro scarsa velocità di diffusione che produce basse correnti, la natura nascosta del sito attivo solitamente schermato dalla catena polipeptidica), attribuibili alla natura eterogenea del processo di trasferimento elettronico, e, allo stesso tempo, aumenta le potenzialità del biosensore che, attraverso la stabilizzazione della proteina intrappolata, può essere impiegato più a lungo. In questo contesto, diventa essenziale (i) lo studio sistematico dei processi che hanno luogo all'interfaccia enzima-matrice e matrice-solvente, al fine di conoscere e caratterizzare il comportamento funzionale di ciascun enzima intrappolato nel/sul supporto solido; (ii) lo studio delle proprietà topologiche, conduttive (se bloccate su superfici metalliche) e spettroscopiche delle metalloproteine immobilizzate (40-42). <<<