RICERCA ITALIANA     

Analisi dell'espressione genica in condizioni di stress ossidativo

Università degli Studi del Sannio di Benevento

Abstract

L'omeostasi cellulare si realizza attraverso una varietà di meccanismi la cui alterazione rappresenta uno stress per la cellula. Citochine, fattori di crescita o episodi di ischemia/riperfusione inducono la produzione di specie reattive di ossigeno (ROS) che vanno ad ossidare macromolecole biologiche quali lipidi, proteine e DNA. Le cellule attivano un complesso sistema di difesa tendente a ridurre la produzione di ROS o a inattivarli, nonchè altre vie che normalmente operano nella trasduzione di segnali extracellulari. Tra queste viene attivata anche la via di NFkB. Alte quantità di ROS inducono una kinasi specifica che fosforila la molecola inibitoria IkB che viene degradata dal proteosoma. NFkB migra nel nucleo e attiva geni della proliferazione e della risposta immunitaria. Unitamente a queste vie, vengono stimolati anche geni con effetti protettivi tra cui i Peroxisome Proliferator Activated Receptors (PPAR), appartenenti alla superfamiglia dei recettori nucleari. Esistono tre isoforme di PPAR, ognuna in grado di legare molecole specifiche con uno specifico profilo di espressione genica. La isoforma gamma partecipa al differenziamento adipocitario e epiteliale. Recentemente, si è ipotizzato che una delle azioni protettive di PPAR gamma si esplichi antagonizzando la via di NFkB con meccanismi molecolari ancora non del tutto noti. Un altro gruppo di proteine protettive in condizioni di stress ossidativo è quello coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi del ferro. Il ferro, infatti, può avere effetti tossici e la sua omeostasi viene perciò regolata dalla ferritina, dalla transferrina, dal recettore della transferrina (TfR), dal trasportatore di metalli divalenti (DMT1) e dalle IRPs. Le Iron Regulatory Proteins o proteine regolatrici del ferro (IRP1 e 2) riconoscono sequenze dette Iron Responsive Elements (IREs) presenti nelle regioni 5' o 3' non tradotte degli mRNA codificanti per il TfR, la ferritina e DMT1, regolandone la traducibilità. Anche il gene codificante per la subunità H della ferritina subisce variazioni dell'espressione genica in condizioni di stress ossidativo. La ferritina come proteina di deposito del ferro intracellulare può agire sia come sorgente di ferro libero che come agente citoprotettivo in quanto chela il ferro libero in forma non tossica e disponibile grazie alla sua attività ferro-ossidasica. In miocardiociti l'incremento della ferritina H diminuisce il pool labile del ferro e quindi gli effetti degenerativi e pro-apoptotici dei ROS, probabilmente mediante variazioni trascrizionali. E' noto che fra i fattori di regolazione ci sono NFY e Sp1. In particolare, NFY interagisce con CBP/p300 un coattivatore della trascrizione capace a sua volta di interagire con altri fattori a volte in maniera mutualmente esclusiva. Questo progetto di ricerca si propone di studiare alcuni aspetti della risposta cellulare allo stress ossidativo. In particolare si propone di investigare le relazioni fra le vie di trasduzione del segnale regolate dai PPARs e da NFkB, di stabilire l'esistenza di interferenze e di chiarire i meccanismi molecolari che le sottendono. Si propone di identificare quelle specie proteiche che vanno incontro a variazioni quantitative e qualitative, di isolarle e di determinanrne la sequenza primaria al fine di risalire ai rispettivi cDNAs e geni. Si propone di studiare la regolazione dell'omeostasi del ferro in risposta a ipossia/riperfusione in sistemi in vitro e in modelli in vivo. Si propone di studiare gli effetti dell'acido ossalomalico e degli estrogeni e la relazione con il metabolismo del ferro. Infine, si propone di analizzare i rapporti fra ROS e espressione dei geni della ferritina H e L in particolare in cardiomiociti sottoposti a stress ossidativo e di studiare il ruolo svolto dai fattori NFY e Sp1. Dal momento che essi regolano anche altri geni, si propone di verificare se tale modulazione possa avere un ruolo protettivo nei confronti dello stress ossidativo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Vittorio COLANTUONI Università degli Studi del SANNIO di BENEVENTO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Gli obiettivi di questo progetto di ricerca sono quelli di chiarire i meccanismi di regolazione dell'espressione genica in risposta allo stress ossidativo. A questo scopo verranno utilizzati diversi tipi di cellule in coltura, cellule primarie di origine neuronale e gliale nonché miocardiociti e un modello in vivo di ischemia/riperfusione.
Gli obiettivi specifici dell'Unità n.1 sono i seguenti:
1. Analizzare le interazioni e/o possibili interferenze fra la via di trasduzione di NFkB e quella dei PPARs, identificare i partners coinvolti e i meccanismi molecolari che le sottendono in cellule di origine intestinale e muscolare.
2. Riconoscere le proteine che sono qualitativamente e quantitativamente modificate nelle condizioni sperimentali, determinare eventuali loro modificazioni e complessi macromolecolari in cui sono presenti. Una volta determinata la loro sequenza primaria, si isoleranno i cDNAs e i geni corrispondenti. Dall'analisi strutturale e funzionale di questi ultimi si potrà chiarire il loro ruolo nella risposta allo stress ossidativo.
Gli obiettivi specifici dell'Unità n.2 sono i seguenti:
1. Analizzare i meccanismi molecolari di regolazione del metabolismo del ferro durante l'ipossia e la successiva riossigenazione con particolare riferimento all'attività ed espressione delle Iron Regulatory Proteins (IRP1 e IRP2), all'espressione di ferritina e dei trasportatori intracellulari di ferro (recettore della transferrina e DMT1) in cellule di origine neurale, cardiaca, dell'epitelio alveolare ed intestinale, ed in vivo, mediante un modello di occlusione permanente di arteria cerebrale (pMCAO) o transiente di arterie intestinali.
2. Analizzare gli eventuali effetti di protezione cellulare dai danni ossidativi che si generano durante l'ipossia/riossigenazione nei suddetti modelli sperimentali da parte dell'acido ossalomalico e degli estrogeni.
Gli obiettivi specifici dell'Unità n.3 sono i seguenti
1. Verificare se lo stress ossidativo è in grado di modificare la capacità di NFY di legare CBP/p300 e quindi se il complesso NFY/p300 è capace di reclutare sul promotore coattivatori (c-Jun, pCAF), o repressori (E1A).
2. Valutare se pCAF possa svolgere un ruolo rilevante nella risposta allo stress ossidativo in diversi tipi cellulari e se la sua attività di acetilazione degli istoni possa essere modificata nelle condizioni sperimentali utilizzate. Questi effetti potrebbero spiegare la diversa risposta trascrizionale sia della ferritina H che di altri geni in differenti tessuti.
Le metodologie di studio descritte sono familiari a tutti i gruppi partecipanti al progetto. I sistemi sperimentali prescelti sono in gran parte già utilizzati o sono di nuova acquisizione. Le tecnologie innovative verranno messe a punto nei singoli laboratori e successivamente rese disponibili a tutte le unità del progetto così come i protocolli sperimentali, i reagenti e i materiali della ricerca, in modo da favorire e rendere più rapido il raggiungimento dei risultati. L'omogeneità dei modelli sperimentali proposti consentirà di analizzare gli aspetti diversi descritti dalle singole unità operative in uno stesso contesto fornendo un valore aggiunto importante all'intero progetto. <<<

Risultati parziali attesi

Unità 1
Delucidazione delle relazioni fra PPAR e NFkB e dei meccanismi responsabili della interferenza trascrizionale e/o dell'interazione fisica fra le due molecole in condizioni di stress ossidativo in diversi tipi cellulari.
Identificazione delle regioni dei due fattori che partecipano all'interazione e di possibili altri partners coinvolti.
Unità 2
Comprensione dei meccanismi di regolazione del metabolismo del ferro in differenti istotipi cellulari in condizioni di stress ossidativo indotto da ipossia e successiva riossigenazione.
Comprensione degli effetti dell'acido ossalomalico sull'attività delle proteine regolatrici del ferro (IRPs) e sulla biosintesi di ferritina durante l'ipossia e successiva riossigenazione al fine di una strategia terapeutica antiossidante
Unità 3
Delucidazione degli effetti dello stress ossidativo sulla trascrizione del gene per la ferrtina H.
Riconoscimento del ruolo che i fattori trascrizionali Sp1 e NF-Y svolgono nella risposta allo stress ossidativo.Unità 1
Identificazione delle specie proteiche che vanno incontro a modificazioni qualitative e quantitative dopo stress ossidativo, loro isolamento e determinazione della sequenza aminoacidica.
Analisi di librerie per isolare i cDNAs e i geni corrispondenti e successiva loro caratterizzazione allo scopo di studiare il loro ruolo nella risposta allo stress ossidativo.
Unità 2
Comprensione dei meccanismi di regolazione del metabolismo del ferro in due modelli di ischemia (permanente e transiente) in vivo ottenuti in ratti sottoposti ad occlusione di arterie cerebrali ed intestinali.
Comprensione dell'effetto citoprotettivo degli estrogeni in vari tipi di cellule durante ipossia e successiva riossigenazione e la correlazione con il metabolismo del ferro.
Unità 3
Delucidazione dei rapporti fra NFY e CBP/p300 nella regolazione di vari geni in risposta allo stress ossidativo.
Valutazione del ruolo protettivo della ferritina H sottoposta a modulazione da parte di varie sostanze note essere induttori della trascrizione del suo gene. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'omeostasi cellulare si realizza attraverso una varietà di meccanismi che assicurano il mantenimento delle condizioni ottimali ad un determinato stato fisiologico. Alterazioni di questo delicato e fine meccanismo di regolazione rappresentano una condizione di stress che porta all'attivazione di diversi processi: dalla morte cellulare programmata, alla stimolazione di fenomeni infiammatori, alla proliferazione fino alla trasformazione neoplastica della cellula stessa.
Uno dei principali stimoli in grado di alterare l'omeostasi cellulare è lo stress ossidativo (1, 2). L'esposizione di una cellula a stimoli esogeni quali citochine, radiazioni ultraviolette, agenti chemioterapici, ipertermia, fattori di crescita o ischemia/riperfusione determina la produzione di alti livelli di specie reattive di ossigeno (ROS). I ROS si formano già in condizioni normali e in quantità costanti all'interno delle cellule come prodotti del metabolismo e come tali svolgono un ruolo importante nella trasduzione di segnali extracellulari. La loro produzione può essere anche catalizzata dal ferro (reazione di Fenton) attraverso il trasferimento degli elettroni dal Fe 2+/Fe3+ (3, 4). I ROS, d'altro canto, risultano particolarmente dannosi quando vengono prodotti ad alte concentrazioni perchè alterano il normale equilibrio redox della cellula generando uno stato di stress ossidativo (1, 2). Essi, infatti, tendono a ossidare molecole bersaglio quali lipidi, proteine e il DNA sia nucleare che mitocondriale. In risposta a condizioni di stress ossidativo, la cellula attiva una serie di processi, enzimatici e non, tesi a bloccarne la produzione o a inattivarli; tra quelli enzimatici vanno ricordati la superossido dismutasi (SOD), la glutatione perossidasi e la catalasi. Lo stress ossidativo determina anche l'attivazione di una serie di vie di trasduzione di segnali quali le ERK, la Jun Kinasi, p38 e AKT, nonché l'attivazione della via di NFkB e quella di p53. Queste vie già operano nella cellula e ne regolano la risposta a stimoli di crescita e di metabolismo. La loro induzione in condizioni di stress comporta per alcune il prolungamento della vita o sopravvivenza cellulare, mentre per altre la morte cellulare programmata, con numerose eccezioni a questi concetti generali. Tra le vie attivate da condizioni di stress ossidativo e sulla quale abbiamo focalizzato la nostra attenzione è quella di NFkB. Si tratta di un fattore dimerico che in condizioni di quiescenza cellulare è localizzato nel citoplasma complessato con una molecola inibitoria detta Ikb (5, 6). La formazione di elevate quantità di ROS attiva una kinasi specifica, detta IKK, che va a fosforilare Ikb determinando la sua degradazione da parte del proteosoma. NFkB trasloca nel nucleo e interagisce con sequenze responsive localizzate nelle regioni regolatrici. I geni bersaglio che vanno incontro a stimolazione della trascrizione svolgono funzioni importanti nel ciclo cellulare, nella sopravvivenza cellulare e nell'attività antiapoptotica e soprattutto nella risposta immunitaria (5, 6). Unitamente all'attivazione di queste vie, vengono stimolate molte molecole che tendono a proteggere la cellula dagli effetti dello stress ossidativo. Tra queste ci sono i Peroxisome Proliferator Activated Receptor (PPARs). I PPARs, che appartengono alla superfamiglia dei recettori nucleari, sono fattori di trascrizione indotti dal ligando e formano eterodimeri con RXR, il recettore per l'isomero 9-cis dell'acido retinoico. Riconoscono elementi di sequenza nelle regioni regolatrici dei geni bersaglio, regolandone l'espressione. Esistono tre principali isoforme, alfa, beta/delta e gamma, ognuna in grado di legare sia molecole naturali che sintetiche e con profili di espressione genica distinti, in molti casi tessuto specifici (7, 8). L'isoforma gamma è espressa ad alti livelli nel tessuto adiposo, colon, muscolo e milza ed è coinvolta nel differenziamento adipocitario e in quello epiteliale. Regola anche geni del metabolismo del muscolo scheletrico e geni coinvolti nella trasmissione di segnali extracellulari. In generale, tutte e tre le isoforme dei PPAR condividono la capacità di controllare la risposta cellulare allo stress ossidativo (7, 8). Recentemente, si è ipotizzato che una delle azioni protettive svolte dai PPAR sia quella di antagonizzare la via di NFkB (9). E' stato suggerito che i ligandi di PPAR gamma modulino negativamente l'attività trascrizionale di NFkB (10) con un meccanismo molecolare non ancora del tutto chiarito. Tale inibizione potrebbe avvenire attraverso una modulazione della molecola inibitoria IkB (11-14); ovvero attraverso un' interferenza sull'attività di trascrizione mediata dall'interazione diretta di queste proteine. Altri suggeriscono che l'interazione diretta avvenga in presenza di altri fattori e che tale complesso impedisca l'attività in quanto si allontana dai normali siti di azione; altri, infine, che tale interazione possa avvenire solo se i due partners sono fosforilati (15, 16).
Un altro gruppo di proteine capaci di proteggere la cellula in condizioni di stress ossidativo sono quelle coinvolte nella percezione dei livelli, nel trasporto, nell'assorbimento e nel deposito del ferro. L'omeostasi del ferro deve essere mantenuta costante nella cellula perchè esso possa svolgere importanti funzioni e soprattutto per prevenire i suoi effetti tossici (17). Questa regolazione viene esplicata dalla ferritina, dalla transferrina, dal recettore della transferrina (TfR), dal trasportatore di metalli divalenti (DMT1) e dalle proteine regolatrici del ferro (IRPs). Le Iron Regulatory Proteins (IRP1 ed IRP2) sono proteine citosoliche che legano specifiche sequenze, dette Iron Responsive Elements (IREs), localizzate nella regione 5' o 3' non tradotta degli mRNA codificanti per TfR, per la ferritina e DMT1. Nel caso della ferritina, il legame delle IRPs alla sequenza IRE localizzata nella regione 5' non tradotta del suo mRNA, blocca la traduzione, determinando una diminuzione della proteina sintetizzata. Al contrario, quando le IRPs si legano alla sequenza IRE localizzata nella regione 3' non tradotta del mRNA del TfR, la traduzione viene stimolata perchè non viene degradato l' mRNA (18). Nell'ambito delle modificazioni cellulari indotte dallo stress ossidativo è stata inclusa recentemente anche la variazione dell'espressione del gene per la ferritina, in particolare del gene che codifica per la subunità H (19, 20). La ferritina è la proteina di deposito del ferro intracellulare e può agire nel sistema ROS-ferro libero sia come sorgente di ferro che come agente citoprotettivo nei confronti dei ROS in quanto chela il ferro libero in una forma non tossica e rapidamente disponibile, anche grazie all'attività ferro-ossidasica della catena H (20). In cellule eritroidi e in cardiomiociti l'incremento di ferritina H diminuisce il pool labile di ferro e quindi gli effetti degenerativi e pro-apoptotici dei ROS (20, 21). Le basi molecolari dell'aumentata espressione della ferritina non sono a tutt'oggi completamente definite anche se è stato ipotizzato un suo incremento trascrizionale. Tra i vari fattori che sono responsabili della trascrizione del gene della catena H è stata identificata una "CAAT binding protein" (NFY) che si lega alla regione prossimale del promotore stesso. E' questa una proteina ubiquitaria coinvolta nella regolazione di diversi geni e costituita nella sua forma attiva in grado di legare il DNA da tre subunità A, B e C (22-25). L'elemento distale del promotore contiene una sequenza in grado di riconoscere e di legare il fattore trascrizionale Sp1, anch'esso ubiquitario. NFY regola la trascrizione del gene legando nella sua regione centrale CPB/p300 un importante coattivatore a sua volta capace di interagire con una serie di altri fattori trascrizionali in maniera a volte mutualmente esclusiva (26-29).
Questo progetto di ricerca si propone di chiarire alcuni aspetti della risposta cellulare allo stress ossidativo.
In particolare, si propone di:
1. Investigare la relazione fra le vie di trasduzione regolate dai PPAR e da NFkB, di stabilire le eventuali interferenze e soprattutto analizzare i meccanismi molecolari che le sottendono. Inoltre, si propone di identificare possibili nuovi ligandi dei PPAR e peptidi con attività inibitoria specifica nei confronti di NFkB, capaci di bloccare o ridurre le conseguenze cellulari dello stress ossidativo.
2. Studiare la regolazione dell'omeostasi del ferro in risposta all'ipossia ed alla successiva riperfusione, in diversi tipi di cellule. Inoltre, allo scopo di porre le basi per lo sviluppo di una terapia antiossidante della degenerazione cellulare, si propone di studiare gli effetti dell'acido ossalomalico e quelli antiossidanti degli estrogeni e l'eventuale correlazione con il metabolismo del ferro.
3. Analizzare l'espressione dei geni H ed L della ferritina in diversi tipi di linee cellulari e in colture primarie di cardiomiociti sottoposte a stress ossidativo, con particolare riguardo al ruolo dei fattori trascrizionale NFY e Sp1. Dal momento che queste proteine sono coinvolte nella regolazione di molteplici geni, si propone di analizzare la loro modulazione e quella dei geni da esse regolati. Infine, essendo oggi note alcune molecole in grado di modulare la trascrizione del gene della ferritina H, si propone di verificare se tale modulazione possa svolgere un ruolo protettivo nei confronti dei danni indotti da ROS. <<<