RICERCA ITALIANA     

RUOLO DEI LIPIDI NELLA REGOLAZIONE DI FUNZIONI CELLULARI

Università degli Studi di Perugia

Abstract

Scopo del presente progetto di ricerca è quello di studiare il ruolo dei lipidi nel controllo di funzioni cellulari e di chiarire i meccanismi implicati.
Uno degli obiettivi specifici del programma di ricerca è quello di isolare e caratterizzare una fosfolipasi A2 che viene rilasciata dai mitocondri in condizioni di deficit energetico e che potrebbe essere implicata nei processi della cascata apoptotica.
Sarà anche studiato il coinvolgimento di fosfolipidi anionici nella modulazione della apoptosi. In particolare, si studierà la funzione della cardiolipina e del fosfatidilglicerolo delle membrane mitocondriali come modulatori del controllo respiratorio e del rilascio del citocromo c dai mitocondri al citoplasma. Inoltre, si studierà il ruolo di un altro fosfolipide anionico, la fosfatidilserina, nel danno cerebrale e nella apoptosi di cellule del tessuto nervoso.
La lipido-dipendenza di eventi cellulari verrà anche esaminata da un altro punto di vista, studiando il ruolo dei lipidi della dieta come modulatori della espressione di geni lipogenici. In particolare, si studierà la modulazione di fattori di trascrizione implicati nella espressione di geni lipogenci da parte dell'acido alfa-linolenico e sulla attività di fattori di trascrizione coinvolti nella sintesi delle apolipoproteine plasmatiche.
Verrà anche studiato un ulteriore ruolo dell'acido alfa-linolenico, come modulatore della espressione e della attività della COX-2 <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Luciano BINAGLIA Università degli Studi di PERUGIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il gruppo proponente la presente ricerca si è interessato nel passato a molteplici aspetti del metabolismo lipidico, con il principale obiettivo di definire il ruolo di enzimi coinvolti nei processi di biosintesi e rinnovo dei fosfolipidi di membrana nel sistema nervoso centrale.
Più recentemente, gli interessi di ricerca dello stesso gruppo si sono rivolti alla definizione del ruolo dei lipidi nel controllo di molteplici funzioni cellulari.
Obiettivo comune della ricerca proposta è identificare e descrivere tali meccanismi di controllo da parte di componenti lipidici della cellula o di molecole lipidiche assunte con l'alimentazione.
Il gruppo è strutturato in quattro laboratori autonomi, ciascuno dei quali, nello stesso ambito, è rivolto allo studio di un tema specifico.
La cascata di eventi biochimici che porta alla sintesi di eicosanoidi è oggetto di studio in due laboratori. Il primo è soprattutto impegnato in una ricerca sulla identificazione e sulla localizzazione intracellulare delle fosfolipasi A2, con particolare riferimento ad una forma isoenzimatica dagli stessi ricercatori evidenziata nei mitocondri delle cellule nervose. L'interesse a questa isoforma mitocondriale della fosfolipasi A2 deriva dal suo apparente coinvolgimento nei processi connessi con cascate apoptotiche. Dell'enzima è in corso la purificazione, allo scopo di determinarne la struttura.
L'attività di ricerca del secondo laboratorio è rivolta allo studio del peculiare ruolo dell'acido alfa-linolenico come modulatore della sintesi di prostaglandina PGE2. Da evidenze preliminari appare infatti che l'acido alfa-linolenico interferisce nel meccanismo di conversione dell'acido arachidonico a PGE2 agendo a due distinti livelli: competendo per le desaturasi e le elongasi con l'acido linoleico e deprimendo l'espressione di C/EBPbeta e del suo gene target COX-2.
Gli altri due laboratori sono impegnati nel definire specifici ruoli dei fosfolipidi acidi nella modulazione della risposta cellulare a stimoli di diversa natura.
In uno dei due gruppi viene studiata la funzione della cardiolipina e del fosfatidilglicerolo contenuti nelle membrane mitocondriali relativa al controllo dell'attività respiratoria e nella regolazione del rilascio nel citoplasma del citocromo c, con la conseguente attivazione della catena di processi che conducono alla morte cellulare programmata.
Il secondo gruppo studierà il metabolismo della fosfatidilserina, con particolare attenzione agli enzimi preposti alla sua sintesi, in relazione alla apoptosi, nella quale questa viene esposta sulla superficie esterna cellulare, ed allo sviluppo del danno cerebrale.
Obiettivo non secondario della ricerca proposta è quello di definire il ruolo dell'acido alfa-linolenico nel controllo della espressione di geni lipogenici nel fegato e nella modulazione del processo di sintesi delle apolipoproteine plasmatiche in un modello animale di iperinsulinemia. <<<

Risultati parziali attesi

Lab. A.
In questa fase ci si aspetta di caratterizzare le isoforme di PLA2 secretorie presenti nelle linee cellulari PC-12, U251 e BV-2 sia per quanto riguarda la loro identità, le loro proprietà e la loro localizzazione subcellulare in condizioni normali di coltura. A causa delle diverse funzioni delle cellule considerate (neuroni, astroglia e microglia), di cui le linee utilizzate nei nostri esperimenti possono essere considerate dei modelli attendibili, è prevedibile una differente espressione delle PLA2 secretorie soprattutto quando le cellule saranno sottoposte alle stimolazioni indicate nel programma. In particolare, l'esposizione delle cellule gliali a citochine e LPS dovrebbero mostrare un'aumentata espressione sia della sPLA2-IIA che della sPLA2-V sebbene in differenti comparti cellulari. Parallelamente, si dovrebbe osservare anche rilascio di queste isoforme nel mezzo extracellulare. Per quanto riguarda le PC-12, che sono un modello di cellule neuronali, ci aspetta che la stimolazione con NGF causi una traslocazione degli enzimi da comparti citoplasmatici verso la membrana plasmatica. Se i risultati confermeranno la nostra ipotesi si aggiungeranno delle importanti informazioni per comprendere il ruolo delle varie isoforme di PLA2 nel tessuto nervoso.

Lab. B.
Valutazione della apoptosi attraverso la misura della frammentazione del DNA, dopo trattamento delle cellule GL15 con IL-1beta e palmitato.
Identificazione e quantificazione, tramite HPLC/MS, della cardiolipina sintetizzata nelle cellule GL15 durante il processo apoptotico.

Lab. C.
I risultati attesi in questa prima fase permetteranno di stabilire se l'ipossia sperimentale stimoli in corteccia cerebrale di ratto non solo la sintesi di PS cellulare totale, come già dimostrato in studi precedenti nello stesso laboratorio, ma anche l'attività di SBEE localizzato nelle PM. In caso affermativo, si avranno anche informazioni atte a stabilire se ciò sia dovuto ad alterazioni a livello del meccanismo regolatorio proteina G dipendente (la cui esistenza è stata già dimostrata nello stesso laboratorio in PM di corteccia normale) o all'effetto stimolatorio esercitato dagli acidi grassi liberati dalle fosfolipasi. Se i risultati dimostreranno la presenza di SBEE anche nei lipid rafts da corteccia cerebrale, come già dimostrato in studi preliminari nel cervelletto, ciò indicherà che l'enzima è, almeno nel cervello, costituente di questi microdomini considerati piattaforme di segnalazione molecolare. Si aprirà quindi la possibilità di studiarne nella seconda fase le proprietà. Per quanto riguarda i macrofagi e la variazione nella sintesi di PS, precedentemente osservata quando vengono indotti all'apoptosi da GBS, i risultati stabiliranno se si tratti effettivamente di una diminuzione di sintesi, cosa che rappresenterebbe una peculiarità rispetto agli altri tipi di apoptosi, o non, piuttosto, di una maggiore degradazione della PS neosintetizzata.

Lab. D.
Ci si attende l'identificazione della sequenza del promotore responsabile del controllo della trascrizione di COX-2 da parte di ALA nelle cellule di epatoma.
Dai saggi EMSA e "supershift" si otterranno informazioni sulla natura dei dimeri di C/EBP coinvolti nello stesso meccanismo.Lab. A.
In questa fase si dimostrerà l'identità della sPLA2 mitocondriale che viene liberata, in vitro, in condizioni di deficit energetico. Infatti, la sua identificazione si è basata sulle proprietà biochimiche e sul fatto che la proteina è riconosciuta da un anticorpo monoclonale che riconosce la sPLA2 ricombinante da fegato di ratto. Mentre è noto che l'anticorpo non riconosce la sPLA2-V, non si hanno informazioni se esso immunoreagisca con altre sPLA2 di gruppo II (IIC, IID, IIE e IIF) di recente identificazione e di cui è nota la sequenza. La parziale purificazione dell'enzima rilasciato dai mitocondri e la determinazione della sequenza ci permetterà di stabilire la sua identità.
Si otterranno indicazioni se esiste una correlazione tra liberazione di sPLA2 mitocondriale e rilascio di fattori apoptotici. Il dosaggio di PGE2 e 15d-PGJ2 nel lisato di cellule gliali, stimolate con LPS o TNF-alfa ci permetterà di verificare se esiste una correlazione tra attivazione di PLA2, espressione di COX-2, fosforilazione di PPAR-gamma, crescita e morte cellulare.

Lab. B.
Correlare la diminuita sintesi della cardiolipina con lo stato energetico del mitocondrio, con il rilascio del citocromo c e l'attivazione di attività caspasiche.

Lab. C.
Dai risultati ottenuti ci si aspetta di ottenere informazioni sulle cause per le quali lo stesso stimolo possa determinare stimolazione o inibizione nella sintesi di PS, in tipi cellulari diversi. Nel caso delle differenze precedentemente osservate nello stesso laboratorio tra cervelletto e corteccia cerebrale rispetto all'ipossia, una risposta potrà venire se queste esprimeranno in modo diverso le due isoforme di PS sintasi per le quali esiste la possibilità di misurare i livelli di mRNA. Infatti la corteccia potrebbe esprimere la isoforma che viene stimolata, mentre nel cervelletto prevarrebbe l'effetto inibitorio esercitato dall'attivazione degli mGluR1, già dimostrata nello stesso laboratorio, dovuta al rilascio di glutammato. Anche per quanto riguarda la risposta all'apoptosi, si potrà stabilire se nei macrofagi è assente l'attività della isoforme di SBEE capace di utilizzare anche etanolamina, quella cioè che studi precedenti nello stesso laboratorio hanno dimostrato essere responsabile della stimolazione di sintesi di PS in timociti apoptotici. Infine, si potrà stabilire, se i risultati della fase 1 ne dimostreranno l'esistenza, se SBEE presente nei lipid rafts di corteccia cerebrale di ratto è regolato con meccanismo proteina G dipendente. Ciò, assieme alla eventuale dimostrazione della presenza di SBEE anche nei lipid rafts da macrofagi, nei quali questi assumono le caratteristiche di caveolae, indicherà fortemente che l'enzima è implicato nella trasduzione dei segnali e nella apoptosi.

Lab. D.
Sarà definito l'effetto di ALA alimentare sulla espressione di geni lipogenici, colesterogenici e codificanti proteine implicate nella ossidazione degli acidi grassi nel fegato, in condizioni di iperinsulinemia. Sarà anche definito l'effetto dello stesso acido grasso sull'attività di HNF-4alfa e sul controllo della produzione di apolipoproteine plasmatiche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

FOSFOLIPASI A2 E MODULAZIONE DI FUNZIONI CELLULARI
Le PLA2 costituiscono una superfamiglia nella quale si distinguono: sPLA2, cPLA2, iPLA2 e PAF-AH (1). Alla prima famiglia appartengono enzimi a basso peso molecolare che possono essere secreti e che hanno attività massimale con Ca2+ mM. Le cPLA2 sono enzimi a peso molecolare più elevato (60-110 kDa) che, sebbene presenti principalmente nel citosol, possono traslocare nelle membrane e sono massimamente attivi a concentrazioni di Ca2+ microM. Le iPLA2 sono citosoliche e non richiedono Ca2+ per la loro attività. Le PAF-acetilidrolasi (PAF-AH) idrolizzano il PAF contribuendo alla regolazione dei suoi livelli intra- ed extra-cellulari. Ciascuna di queste famiglie contiene diverse isoforme (2).
Le varie isoforme di PLA2 sono implicate in molti processi fisiologici o patologici, come il rimodellamento dei fosfolipidi di membrana, la rimozione di acidi grassi ossidati, la segnalazione intra ed extracellulare, l'infiammazione e la riparazione tessutale (3).
L'espressione di sPLA2-IIA può essere indotta da citochine (4) e viene spesso accompagnata da variazioni nell'espressione di COX-2 e dalla produzione di prostaglandine (PGs). Queste proprietà hanno portato a considerare l'enzima come un fattore importante nei processi infiammatori. Meno note e contrastanti sono le evidenze per un ruolo delle sPLA2 nei processi proliferativi e nella morte cellulare.
La localizzazione subcellulare ed il ruolo intracellulare delle sPLA2 sono ancora oggetto d'ampia discussione. La presenza di sPLA2-IIA è stata anche riportata in mitocondri (5) e in quelli cerebrali di ratto (Macchioni et al., inviato per la pubblicazione) viene rilasciata con un meccanismo non noto, come conseguenza di una caduta del potenziale di membrana. Ipotesi contrastanti sono state suggerite sul ruolo svolto dalle sPLA2 in vari modelli sperimentali di apoptosi e non è chiaro se i mitocondri siano la fonte o il bersaglio della sPLA2 (6). Non è inoltre stabilito se la PLA2 mitocondriale sia responsabile del rilascio dai mitocondri di segnali pro-apoptotici.
Il loro ruolo individuale delle PLA2 cerebrali non è stato definito a causa della presenza di enzimi appartenenti ai diversi gruppi (cPLA2a, iPLA2, sPLA2-IIA e sPLA2-V e PAF-AH) e alla complessità dello stesso tessuto nervoso che presenta una complicata rete di interrelazioni cellulari. La sopravvivenza delle cellule nervose dipende in buona misura da quelle gliali che esercitano un'azione protettiva ma che possono sviluppare azioni neurotossiche. In colture primarie di astrociti non sottoposte a stimoli, sono presenti mRNA sia per cPLA2 che per sPLA2-IIA ma quest'ultima è espressa solo nelle cellule stimolate con LPS ed in buona parte liberata nello spazio extracellulare (7). Il fatto che gli astrociti esprimano PLA2 a seguito di stimoli esterni, fa di queste cellule un modello interessante per studiare l'espressione di questi enzimi, la regolazione delle loro attività e possibilmente le loro funzioni.
Il rilascio di proteine apoptogeniche dal mitocondrio al citosol, che avviene con meccanismo ancora non noto, contribuisce ad aggravare il danno cellulare. Alterazioni metaboliche e funzionali della componente lipidica delle membrane mitocondriali potrebbero essere implicate in questi processi. L'attivazione della PLA2, dovuta ad accumulo di Ca2+ nel mitocondrio, causa un aumento della permeabilità della membrana interna, una caduta del potenziale di membrana e ilblocco della produzione di ATP (8).

RUOLO DEI FOSFOLIPIDI ANIONICI MITOCONDRIALI NELLA APOPTOSI DI CELLULE G15 DERIVATE DA GLIOBLASTOMI UMANI
I mitocondri rivestono un ruolo rilevante nella compartimentazione dei segnali biochimici che regolano la morte cellulare. Il rilascio di citocromo c (cit c) dai mitocondri promuove a valle processi di attivazione delle caspasi (9). Alternativamente, la caspasi 8 attivata scinde BID a t-BID che causa il rilascio di cit c e di altre proteine. La cardiolipina (CL) è richiesta sia per l'ancoraggio di t-BID che di cit c.
Le GL15 sono una linea di cellule di glioblastoma che vanno incontro ad apoptosi quando esposte a IL-1beta (10). Il legame di IL-1beta con il recettore di tipo I è l'evento necessario per l'attivazione della sfingomielinasi neutra, con produzione di ceramide che inizia un processo a cascata e che conduce ad apoptosi. IL-1beta agisce sul metabolismo lipidico, attiva la fosfolipasi A2 (11) e regola l'espressione della fosfolipasi D. IL-1beta determina un concomitante aumento di ceramide e di digliceride, stimola l'attività della lisofosfatidato (liso-PA) aciltransferasi e della PA fosfoidrolasi (12, 13), partecipando, in questo modo, al rimodellamento fosfolipidico e alla regolazione del pool di PA. Poichè PA è il precursore di fosfatidilglicerolo (PG) e di CL, variazioni del pool di PA possono influenzare la sintesi di CL. E' stato dimostrato che una diminuzione di CL causa un aumento della produzione di ceramide attraverso l'attività inversa della ceramidasi mitocondriale, un enzima regolato attraverso l'interazione con CL e/o PA (14).
La biosintesi di CL ha luogo nel mitocondrio. Dopo la conversione di PA a CDP-digliceride (CDP-DAG) mediante la CDP-DAG sintasi, la fosfatidilglicerolofosfato (PGP) sintasi catalizza la formazione di PGP da CDP-DAG e sn-glicerolo-3-fosfato. PGP è quindi defosforilato a PG da una PGP fosfatasi. In ultimo, la CL sintasi catalizza il trasferimento di PA da CDP-DAG a PG per formare CL.
L'insaturazione delle catene alifatiche della CL è una caratteristica responsabile di molte delle sue proprietà e funzioni. Nei cardiomiociti l'apoptosi indotta da palmitato è in realazione con il rilascio di cit c conseguente alla diminuita sintesi di CL, poichè i precursori saturi sono substrati poco adatti per la CL sintasi (15).
Nostri esperimenti preliminari indicano che il trattamento delle cellule GL15 con IL-1beta produce una diminuzione significativa di CL e rilascio di cit c nelle cellule in apoptosi. Mentre il cit c può essere implicato nella cascata a valle, la diminuzione di CL può causare un incremento del ceramide attraverso la ceramidasi inversa mitocondriale (14), così potenziando l'effetto delle citochine sulla produzione di ceramide attraverso la sfingomielinasi mitocondriale e la fosfatidato fosfoidrolasi. Quindi il ruolo di IL-1beta sul processo apoptotico delle GL15 può essere esercitato anche attraverso un alterato metabolismo di CL.

FOSFATIDILSERINA E RISPOSTA DELLA CELLULA A STIMOLI ESTERNI
La fosfatidilserina (PS), normalmente presente sul lato citosolico della membrana plasmatica (PM), funge da ancoraggio per la PKC (16), della quale pare modulare la specificità (17). La sintesi di PS avviene nel mammifero ad opera dell'enzima (SBEE) che scambia serina con la base presente nella fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilcolina, del quale esistono almeno due isoforme, dalle proprietà ancora non definite (18). Il coinvolgimento di SBEE nella trasduzione del segnale è supportato dalla sua inibizione da parte di attivatori delle proteine G in membrane plasmatiche (PM) di corteccia cerebrale (CX)(19).
Le caratteristiche metaboliche della PS di cervello (18) sono indicative del ruolo che questa svolge in specifiche funzioni cellulari. Tra queste, sono da notare la sua relativa abbondanza in PM e vescicole sinaptiche con accumulo di acidi grassi della serie n-3 nella sostanza grigia, il legame tra PS e acido docosaesaenoico (DHA), in relazione a specifiche aree cerebrali e all'effetto di una dieta deficiente in acido linolenico (ALA).
L'ipossia sperimentale, che causa rilascio di glutammato, stimola la sintesi di PS in fettine di CX di ratto (20). Effetto opposto si osserva nel cervelletto nel quale sono abbondanti i recettori metabotropici mGluR1, poco espressi nella CX, la cui attivazione inibisce la sintesi di PS (21). Non è noto se le due aree esprimano anche isoforme diverse di SBEE. L'aumento di sintesi di PS nella CX potrebbe contribuire allo sviluppo del danno cerebrale, agendo sulla PKC, come suggerito da uno studio in vivo (22), ma anche essere dovuto a induzione di apoptosi. Infatti, l'esposizione di PS, tipica di cellule apoptotiche, è generalmente preceduta da un aumento di sintesi (23, 24) che, nei timociti, coinvolge la isoforma di SBEE (25), responsabile anche dell'effetto osservato in CX ipossica (dati non pubblicati).
Un'apparente diminuzione di sintesi di PS si osserva in macrofagi indotti all'apoptosi da streptococco del gruppo B (26). Per affermare la peculiarità di questo tipo di apoptosi va escluso però che la PS neosintetizzata sia degradata da una PLA1 specifica per la PS, descritta nelle piastrine attivate, che ha anche attività lisofosfolipasica (27) e/o il rilascio di vescicole contenenti lisoPS.
Per stabilire l'effettivo ruolo della PS nei processi sopra descritti, risulta indispensabile lo studio di SBEE presente sulle PM. Poichè inoltre risultati preliminari hanno dimostrato l'esistenza di SBEE anche nei lipid rafts, microdomini di membrana particolarmente coinvolti nella trasduzione dei segnali e nell'esposizione della PS (28, 29), interessanti informazioni potranno scaturire anche dall'uso di questa frazione di membrana.

RUOLO DELL'ACIDO ALFA-LINOLENICO DELLA DIETA
a) nella modulazione di COX-2
È stato recentemente dimostrato che supplementi di acido alfa-linolenico (ALA) nella dieta inducono una depressione della sintesi di PGE2 nell'epatocarcinoma di Morris coltivato in vivo, sia riducendo il rapporto 20:4 (n-6)/20:5 (n-3) nei lipidi del tessuto tumorale che deprimendo la trascrizion del gene che codifica COX-2 (30, 31).
L'espressione di questo gene è controllata da differenti isoforme dei fattori di trascrizione della famiglia dei C/EBP, che, a loro volta, sono tradotte dagli stessi mRNA per C/EBPalfa e C/EBPbeta (32, 33).
Studi precedentemente pubblicati (30) hanno dimostrato che una dieta arricchita con ALA, somministrata a ratti inoculati sottocute con cellule di epatocarcinoma di Morris, riduce i livelli di mRNA per C/EBPbeta nel tessuto tiumorale mentre non induce alcun effetto sull'espressione delle altre isoforme di C/EBP nelle cellule di epatocarcinoma. Il presente progetto di ricerca si propone di chiarire il ruolo dell'ALA alimentare nel controllo del processo di traduzione delle tre forme di C/EBP e nella formazione degli etero- e omo-dimeri dei fattori C/EBP che portano l'informazione al promotore di COX-2 (32, 33).

b) nel controllo degli effetti metabolici della iperinsulinemia
L'iperinsulinemia indotta da immobilizzazione, attivando l'espressione degli enzimi lipogenici epatici, è causa di un importante aumento dei livelli di lipidi e colesterolo nel sangue (34, 35). Dati preliminari ottenuti nel gruppo di ricerca proponente indicano che, arricchendo con ALA la dieta di ratti immobilizzati/iperinsulinemici, l'espressione degli stessi enzimi viene fortemente ridotta. Oltre all'interesse biochimico per la comprensione del meccanismo con cui si produce questo effetto, risulta anche importante consolidare un'evidenza da cui potenzialmente deriva un modello di trattamento non-farmacologico della sindrome metabolica conseguente al diabete di tipo II.
Obiettivo dello studio proposto è quello di indagare sul meccanismo con cui ALA modula la trascrizione e l'attività dei recettori e dei geni target che regolano l'assetto lipidico plasmatico (36) nelle condizioni di iperinsulinemia. In particolare, verranno studiati gli effetti di ALA alimentare sulla espressione dei fattori di trascrizione implicati nel controllo della lipogenesi e della colesterologenesi epatica (PPARalfa, SREBP-1c, SREBP-2 e LXRalfa), sull'espressione dei loro geni bersaglio (acido grasso sintetasi, acetil-CoA carbossilasi, stearoil-CoA desaturasi, idrossimetilglutaril-CoA sintetasi e reduttasi, acil-CoA ossidasi, carnitina-palmitoiltransferasi I) nonché sulla attività del fattore epatico HNF-4alfa (37, 38) preposto alla regolazione della sintesi delle apolipoproteine. <<<