RICERCA ITALIANA     

MATRICE EXTRACELLULARE: FENOMENI REGOLATORI, INTERAZIONI INTERMOLECOLARI E MODIFICAZIONI FUNZIONALI

Università degli Studi di Bologna

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) è una sostanza che sottende a tutti gli epiteli e gli endoteli e circonda le cellule dei tessuti connettivi, provvedendo supporto meccanico e resistenza fisica a tessuti ed organi. Oltre a funzioni meramente meccaniche, la ECM esercita profonda influenza sul comportamento cellulare (adesione, diffusione, migrazione) e su pattern di espressione genica delle cellule che sono in contatto con essa. Fra i costituenti strutturali della ECM vi sono molecole collageniche fibrillari e non, proteoglicani (PGs) e, per i connettivi elastici, fibre di elastina. Una differente composizione di questi elementi e una differente loro interazione comportano il costituirsi di tessuti diversi con differente ruolo funzionale e con differente risposta.
Il presente progetto ha l'obiettivo di analizzare "in vitro" le interazioni che piccoli proteoglicani ricchi in leucina (SLRPs) hanno con collageni fibrillari e con peptidi di sintesi od ottenuti da specifiche frammentazioni (peptidi CNBr); analizzare il comportamento e le modificazioni subite "in vivo" dall'ECM quando viene a trovarsi in condizioni funzionali di particolare interesse clinico, quali lo stretching del complesso muscolo-tendineo; analizzare l'interazione di impianti metallici con il tessuto osseo. Ci si aspetta di riscontrare modificazioni dell'ECM sotto stimoli funzionali e valutare quindi eventuali conseguenze a livello fisiologico e funzionale.
L'Unità 3 si propone di esaminare il tipo di legame che SLRPs quali la decorina (DCN), la fibromodulina (FM) ed il biglicano (BGN) possono contrarre con collageni fibrillari (I,II,III,V), con peptidi derivati dalla frammentazione specifica del collagene (peptidi CNBr) e con peptidi di sintesi. Queste osservazioni avranno ricadute nell'analisi di SLRPs estratti da tendini sottoposti e non a sollecitazioni meccaniche (stretching)
L'Unità 2 si propone di riprodurre "in vivo" su animali da esperimento (ratto) le condizioni cliniche proprie della pratica dello stretching per esaminare probabili modificazioni chimiche e strutturali del collagene fibrillare del tendine e di piccoli proteoglicani (DCN) connessi alle fibrille. Lo studio verte sull'analisi microscopica delle fibrille collagene (crimps, diametro, banding) sulla possibile neofibrillogenesi (analisi con prolina marcata), sull'esame di SLRPs estratti da tendini dopo stretching (Unità 3). Si propone inoltre di esaminare al ML, TEM e SEM,il ruolo che l'ECM ha nel favorire "in vivo" (pecora) l'adesione del tessuto osseo alle superfici implantari. Con ricerche "in vitro" viene analiazzata al ML, SEM e TEM la risposta dell'osso ospite ad impianti con differenti superfici (liscie o rugose); vengono inoltre studiate l'adesione, la proliferazione, l'attività ALPasica, la produzione di collagene di tipo I, la produzione di osteocalcina e osteoprotegerina quando osteoblasti, cellule staminali mesenchimali o cellule endoteliali sono coltivate su piastre in titanio a differenti rugosità.
L'Unità 1 è coinvolta nello studio delle interazioni proteoglicani-collagene di tendini sottoposti a stretching con tecniche di morfologia ultrastrutturale (Microscopia a forza atomica [TMAFM] e Microscopia Elettronica a Scansione ad Alta Risoluzione [HrSEM]) che permettono di risolvere singole molecole e di riconoscere i prodotti di reazione delle macromolecole della matrice con reagenti istochimici. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alessandro RUGGERI Università degli Studi di BOLOGNA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Fra le numerose funzioni attribuite alla matrice extracellulare (ECM) il ruolo di supporto fisico e resistenza per i tessuti ed organi costituisce un campo di indagine estesamente trattato dalle unità del progetto. Due in particolare sono le componenti studiate nei loro aspetti strutturali e funzionali, le fibrille collagene e i proteoglicani. Recentemente l'analisi di queste componenti è passata dall'approfondimento della loro costituzione e delle reciproche interazioni in condizioni fisiologiche verso osservazioni sui loro possibili adattamenti a condizioni biologiche differenti o a modificazioni funzionali.
Obiettivo del progetto è analizzare i limiti oltre i quali le componenti della matrice sottoposte a sollecitazioni esterne subiscano variazioni quali e quantitative e nello stesso tempo analizzare quali variazioni delle stesse componenti siano compatibili con il mantenimento di un'organizzazione fisiologica della matrice.
Sono presi in esame nel progetto l'analisi delle possibili variazioni di costituzione e di struttura di fibrille collagene proprie di tessuti fibrosi (tendini) sottoposti a stimoli funzionali al limite delle condizioni fisiologiche; l'analisi dell'influenza di superfici metalliche con differente geometria e micromorfologia sulla attività osteogenetica del tessuto osseo situato all'interfaccia ; l'analisi dell'influenza sulle interazioni di piccoli proteoglicani propri dei tessuti fibrosi con collageni fibrillari quando questi ultimi sono sottoposti a trattamenti che ne modificano dimensione o composizione (utilizzando peptidi da fonti naturali o di sintesi) e le caratteristiche chimiche (in seguito a derivatizzazioni eseguite in condizioni blande).

L'analisi riguardante risposte funzionali dei tendini viene svolta attraverso lo stretching del complesso muscolo tendineo di animali da esperimento (ratti). Vengono analizzate eventuali modificazioni qualitative e quantitative del collagene fibrillare e dei proteoglicani annessi, in condizioni di fisiologica routine e dopo stretching condotto per tempi brevi e lunghi.
Avendo come riferimento riscontri bibliografici di modificazioni della componente fibrillare e proteoglicanica di tendini sottoposti a prolungati esercizi fisici e partendo dall'osservazione che lo stretching prolungato nel tempo comporta un allungamento dell'unità muscolo-tendinea, si prevede che anche una attività di stretching comporti modificazioni strutturali. Siffatta analisi è finalizzata a prendere conoscenza di eventuali risvolti negativi conseguenti ad attività di stretching non controllate.
L'analisi di superfici metalliche con potenziali differenti influenze sull'attività osteogenetica ha come obiettivo non solo una migliore osteointegrazione all'interfaccia osso-impianto ma soprattutto l'esigenza di ridurne i tempi clinici. Ciò comporterebbe un miglioramento del rapporto costo-beneficio. Anche sulla base di precedenti esperienze personali, superfici implantari rugose influenzano positivamente il processo di osteointegrazione e fra queste ultime le superfici rugose ottenute per detrazione danno i migliori risultati. Il presente progetto è indirizzato a evidenziare i meccanismi che sono alla base di questa accelerata osteointegrazione analizzando in particolare sia la risposta "in vitro" delle cellule coinvolte nella linea osteogenetica (osteoblasti, cellule staminali ed endoteliali) sia eventuali variazioni della matrice extracellulare nel favorire l'attivazione delle cellule stesse. A fianco delle ricerche in vitro la sperimentazione "in vivo" (pecore) può contribuire attraverso riscontri morfologici ed immunoistochimici a valutare l'influenza della geometria e micromorfologia di superficie.
L'analisi delle interazioni tra collageni fibrillari e due piccoli proteoglicani di matrice (decorina e fibromodulina) si avvale di precedenti ricerche eseguite dall'Unità 3. Il modello metodologico seguito, che si è dimostrato utile, prevede la modifica delle dimensioni delle molecole di due collageni fibrillari - il tipo I ed il tipo II - mediante rottura chimica specifica, ottenendo dei peptidi a sequenza naturale le cui caratteristiche sono già state ben determinate. Prevede inoltre trattamenti che modificano le caratteristiche chimiche dei collageni e dei loro peptidi mediante derivatizzazioni chimiche eseguite in condizioni blande. Si ottengono così dei derivati anch'essi gia ben caratterizzati per diversi aspetti. Utilizzando questi due approcci è possibile analizzare con un certo dettaglio alcuni aspetti delle interazioni tra i piccoli proteoglicani citati ed i collageni, come descritto nel modello B dell'Unità 3. Utilizzando queste metodologie, gli obiettivi principali del presente progetto sono da un lato l'estensione degli studi al biglicano, un altro piccolo proteoglicano di matrice strutturalmente e funzionalmente correlato ai due già studiati sopra citati; dall'altro coinvolgere tutti e tre i piccoli proteoglicani in studi di binding con peptidi di sintesi a sequenza collagenica ed opportunamente disegnati, allo scopo di meglio caratterizzare le porzioni collageniche che legano i piccoli proteoglicani studiati e comprendere così i relativi aspetti biologici e funzionali conseguenti.
Il progetto prevede di completare lo studio delle interazioni dei piccoli proteoglicani con i collageni fibrillari utilizzando come materiale di studio tendini in condizioni fisiologiche e tendini sottoposti a stretching.
La ricerca verrà estesa alle guaine del tendine, che hanno sede anatomica simile ma diverse sollecitazioni funzionali e si avvarrà della strumentazione e delle competenze tecniche che l'Unità 1 ha maturato nella visualizzazione tridimensionale dei complessi macromolecolari. La comparazione tra tessuti sottoposti a carico tensile rispettivamente estremo, fisiologico e nullo dovrebbe portare a sviluppare un modello strutturale tridimensionale dei rapporti intermolecolari che determinano le caratteristiche biomeccaniche del tessuto, comprendente anche entità strutturali (quali le microfibrille di collagene VI) la cui presenza è accertata ma il cui ruolo funzionale è tuttora oggetto di speculazioni. <<<

Risultati parziali attesi

Dallo studio delle interazioni collageni fibrillari e piccoli proteoglicani sarà possibile caratterizzare il grado di affinità dei SLRPs da noi esaminati(DCN, FM, BGN) per collageni fibrillari e loro derivati. Il fine ultimo è quello di obiettivare e giustificare variazioni nell'interazione di queste componenti quando le condizioni metaboliche e/o funzionali siano differenti.
Dallo studio morfo-funzionale del complesso muscolo-tendineo sottoposto a stretching si prevede di individuare dopo trattamenti prolungati nel tempo variazioni qualitative e quantitative dei componenti della ECM: collagene e proteoglicani. Ciò in relazione al fatto che è dimostrato che lo stretching prolungato comporta allungamento dell'unità muscolo-tendinea e pertanto è presumibile che si verifichi un rinnovo sia qualitativo sia quantitativo delle componenti stesse, collagene e proteoglicani.
Dallo studio del rapporto matrice ossea-superfici implantari con differente rugosità si prevede di riscontrare all'interfaccia modificazioni qualitative della ECM. Queste modificazioni possono essere riscontrabili "in vitro" dall'analisi dell'adsorbimento selettivo sulla superficie di proteine della matrice e dall'analisi del diverso comportamento che osteoblasti, cellule mesenchimali e cellule endoteliali possono assumere nel loro rapporto con differenti superfici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La matrice extracellulare (ECM) è una sostanza che sottende a tutti gli epiteli e gli endoteli e circonda tutte le cellule dei tessuti connettivi, provvedendo supporto meccanico e resistenza fisica a tessuti ed organi. Oltre a funzioni meramente meccaniche, la ECM esercita profonda influenza sul comportamento cellulare (aderenza, diffusione, migrazione) e su pattern di espressione genica delle cellule che sono in contatto con essa [1].
Fra i costituenti strutturali della ECM vi sono molecole collageniche fibrillari e non, proteoglicani (PGs) e, per i connettivi elastici, fibre di elastina. Ad esse si associano, non meno importanti, molecole minori glicoproteiche ed altre molecole proteiche che concorrono a formare una rete tridimensionale che ingloba le cellule e ne influenza l'attività metabolica.
Una differente composizione di questi elementi e una differente loro interazione comportano il costituirsi di tessuti diversi con differente ruolo funzionale. Analogamente, un complesso sistema di interazioni cellula-cellula, cellula-matrice, matrice-matrice, così come la produzione di enzimi, di attivatori/inibitori enzimatici, di fattori di crescita, ecc. sono alla base del rimodellamento della ECM. In particolare, i collageni fibrillari (tipi I, II, III, V e XI) ed i proteoglicani sono componenti ubiquitari, presenti in tutti i tessuti.
Il ruolo, sia strutturale che funzionale, dei collageni fibrillari è stato oggetto di numerose ricerche ed il Laboratorio di Microscopia Elettronica dell'Istituto di Anatomia Umana Normale di Bologna, in particolare, è stato impegnato da molto tempo in ricerche morfologiche a livello ultrastrutturale sulle componenti strutturali della ECM. Sono stati esaminati il banding di collageni geneticamente distinti e le variazioni della loro organizzazione microfibrillare [2-9], le caratteristiche istochimiche ed ultrastrutturali dei PGs e le possibili interazioni fra collagene e PGs [10-16], così come anche la struttura e l'organizzazione spaziale delle fibre elastiche [17-19].
C'è un sostanziale consenso sul fatto che i collageni di tipo II e XI formano fibrille eteropolimeriche tipiche delle cartilagini, mentre i tipi I, III e V formano fibre miste ma distinte dalle precedenti e diffuse in tutti gli altri tessuti connettivi. Nei tessuti scheletrici come l'osso e il tendini le fibre sono costituite prevalentemente di tipo I, presentano una distribuzione dei diametri tipicamente multimodale e sono raccolte in spessi fasci. Al contrario, nello stroma connettivale degli organi parenchimatosi, ma anche nelle guaine dei nervi, nella cornea e nei vasi le fibrille collagene contengono maggiori quantità di tipo III e V e formano una popolazione omogenea di fibrille sottili, raccolte in fascetti flessuosi e una distribuzione dei diametri rigorosamente unimodale [20]. Anche la loro struttura interna è diversa, come è stato ripetutamente confermato dal freeze-etching [21], dalla analisi dei cross-links [22], dalla microscopia a forza atomica [23,24] e dalla microtomografia elettronica [25].
I proteoglicani, ed in particolare i piccoli proteoglicani ricchi di leucina (small leucine-rich proteoglycans, o SLRPs [26,27]) sono di norma interamente legati alla superficie delle fibrille collagene attraverso il loro core proteico e proiettano nello spazio interfibrillare le loro catene laterali, formando un reticolo tridimensionale esteso attraverso tutta la matrice. Diversi studi hanno indicato che differenti SLRPs si legano (non-covalentemente) a diverse locazioni sulle fibrille collagene [28-30]. E' stato determinato che diverse porzioni dei collageni I e II interagiscono con la decorina, e che l'interazione è annullata da N-acetilazione di residui di Lys/Hyl mentre è modulata da N-metilazione di Lys/Hyl, portando a concludere che questi residui sono direttamente interessati al legame [31]. L'interazione del core proteico con la superficie fibrillare è uno dei fattori limitanti nel processo di fibrillogenesi, ed è noto (sia in campo clinico che in modelli animali knock-out) come una alterazione di questa componente abbia evidenti ricadute sulla architettura tridimensionale della matrice. Inoltre la componente proteoglicanica cambia nel tempo, in modo caratteristico, sia in qualità delle specie presenti sia in quantità, durante la maturazione dei tessuti nel processi istogenetici. E' stato anche dimostrato il binding della decorina con TGF-beta [32] e con recettori cellulari (ad es., una interazione proteina-proteina con bassa affinità tra decorina e recettori dell'EGF.
Le interazioni molecolari della componente glicosaminoglicanica sono, nel complesso, meno note.
In contrasto con il modello di interazione prevalente [28] sono stati descritti anche modelli diversi con interazioni multiple [33-35]. Nonostante siano tuttora solo parzialmente conosciute, queste interazioni sembrano essere di grandissima importanza per il comportamento funzionale dei tessuti connettivi [35,36].
Fra gli esempi di adattamento dinamico della matrice o di risposta dell'ECM a differenti stimoli funzionali o di ordine biologico assume particolare interesse e attualità il comportamento dei tessuti tendinei e legamentosi quando sottoposti per lungo tempo a tensione o stiramento. E' stato dimostrato che lo stretching conferisce a componenti della matrice extracellulare quali i PGs la capacità di trasmettere gli stress tensori ai tendini e di opporre resistenza alla forza applicata [37]. I PGs quindi, costituendo anche uno spazio di deformazione elastica, facilitano la distribuzione del carico funzionale tra fibrille collagene adiacenti [38]. L'avvicendamento di proteoglicani quantitativamente e qualitativamente diversi nei processi di maturazione tessutale suggerisce che analoghi meccanismi siano all'opera nei processi di rimodellamento conseguenti al cambiamento di carico meccanico ad ai quali finora è stata prestata scarsa attenzione.
Un altro esempio di adattamento strutturale e funzionale della matrice connettivale a stimoli esterni è rappresentato in campo odontoiatrico e ortopedico dal differente modo di interagire del tessuto osseo con superfici metalliche (titanio) diverse per disegno geometrico e micromorfologia.
Per la maggior parte, le ricerche recenti sono state rivolte ad identificare come le proteine di matrice interagiscano con la superficie implantare inibendo o promuovendo la risposta delle cellule coinvolte nella neoosteogenesi [39]. In vivo è stato dimostrato che la rugosità di superficie degli impianti influenza positivamente il processo di osteointegrazione, evidenziabile morfologicamente con una progressiva riduzione del "gap" all'interfaccia tra osso e superficie implantare in tempi abbreviati. Si tratta di un processo che avviene attraverso la graduale sostituzione dell'iniziale coagulo del tessuto di granulazione con tessuto osteoide che evolve poi in tessuto osseo primario [40,41]. Nostri precedenti studi hanno dimostrato che superfici con differenti rugosità (micro- e macro rugosità) determinano una risposta diversa delle cellule che interagiscono con loro [42]. In considerazione della loro importanza clinica, gli impianti endossei metallici nel loro complesso sono stati oggetto di numerosi studi. Lo sforzo maggiore è stato, tuttavia, rivolto alle interazioni chimiche tra impianto e tessuto periimplantare ed alla caratterizzazione di parametri quali la osteoconduttività, la integrabilità, la biocompatibilità, o al contrario la citotossicità e la stabilità chimico-fisica nel tempo. Una molto minor attenzione è stata finora dedicata agli aspetti meccanici dell'interfaccia osso-impianto, pur essendo ovvio che i processi di integrazione o degradazione avvengono esclusivamente sulle superfici di contatto. <<<