RICERCA ITALIANA     

CANALI IONICI ATTIVATI DALL'IPERPOLARIZZAZIONE DEL POTENZIALE E REGOLATI DA NUCLEOTIDI CICLICI(CANALI HCN).

Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati di Trieste

Abstract

Lo scopo del presente progetto di ricerca è quello di chiarire le proprietà funzionali e di determinare i meccanismi molecolari dei canali ionici attivati dall'iperpolarizzazione del potenziale di membrana e regolati dai nucleotidi ciclici(CN), usualmente noti come canali HCN. Per comprendere le proprietà fisiologiche dei canali HCN ed avere una dettagliata descrizione delle basi molecolari delle loro funzioni, è necessario usare un approccio altamente interdisciplinare che in Italia può essere realizzato solo mettendo insieme laboratori diversi ma con interessi comuni. Questo progetto utilizzerà assieme alle metodologie più comunemente usate per lo studio dei canali ionici quali biochimica, biologia strutturale e molecolare ed elettrofisiologia anche approcci più teorici di bioinformatica e di fisica e chimica computazionale. Questo progetto ha i seguenti scopi specifici:
1 - Studiare a livello molecolare, la composizione in subunità e i cambiamenti conformazionali associati all'apertura e alla chiusura dei canali HCN.
2 - Sviluppare modelli molecolari dei canali HCN per studiare questi cambiamenti conformazionali associati alla apertura e chiusura dei canali e i possibili modi di interazione tra le varie isoforme dei canali HCN.
3 - Studiare la localizzazione cellulare e subcellulare delle varie isoforme per cercare di capire come sono distribuite e come sono regolati i processi di targeting e di turnover nella membrana. In questa fase cercheremo anche di stabilire la natura dei possibili interattori molecolari e i lori effetti funzionali sulla distribuzione dei canali stessi.
4 - Identificare e studiare dal punto di vista funzionale il ruolo e la modulazione di questi canali in una serie di strutture nervose
a) I neuroni olfattivi dell'epitelio e del bulbo olfattivo principale e accessorio
b) I neuroni retinici ed in particolare nelle cellule bipolari
c) I neuroni ippocampali e cerebellari
d) I neuroni oscillatori <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Vincent Aldo TORRE Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati di TRIESTE

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto di ricerca si propone di determinare i meccanismi molecolari dei canali ionici attivati dall'iperpolarizzazione del potenziale di membrana e sensibili ai nucleotidi ciclici (CN) e di chiarirne le proprietà funzionali. I canali ionici sensibili ai CN appartengono a diverse sottofamiglie di proteine correlate fra loro. I membri di una sottofamiglia, detti canali CNG, richiedono cGMP o cAMP per aprirsi ma sono anche dipendenti da voltaggio. I membri di una seconda sottofamiglia, i cosiddetti canali "pacemaker" sono attivati dalla iperpolarizzazione della membrana cellulare e sono regolati dai nucleotici ciclici. Tali canali sono chiamati HCN e sono l'oggetto di studio del presente progetto.
I canali HCN sono presenti in numerosi tessuti neuronali (Di Francesco, 1993) e hanno un ruolo fondamentale nella elaborazione dei segnali visivi della retina dei mammiferi (Gargini et al., 1999; Demontis et al., 1999, 2002). I canali CNG e HCN mediano la trasduzione sensoriale e l'elaborazione dell'informazione sensoriale nella visione e olfatto. Questi canali, sebbene appartengano alla stessa superfamiglia dei canali regolati dal voltaggio, differiscono in modo sostanziale dai canali K+, Na+ e Ca2+ a causa del loro "gating" specifico e della selettività ionica.
In questo progetto viene proposto un approccio altamente interdisciplinare per la comprensione delle proprietà fisiologiche dei canali HCN e delle basi molecolari della loro funzioni. Questo progetto utilizzerà, unitamente ai normali strumenti usati per lo studio dei canali ionici quali biochimica, biologia strutturale e molecolare ed elettrofisiologia anche gli approcci più teorici della bioinformatica e della fisica e chimica computazionale.
L'approccio interdisciplinare è necessario quando si devono studiare assemblaggi e strutture molecolari complesse come i canali ionici e si devono capire i meccanismi della loro modulazione e le loro interazioni con altre proteine.
L'Udr SISSA-Torre collabora strettamente con l'unita' di Biologia Strutturale di ELETTRA a Trieste- la sorgente di luce di sincrotrone italiana. Inoltre l'UdR SISSA-Torre collabora con Benjamin Kaupp (FZJ Julich, Germany) e Gebhard Shertler (MRC Cambridge, UK) con un progetto HFSP per lo studio delle proprietà strutturali dei canali CNG ed HCN. L'unita' SISSA-Menini è in stretta collaborazione, per lo studio dell'elaborazione dell'informazione nei sistemi olfattivi, con Peter Mombaerts (Rockefeller Univ., New York, USA) e con Stuart Firestein (Columbia Univ., New York, USA). L'unita' di Milano collabora con W. Kühlbrand (Max Plank Inst. for Biophysics, Frankfurt) e Daniel Minor (Univ. of California, San Francisco) per lo studio strutturale del canale virale "miniature K" Kcv. Per quanto rigurada direttamente il canale HCN l'unita' di Milano collabora con R. Robinson (Columbia Univ., New York) per l'assemblaggio di eterotetrameri espressi nel cuore di un mammifero. Inoltre l'UdR di Milano ha ricevuto da W. Chung (Columbia Univ., New York) una linea di topi che ha una mutazione spontanea nel gene HCN2, che risulta in un fenotipo neurologico (atassico) in topi omozigoti.
L'UdR di Pisa collabora con J. Stone, Univ. of Canberra, AU su ricerche immunoistochimiche e di microscopia confocale nella retina di mammifero.
Pertanto le risorse e competenze disponibili si estendono ben oltre le quattro UdR come richiesto dai finanziamenti COFIN. All'interno del presente progetto di ricerca COFIN ci proponiamo di ottenere nei prossimi due anni significativi progressi in tre aspetti fondamentali dei canali HCN:
-la regolazione intracellulare della loro sintesi e delle loro interazioni con altre proteine (Fase 1 del presente progetto)
-la comprensione dei meccanismi molecolari che controllano le loro funzioni (Fase 2 del presente progetto)
-la loro funzione fisiologica nel sistema nervoso periferico e centrale (Fase 3 del presente progetto).
Queste tre problematiche centrali relative alla biologia dei canali HCN verranno articolate nella realizzazione dei seguenti obiettivi specifici:
1 - identificare le isoforme dei canali HCN nei neuroni olfattivi e caratterizzarne le proprietà fisiologiche. Questo obiettivo verrà raggiunto mediante l'utilizzo di anticorpi specifici alle varie isoforme e da esperimenti di elettrofisiologia ed immunoistochimica.
2 - caratterizzare i canali HCN nei neuroni retinici ed in particolare nelle cellule bipolari e comprenderne il ruolo funzionale e fisiologico nell'elaborazione dell'informazione visiva. Anche questo obiettivo verrà raggiunto dalla combinazione di metodologie di istochimica e di elettrofisiologia.
3 - caratterizzare le proprietà biochimiche e fisiologiche dei canali HCN nell'ippocampo, nel cervelletto e nei diversi neuroni oscillatori del sistema nervoso centrale. In particolare si determinerà la distribuzione delle varie isoforme dei canali HCN con diverse tecniche di biologia molecolare.
4 - studiare il traffico intracellulare e le varie interazioni dei canali HCN all'interno dei neuroni e nei vari compartimenti intracellulari. Inoltre si analizzerà il ruolo dei canali HCN nella plasticità sinaptica e nella depressione e/o potenziamento a lungo termine.
5 - ottenere una descrizione dettagliata a livello molecolare dei cambiamenti conformazionali associati all'apertura dei canali HCN mediante esperimenti di biochimica e di elettrofisiologia con canali nativo e mutato.
6 - costruire modelli molecolari dei canali HCN, dei cambiamenti conformazionali associati alla loro apertura e chiusura ("gating" ) e delle modalita' di interazione tra le varie isoforme dei canali HCN. Questi modelli saranno basati sulle strutture molecolari dei canali HCN disponibili, come la recente struttura cristallograficha del C-linker ed il dominio che lega i nucleotidi ciclici e su modelli ottenuti per omologia da strutture note di canali simili.

L'UdR di Milano e della SISSA-Torre raccoglieranno informazioni molecolari sugli eventi strutturali su cui si basa il controllo del gating nei canali HCN, mediante esperimenti elettrofisiologici su canali ingegnerizzati. Questi dati sperimentali saranno uniti per fornire un modello preliminare di gating dei canali HCN sviluppato dalla UdR di Milano e della SISSA-Torre. L'UdR di Milano raccoglierà anche dati sul traffico intracellulare connesso ai canali HCN e sulla biologia molecolare e cellulare relativa. L'UdR di Pisa e della SISSA-Menini determineranno la composizione dei canali HCN nella retina e nei sistemi olfattivi. L'UdR di Pisa analizzerà come i canali HCN diano forma alla risposta graduale al voltaggio nelle cellule bipolari retiniche e l'UdR della SISSA-Menini analizzerà la funzione dei canali HCN nei neuroni olfattivi. Questo progetto si basa sulla pianificazione di diverse collaborazioni tra i suoi proponenti:
1 - L'UdR di Pisa, di Milano e della SISSA-Menini collaboreranno e scambieranno protocolli sperimentali di immunocitochimica per la marcatura delle subunità dei canali nella retina e nei sistemi olfattivi. In particolare l'UdR di Milano metterà a disposizione delle altre UdR anticorpi specifici per le varie isoforme dei canali HCN.
2 - l'UdR di Pisa e l'UdR di Milano hanno già pianificato esperimenti congiunti allo scopo di analizzare il ruolo e le proprietà del dominio CNB nei canali HCN2.
3 - l'UdR di Pisa e l'UdR della SISSA-Torre analizzeranno assieme le proprietà di filtraggio alto passo che originano da specifici canali HCN nei bastoncelli e nelle cellule bipolari.
4 - l'UdR della SISSA-Torre e l'UdR di Milano collaboreranno allo sviluppo di un modello di "gating" dei canali HCN.
Queste collaborazioni sono descritte in maggior dettaglio nei Moduli B.
Il progetto spazia dallo stabilire nuove basi funzionali e proprietà fisiologiche al correlare queste proprietà a specifici meccanismi molecolari. Le quattro UdR del presente progetto si incontreranno ogni 3 mesi per discutere i risultati ottenuti e pianificare nuovi esperimenti congiunti. <<<

Risultati parziali attesi

-Analisi fine della localizzazione dei vari canali HCN su cellule neuronali e sul tessuto pacemaker cardiaco
-Analisi della localizzazione subcellulare dei canali ed identificazione dei compartimenti subcellulari che sono coinvolti nel traffico intrac <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I canali ionici sono proteine di membrana che svolgono un ruolo fondamentale nella fisiologia della cellula e nella trasduzione del segnale (Hille 1992). Ioni potassio, sodio, calcio e cloro vengono usati ingegnosamente dai sistemi viventi per svolgere compiti cellulari fondamentali. Attraverso l'azione delle pompe ioniche, una grossa parte dell'energia metabolica viene utilizzata per creare i gradienti ionici transmembrana. I canali ionici sono stati studiati intensamente da un punto di vista elettrofisiologico e biochimico e la loro sequenza aminoacidica è stata determinata con tecniche di biologia molecolare. La determinazione della struttura tridimensionale (3D) del canale K (Doyle et al 1998) del batterio Streptomices lividans - chiamato il canale KcsA- ha aperto una nuova era permettendo di comprendere la relazione tra struttura e funzione dei canali ionici a livello atomico.

I CANALI HCN
Le cosiddette correnti Ih (Di Francesco 1993) che fluiscono attraverso i canali HCN, sono state scoperte nelle cellule del nodo senoatriale (Brown et al. 1979) e sono state trovate anche nei neuroni piramidali dell'ippocampo (Halliwell and Adams 1982) e nei fotorecettori (Bader et al 1979). I canali HCN sono responsabili dell'attività elettrica ritmica di molti neuroni e dei miociti del cuore. Oltre alla funzione di pace-maker i canali HCN svolgono anche altre funzioni. In molti neuroni i canali HCN co-determinano il potenziale di membrana e perciò svolgono un ruolo importante nell'integrazione del comportamento dei neuroni e nella sensibilità al segnale sinaptico (Pape 1996). I canali HCN mostrano alcune proprietà insolite. A differenza di molti altri canali dipendenti da voltaggio, i canali HCN vengono aperti dall'iperpolarizzazione piuttosto che dalla depolarizzazione. Il voltaggio a cui si ha metà della massima attivazione, (V ½) varia tra i diversi canali e tipi cellulari, ma valori compresi tra -25mV e -95mV sono tipici. I canali sono selettivi per gli ioni K+ senza avere la alta selettività degli usuali canali del K+. I canali HCN trasportano una corrente al Na+ verso l'interno che depolarizza fortemente la membrana. L'attività dei canali viene aumentata in modo diretto da cAMP e basse concentrazioni extracellulari di Cs bloccano la corrente. I canali HCN sono cugini della famiglia dei canali del K+ regolati da voltaggio e dei canali CNG. Finora sono stati identificati 4 diversi geni di mammifero e diversi geni di invertebrato (HCN1-HCN4; Gauss et al. 1998; Santoro et al. 1998; Ludwig et al. 1998; Vaccari et al., 1999). I canali probabilmente presentano sei segmenti transmembrana (S1-S6), un'ansa che costituisce il poro tra il S5 e l'S6- come i canali del K+ - e un dominio CNB nella regione C-terminale -simile ai canali CNG. La regione del poro è altamente conservata tra i deversi canali HCN. Essi condividono con i canali del K+ un motivo commune, la sequenza GYG, che è stata riconosciuta come la sequenza "firma" dei canali selettivi al K+. Il quarto segmento transmembrana (S4) dei canali HCN reca il motivo tipico del sensore di potenziale con 8-10 residui di Arg e Lys spaziati regolarmente ogni tre posizioni. Motivi di sequenze simili sono stati precedentemente identificati in molti canali voltaggio dipendenti. I canali HCN recano nella regione C-terminale un dominio di 80-100 residui aminoacidici che è altamente omologo nel dominio CNB dei canali CNG, della protein chinasi A e G e della proteina del gene dell'attivatore dei cataboliti (CAP). Il dominio CNB dei canali HCN differisce da quello dei canali CNG in poche posizioni chiave, suggerendo che quelle differenze possano determinare la selettività molto maggiore per il AMP ciclico rispetto ai canali CNG, che preferiscon il GMP ciclico. Studi recenti indicano che anche i canali HCN sono, in molti casi, eteromerici. Nelle cellule pacemaker del cuore, sono stati identificati sia i canali HCN1 che HCN4, e le cinetiche di attivazione, la sensibilità al CN e la dipendenza dal voltaggio della corrente Ih sono intermedie tra quelle dell'HCN1 e del HCN4. La corrente Ih nei neuroni CA1 ippocampali ha cinetiche di attivazione e sensibilità all'AMP ciclico intermedie tra HCN1 e HCN2, suggerendo che i canali naturali sono etromerici. Un'ulteriore complessità è aggiunta dalla possibile interazione di proteine accessorie, come le isoforme del peptide MinK-simile con i canali HCN o EAG per formare correnti Ih o correnti macroscopiche specifiche, come Ikx nei bastoncelli della retina. L'interazione con altre proteine può spiegare l'indirizzamento selettivo dei canali HCN a specifici compartimenti cellulari. Il gating, cioè il meccanismo molecolare che causa la transizione tra lo stato aperto e chiuso nei canali CNG e HCN sarà studiato dalla UdR della SISSA-Torre e dalla UdR-Milano.

I CANALI HCN NELLA RETINA
Ci sono anche evidenze che mostrano come i canali HCN1 siano coinvolti nel processamento dell'informazione visiva. E'stato osservato che sommministrazione di bloccanti organici di correnti attivate da iperpolarizzazione (Ih) nei soggetti umani causa una varietà di disturbi visivi soggettivi che spesso prendono la forma di fosfeni, immagini sfocate o effetti stroboscopici, che possono esere interpretati come una riduzione del livello di cornice della visione. Registrazioni ERG condotte in modelli animali indica che i bloccanti Ih intaccano il guadagno dipendente dalla frequenza nel processamento dei segnali tra i bastoncelli e le cellule bipolari (Gargini et al 1999) suggerendo che la soppressione delle Ih nei bastoncelli e/o cellule bipolari intacchi l'acutezza temporale della visione. L'espressione dei canali HCN1 nei bastoncelli della retina di mammifero (Moosmang et al., 2001; Demontis et al., 2002) e la somiglianza della corrente nativa Ih dei bastoncelli con quella generata dal canale omomerico HCN1 nelle cellule HEK293, suggerisce un coinvolgimento di questa isoforma nel controllo della risoluzione temporale della visione. Studi sulle proprietà di amplificazione passa banda dei bastoncelli di mammifero (Demontis et al.,1999) hanno mostrato che il controllo Ih di queste cellule migliora la risoluzione temporale della risposta visiva ma hanno anche suggerito che siano richiesti ulteriori amplificazioni passa banda per spiegare l'esecuzione finale temporale del sistema visivo. Sembra ragionevole assumere che canali HCN, la cui composizione di isoforme resta da valutare, siano espressi nei neuroni post-sinaptici come ulteriore stadio di elaborazione della risoluzione temporale della risposta visiva. Specificatamente, certi aspetti dell'acutezza temporale visiva richiederebbero l'espressisone di isoforme di HCN con specifiche proprietà di controllo dell'apertura del canale e modulatorie. Il ruolo dei canali HCN nel processamento visivo nella retina sarà studiato dall'UdR di Pisa.

I CANALI HCN NELLE RETI NEURALI
L'attività nelle reti neurali si propaga grazie alla conduzione dei potenziali d'azione lungo le fibre nervose. Tra i canali che contribuiscono alla modulazione della eccitabilità neuronale e della forza sinaptica il nostro interesse e' focalizzato sulla famiglia dei canali HCN, recentemente clonati. Questi canali sono coinvolti nel controllo dell'eccitabilita' e adattabilita' cellulare, e nella modulazione della forza sinaptica (Beaumont& Zucker 2000; Mellor et al 2002), delle funzioni ritmiche(Clapham 1998). Nonostante il loro ruolo essenziale, le informazioni a nostra disposizione sulla loro distribuzione nei dendriti, corpo cellulare e terminazioni nervose sono largamente incomplete, così come i dati sul loro ruolo nei processi di trasmissione ed integrazione sinaptica. Questo progetto mira a studiare la distribuzione dei canali ionici nelle sinapsi e nei dendriti ippocampali, e a identificare il loro ruolo funzionale nel contesto dell'attivita' sinaptica e nelle variazioni da essa dipendenti, quali la LTP (Bliss & Collingridge 1993; Mellor et al 2002) ed il reclutamento di sinapsi silenti. Analizzeremo altresi' i meccanismi che controllano la loro espressione, il loro avvicendamento e la loro localizzazione subcellulare.

STRUTTURA DEI CANALI IONICI
Molte proprietà dei canali ionici sono difficili da evidenziare in assenza di dati strutturali ad alta risoluzione. La struttura di uno dei suoi membri, un canale procariotico del K+(KcsA), rivela aspetti strutturali che probabilmente sono condivise da tutti i membri della famiglia (Doyle at al., 1998, MacKinnon et al., 1998). La struttura recentemente pubblicata del canale eucariotico del Cl- ClC (Dutzler et al., 2002) ha posto le basi per la comprensione dei principi di selettività ionica che possono essere applicati a tutta la famiglia dei canali anionici. Recentemente utilizzando cristallografia a raggi X è stata determinata la struttura ad alta risoluzione di due canali correlati appartenenti alla famiglia della aquaporina (AQPs) - il canale batterico per il glicerolo GlpF e l'aquaporina-1 umana. I meccanismi meccanosensoriali di base sono stati elucidati in seguito alla determinazione strutturale del canale ionico meccanosensibile dei procarioti MscL. I domini idrosolubili dei canali ionici sono più appetibili per gli studi di diffrazione ai raggi X, contrariamente alle proteine integrali di membrana che sono più difficili da cristallizzare. Di particolare rilevanza per il presente progetto e' la recente determinazione della struttura molecolare del C-linker e del dominio legante i nucleotidi ciclici del canale HCN2 (Zagotta et al 2003).

MODELLI MOLECOLARI E CHIMICA COMPUTAZIONALE
La costruzione di modelli in base alla struttura tridimensionale di proteine omologhe è attualmente il metodo più affidabile per ottenere informazioni strutturali su proteine per le quali non ci sono dati sperimentali diretti disponibili (Chothia et al. 1986; Sander et al. 1991). Alla base della modelizzazione per omologia c'è l'osservazione che le strutture 3D sono meglio conservate durante l'evoluzione della sequenza primaria delle proteine (Vriend et al. 1991; Russel et al. 1992). La costruzione di modelli per omologia è un processo a più stadi che si può riassumere nei seguenti passaggi: i.- riconoscimento dello stampo, ii- allineamento; iii- generazione dello scheletro; iv- generazione delle anse; v- generazione delle catene laterali; vi- ottimizzazione del modello complessivo; verifica del modello mediante ripetizione opzionale dei precedenti passaggi. Il nocciolo della chimica computazionale utile per la comprensione della relazione tra struttura e funzione delle proteine è costituito dalla dinamica molecolare (MD). Questo campo emergente normalmente distingue tra simulazioni MD classiche, basate sulla meccanica classica, e simulazioni ab initio basate su soluzioni approssimate delle equazioni di Schroedinger. Le simulazioni MD classiche richiedono una conoscenza a priori di potenziali appropriati che descrivano le differenti interazioni atomiche, mentre le simulazioni ab initio no. In una simulazione MD classica, si ottiene l'evoluzione del sistema, ad es. della proteina considerata, usando la seconda legge di moto di Newton. Lo sviluppo combinato della tecnologia dei supercomputer, degli algoritmi di parallelizzazione (Lim et al. 1997), dei campi di forze (Cornell et al. 1995; Jorgensen et al. 1996) e di tecniche di risparmio di tempo, permette oggi la simulazione di complessi sistemi biologici in specifici solventi fino ad alcuni ns e con maggiore accuratezza. La principale limitazione della dinamica molecolare classica, consiste nell'esatta computazione delle energie potenziali V, che dipendono solitamente da una serie di paramentri tipici di ciascun atomo. L'insieme dei potenziali e parametri è conosciuto come il campo di forza (force field FF). Finora sono stati sviluppati molti FF, come CHARMM, AMBER, GROMOS e SYBYL. Tuttavia, poichè gli effetti della polarizzazione non sono ancora stati compresi, questi FF non possono descrivere correttamente processi per i quali la polarizzazione gioca un ruolo importante; inoltre i FF non permettono di seguire l'evoluzione chimica del sistema ad es. la formazione e rottura dei legami, e fenomeni di trasferimento protonico. Questo tipo di fenomeni può essere studiato in modo adeguato con il metodo di Car-Parrinello (Car et al. 1985). Questo approccio permette di svolgere simulazioni MD indipendenti dai parametri, nelle quali tutte le interazioni sono calcolate direttamente mediante un metodo di calcolo della struttura elettronica, noto come teoria del funzionale densita' ab initio. Il medodo CP è stato applicato a diversi problemi biochimici e farmaceutici. <<<