RICERCA ITALIANA     

Influenza della variabilità del DNA mitocondriale sulla funzionalità mitocondrio-cellulare e sue conseguenze sull'invecchiamento nell'uomo.

Università della Calabria

Abstract

Negli ultimi venti anni numerosi studi hanno evidenziato l’influenza della variabilità polimorfica del DNA mitocondriale (mtDNA) sull’invecchiamento e su numerosi tratti complessi ad insorgenza tardiva.
Ciò è dovuto al ruolo centrale del mitocondrio in una serie di processi cruciali per la cellula. Infatti i mitocondri generano la gran parte dell'energia cellulare attraverso il processo della Fosforilazione Ossidativa (OXPHOS); Inoltre essi rappresentano i regolatori centrali dell'apoptosi, interagiscono con i pathways della risposta cellulare allo stress per regolare le funzioni cellulari, la sopravvivenza e la proliferazione. Tuttavia essi sono anche la maggiore fonte di Specie di Ossigeno Reattive (ROS), un prodotto di scarto della OXPHOS. Tali molecole reattive possono danneggiare tutti i componenti di una cellula come le membrane, le proteine ed il DNA portando ad un progressivo decadimento della cellula. Questi processi, così come tutti quelli che coinvolgono i mitocondri, sono regolati soprattutto dalle proteine codificate da geni nucleari, ma anche da proteine codificate dal mtDNA. Il coordinamento tra questi due genomi, il cosiddetto cross talk nucleo mitocondri, sembra essere la chiave per capire il ruolo della variabilità del DNA mitocondriale nei tratti complessi, visto che diverse evidenze dimostrano che tale cross talk è influenzato dai polimorfismi del mtDNA.
La variabilità del DNA mitocondriale è stata studiata a fondo in molte popolazioni umane. Tali studi hanno evidenziato un alto grado di variabilità ed un grande numero di aplotipi diversi. Gli aplotipi di mtDNA possono essere raggruppati in clusters (gli aplogruppi), all'interno dei quali tutti gli aplotipi condividono una origine comune testimoniata da mutazioni comuni condivise.
Noi proponiamo un progetto di Ricerca teso ad investigare l'influenza della variabilità del DNA mitocondriale sulle funzioni mitocondriali e cellulari. Ciò significa che cercheremo di evidenziare come ed in che misura la funzionalità dei mitocondri e della cellula è influenzata dai polimorfismi dell'mtDNA ereditari. Inoltre, poiché studi recenti hanno evidenziato che, durante l'invecchiamento, mutazioni somatiche puntiformi possono avvenire in maniera tessuto-specifica nella regione di controllo del mtDNA portando ad un riarrangiamento della Origine di Replicazione, il nostro progetto si propone anche di verificare come è geneticamente controllata la specificità di tali mutazioni e quali sono le conseguenze di tali mutazioni sulla funzionalità mitocondriale e cellulare. Al fine di raggiungere tali obiettivi verranno utilizzate delle linee cellulari modificate, i cibridi. Tali cellule sono ottenute trapiantando mitocondri esogeni in cellule che sono state private dei propri mitocondri. Nel nostro caso, costruiremo diverse linee di cibridi a partire da un singolo stock di cellule private di mitocondri, ed in ogni linea di cibridi verranno inseriti mitocondri contenenti mtDNA appartenente ad un diverso cluster di aplotipi mitocondriali. Ci si aspetta che, tenendo costante il genoma nucleare, le eventuali differenze che si osserveranno nella funzionalità della cellula potranno essere ascritte ai polimorfismi del mtDNA. L'indagine sarà focalizzata sui nove aplogruppi che rappresentano il 95% delle molecole di mtDNA Europee. Per quanto riguarda le mutazioni somatiche età correlate, focalizzeremo la nostra attenzione sulla transizione C150T che è stata identificata nei leucociti. Tale mutazione verrà ricercata in coppie di consanguinei per verificare come i livelli di eteroplasmia dei due alleli sono correlati ai polimorfismi nucleari. Inoltre, cellule che presentano diverse proporzioni dei due alleli (150C and 150T) saranno immortalizzate per verificare in che modo la transizione C150T altera la funzionalità mitocondriale e cellulare. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giuseppe PASSARINO Università della CALABRIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo del presente progetto è di comprendere l'influenza della variabilità del DNA mitocondriale (mtDNA) sulle funzioni mitocondriali e cellulari in relazione all'invecchiamento. Tale obiettivo generale implica che si cercherà di comprendere in che modo ed in che misura la funzionalità dei mitocondri e dell'intera cellula sono influenzati dalla variabilità ereditaria e dalla variabilità eteroplasmica acquisita durante l'invecchiamento mediante mutazioni somatiche puntiformi nella regione di controllo.
Per quanto riguarda la variabilità ereditaria, verranno studiati i nove gruppi di aplotipi di mtDNA (gli aplogruppi H, V, W, X, T, I, J, K, U) che rappresentano oltre il 95% delle molecole di mtDNA nella popolazione Europea. E' già stato evidenziato che le mutazioni che definiscono tali aplogruppi possono influenzare dei fenotipi complessi (come l'invecchiamento) e la predisposizione a condizioni patologiche (come il diabete, il cancro e le malattie Cardiovascolari). E' quindi verosimile che esse siano in grado di modulare in maniera diversa quei processi in cui il mtDNA è coinvolto. In modo particolare sembra che esse portino ad una diversa modulazione del cross talk tra nucleo e mitocondri, attivando con specifica efficienza diverse parti del genoma umano in varie situazioni di stress interno ed esterno. Poiché tale cross talk è anche influenzato dai polimorfismi del genoma nucleare, saranno costruite delle cellule modificate (i cibridi) nelle quali, dopo avere ottenuto la deplezione completa dei mitocondri, saranno inseriti mitocondri estranei contenenti molecole di DNA appartenenti ai diversi aplogruppi. Nove diverse linee, una per ogni aplogruppo, verranno costruite. Ci si aspetta che, mantenendo costante il genoma nucleare, le differenze che si osserveranno nella funzionalità mitocondriale e cellulare possano essere considerate come dovute alla variabilità dell'mtDNA. In particolare, nelle linee cellulari ottenute si procederà a quantificare l'mtDNA; a correlare l' mtRNA con il mtDNA, e a correlare l'espressione dei geni mitocondriali e nucleari; ad analizzare mediante analisi citofluorimetrica la diversa sensibilità rispetto ad agenti che possono modulare o alterare la massa mitocondriale, il potenziale di membrana, la vitalità e l'apoptosi; ad analizzare l'espressione di circa 10000 geni diversi mediante l'utilizzo di microarrays. Tutte queste misure, che saranno condotte con le più aggiornate e sofisticate tecniche di Biologia cellulare e di Biologia Molecolare, daranno un quadro chiaro della funzionalità mitocondriale e cellulare e del coordinamento tra genoma nucleare e mitocondriale.
Per ciò che riguarda la variabilità età correlata acquisita mediante mutazioni somatiche puntiformi della regione del Dloop, ci si soffermerà sulla transizione C150T. Questa mutazione, che è raramente osservata come polimorfismo ereditario, è stata trovata nelle cellule leucocitarie di soggetti anziani. E' importante notare che questa mutazione, che porta ad un riarrangiamento della origine di replicazione del mtDNA, è stata osservata in eteroplasmia ma le proporzioni tra i due diversi alleli è determinata geneticamente dal genoma nucleare. Inoltre è stato osservato che gli individui con una più alta percentuale di molecole mutate hanno una più alta probabilità di diventare centenari. Queste osservazioni suggeriscono chiaramente che nel processo di invecchiamento si ha una importante interazione tra nucleo e mitocondrio e tale interazione influisce sulla longevità. Nel presente progetto si cercherà di chiarire il controllo genetico sull'insorgenza e sull'accumulo della mutazione C150T, comparando i livelli di eteroplasmia in coppie di consanguinei che abbiano un antenato comune per via femminile o per via maschile. Inoltre verranno immortalizzate linee cellulari da leucociti di soggetti che presentano diverse proporzioni dei due alleli 150C e 150 T. Quindi si procederà all'analisi della trascrizione, della quantità totale di mtDNA e della replicazione cellulare. Infine verrà verificato se cellule con diverso grado di eteroplasmia rispondono diversamente allo stress ossidativo. <<<

Risultati parziali attesi

Ci si aspetta di analizzare circa 100 coppie di consanguinei con un antenato/a comune lungo la linea maschile o femminile. Inoltre ci si aspetta di realizzare linee cellulari in cui la mutazione C150T abbia differenti livelli di eteroplasmia.
Per quanto riguarda i cibridi ci si aspetta di realizzare un completo set di cibridi con mitocondri contenenti i diversi aplogruppi di mtDNA Europei. Infine ci si aspetta di mettere a punto le diverse misure che saranno poi realizzate nella fase 2.Per la fine della fase 2 del progetto ci si aspetta di aver realizzato:
i) l’analisi citofluorimetrica delle diverse linee cellulari in condizioni diverse per misurare la massa mitocondriale, il potenziale di membrana e la vitalità.
ii) La determinazione del numero di copie di DNA mitocondriale per cellula attraverso Real Time PCR.
iii) Analisi dell’espressione dei geni mitocondriali.
iv) Analisi dell’espressione di geni nucleari in relazione alle variazioni polimorfiche del DNA mitocondriale e funzionali del mitocondrio.
Infine, lo scopo del progetto è di comprendere meglio la relazione tra variablità mitocondriale (sia ereditaria che somatica) e la funzionalità cellulare. Quindi, per la fine della fase 2 ci si aspetta di ottenere i seguenti risultati:
1. definizione del controllo genetico della mutazione somatica età correlata C150T, e dei suoi effetti sulla funzionalità cellulare.
2. Definizione degli effetti dei diversi aplogruppi di mtDNA europei sul cross talk nucleo-mitocondri. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il genoma mitocondriale umano è formato da una molecola circolare, senza istoni di 16.569 paia di basi, presente in più copie in ciascun mitocondrio(1). Tale molecola è stata strettamente conservata per oltre mezzo miliardo di anni, e codificain ogni essere animale pluricellulare (vertebrato o invertebrato) finora studiato: i) 13 subunità necessarie per la fosforilazione ossidativa; ii) una componente per ciascuna delle due subunità ribosomali e iii) i 22 RNA di trasporto presenti nel mitocondrio. Gli esoni presenti sulla molecola hanno una disposizione molto compatta, senza introni. Il DNA mitocondriale (mtDNA) ha una capacità di riparazione limitata ed una tasso di fissazione delle mutazioni relativamente alto (2, 3).
A causa della sua ereditarietà uniparentale (esso è trasmesso solamente dalle madri), il mtDNA non va incontro alla ricombinazione e questo porta le linee mitocondriali a evolversi indipendentemente l'una dalle altre per accunulo sequenziale di mutazioni. Queste peculiarità hanno attirato l'attenzione dei genetisti di popolazione umana, che hanno estensivamente studiato la variabilità del DNA mitocondriale nelle popolazioni di tutto il mondo (4, 5, 6, 7). La variabilità polimorfica del DNA mitocondriale è stata studiata sia mediante analisi di restrizione dell'intera molecola (8,9) che mediante sequenziamento della segmento ipervariabile della regione di controllo, il Dloop (10,11). Queste analisi hanno dimostrato una altissima variabilità intrapopolazione ed interpopolazione, ed hanno evidenziato un grande numero di aplotipi. L'analisi filogenetica di queste linee di mtDNA ha permesso di scoprire che esse possono essere raggruppate in clusters (detti aplogruppi) nei quali tutti gli aplotipi condividono alcune mutazioni. In particolare, essi condividono le mutazioni ancestrali più antiche, acquisite prima dell'espansione degli aplogruppi (8, 12, 11). L'analisi degli aplogruppi ha permesso alcune importanti inferenze sulla storia evolutiva dell'uomo, ed ha portato alla definizione di linee di mtDNA popolazione specifiche che indicano l'Africa come area di origine delle diverse linee mitocondriali umane (6, 7, 13). In Europa, sono stati identificati nove diversi aplogruppi (H, U, T, I, J, K, V, W, X) che caratterizzano circa il 95% delle molecole di DNA(8).
Negli ultimi due decenni l'interesse degli studiosi per il DNA mitocondriale è notevolmente aumentato. Ciò era inizialmente dovuto alla scoperta di diverse mutazioni mitocondriali che causano diverse malattie di tipo degenerativo (14). In particolare, è stato evidenziato che le mutazioni del mtDNA possono provocare malattie estremamente gravi, in particolare a carico del sistema neuromuscolare. Per citarne alcune possiamo ricordare l'encefalomiopatia mitocondriale, l'acidosi lattica (una condizione che può comunque essere dovuta anche a trattamenti farmacologici di infezioni ), l'epilessia mioclonica, la malattia delle fibre rosse (ragged-red fibers disease : MERF), i sintomi simili all'infarto (15, 16, 17). Le mutazioni patogeniche alle posizioni 11778, 3460 e 14484, che riguardano diverse subunità del Complesso I della fosforilazione ossidativa, causano la morte cellulare dei gangli della retina e l'atrofia del nervo ottico nella Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON). Gli aplogruppi di mtDNA possono essere associati con particolari malattie come la sindrome di Wolfram, conosciuta anche come la sindrome DIDMOAD (diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy and deafness) ma anche alla LHON (19). Tuttavia, aldilà di tali mutazioni patologiche, recentemente sono stati individuati molti polimorfismi del mtDNA che concorrono a determinare la variabilità interindividuale in una serie di caratteri complessi, sia patologici (come disordini di tipo oftalmologico, malattie cardiovascolare , demenze) che fisiologici (come l'invecchiamento) (20, 21).
Il coinvolgimento del DNA mitocondriale in molti tratti complessi è dovuto al ruolo centrale del mitocondrio in numerosi processi cellulari. Infatti, nei mitocondri origina la maggior parte dell'energia della cellula mediante la fosforilazione ossidativa (OXPHOS); inoltre essi rappresentano il punto centrale della regolazione dell'apoptosi, interagiscono con i pathways della risposta cellulare allo stress per regolare le funzioni cellulari, la sopravvivenza e la proliferazione (2, 22). Tuttavia essi sono anche la maggiore fonte di specie Reattive dell'ossigeno (ROS) (23, 24), un prodotto di scarto della OXPHOS. Queste molecole reattive possono danneggiare le componenti cellulari quali le membrane, le proteine ed il DNA portando ad un decadimento complessivo della cellula. Per tale motivo da diverso tempo si considera che i ROS abbiano un ruolo importante nell'invecchiamento. Tale concetto rappresenta il core della cosiddetta teoria mitocondriale dell'invecchiamento che considera l'invecchiamento come dovuto al progressivo accumulo di mitocondri danneggiati dagli effetti dei ROS e dalla conseguente diminuzione del "budget energetico cellulare"(23). Con l'invecchiamento, infatti, i mitocondri producono meno ATP ed aumentano la produzione di ROS, a causa dell'aumento del metabolismo aerobico (25, 26). Questi processi, così come molti altri che coinvolgono i mitocondri, sono regolati principalmente da proteine codificate da geni nucleari ma anche da alcune proteine codificate dai geni mitocondriali. Il coordinamento tra questi due genomi, il cosiddetto cross talk nucleo mitocondri sembra essere la chiave per comprendere il coinvolgimento della variabilità del mtDNA nei tratti complessi, ed infatti diverse evidenze dimostrano che esso è influenzato dalle variazioni polimorfiche del mtDNA (22).
E' stato, per esempio, osservato che quando si ha una riduzione dell'OXPHOS, si produce un incremento dei ROS.Tale processo stimola una più alta trascrizione dei geni nucleari che codificano per enzimi detossificanti che sono in grado di riciclare i ROS (27).
Contemporaneamente, in uno studio indipendente, fu osservato che uno degli aplogruppi europei, l'aplogruppo J, è di gran lunga più frequente tra i centenari che tra i controlli (28). Poiché lo stesso aplogruppo J aumenta la capacità di alcune mutazioni di causare la Neuropatia ottica di Leber (LHON, 29), è stato proposto che le mutazioni che definiscono J (le quali si trovano nelle subunità coinvolte direttamente nella OXPHOS) abbassino il livello della OXPHOS, e mettono la cellula in una situazione si vulnerabilità in cui un'ulteriore mutazione (come le mutazioni LHON) ha più probabilità di essere patogena. D'altro canto, se la risposta dei geni nucleari stimolata dall'alta concentrazione di ROS è adeguata, un'OXPHOS con una bassa efficienza può divenire vantaggiosa e portare ad un più efficiente catabolismo dei ROS. Questo ha come conseguenza una migliore tasso di invecchiamento (30). In questo caso, quindi, il fenotipo finale dipende dall'interazione tra mtDNA, genoma nucleare ed ambiente.
Altri studi hanno evidenziato che nei soggetti con mtDNA di aplogruppo U, alcuni fattori genetici normalmente considerati come fattori di rischio (come l'allele APOE e4) sono neutrali (31).
D'altra parte, bisogna evidenziare che anche la variabilità del genoma nucleare può influenzare il mtDNA, anche in modi inattesi.
Studi longitudinali e cross section hanno evidenziato che possono verificarsi, con l'avanzare dell'età, alcune mutazioni somatiche tessuto-specifiche nella regione di controllo del Dloop. Queste mutazioni, che sono puntiformi e possono far cambiare l'origine di replicazione del mtDNA, sono quasi sempre in eteroplasmia, ma il rapporto tra il numero delle molecole mutate e di quelle non mutate sembra essere determinato geneticamente dal background genetico nucleare. Infatti, tale rapporto, ad una determinata età, è identico in gemelli monozigotici ma diverso in gemelli dizigotici o in individui non correlati (32, 33). E' stato inoltre osservato che gli individui con un più alta percentuale di molecole mutate hanno una probabilità maggiore di divenire centenari. Queste osservazioni indicano chiaramente che nell'invecchiamento si ha un'interazione tra nucleo e mitocondri e che tale interazione influenza la longevità.
Sebbene si accumulino sempre più dati sull'influenza della variabilità genetica sul cross talk nucleo-mitocondrio e sulla determinazione di un gran numero di tratti complessi, la biologia di tale cross talk è ben lontana dall'essere compresa. Certamente sembra essere un'impresa estremamente complessa. Infatti si è stimato che il "sistema mitocondriale", cioè l'insieme dei geni che cooperano alle funzione che coinvolgono il mitocondrio è costituito da più di 1000 geni ( 20). Quindi, la complessità dei caratteri che coinvolgono il mitocondrio riflette l'intricata serie di rapporti fisiologici e genetici che esiste tra il mitocondrio e il nucleo.
Per cercare di spiegare tale intricata rete di rapporti sono necessari dei modelli da laboratorio, che pemettano di osservare il cross talk nucleo-mitocondrio cambiando di volta in volta alcuni degli elementi del sistema mitocondriale. Recentemente topi che riproducono alcuni disordini con una base mitocondriale sono stati realizzati (20). Questo ha certamente migliorato la comprensione della fisiologia e della patofisiologia mitocondriale. In particolare è stato osservato che i topi knock out per alcuni geni nucleari che interferiscono con la OXPHOS, hanno uno sbilaciamento della produzione di ROS. Tale sbilanciamento porta, in questi topi, a diverse patologie. Nel complesso questi studi suggeriscono che malattie mitocondriali, cancro, ed invecchiamento posso essere visti come l'interazione di due fattori genetici: (i) l'eredità di un mtDNA deleterio e (ii) l'accumulo di mutazioni somatiche che causano il declino mitocondriale, l'aumento nella produzione di ROS e l'apoptosi (34). Tuttavia molto deve essere ancora fatto per capire come le variazioni polimorfiche del genoma mitocondriale umano possono influenzare la funzionalità mitocondriale e cellulare. A tale scopo gli strumenti più appropriati sembrano i cibridi, che sono delle cellule ingegnerizzate in cui sono introdotti mitocondri dall'esterno. Essi si ottengono dopo deplezione completa dei mitocondri di una linea cellulare, che viene poi ripopolata con i mitocondri di piastrine di donatori di sangue o di altre cellule enucleate. E' evidente che ciò consente di ottenere diversi ceppi di cibridi, ciascuno con un mtDNA di un certo aplotipo ma tutti con lo stesso genoma nucleare. Questa combinazione può rappresentare lo strumento giusto per capire come la variazione polimorfica del mtDNA influenza il "sistema mitocondriale", e di conseguenza la funzionalità del mitocondrio e della cellula.
Alcuni studi recenti sembrano confermare questa idea. E' stato dimostrato che le mutazioni LHON conferiscono uno stimolo pro-apoptotico e cellule cibride con mtDNA con e senza la mutazione 11778 sono state utilizzate per studiare in che misura tale stimolo è derivato dalla mutazione 11778 (36). In uno studio indipendente, utilizzando cibridi con differenti combinazioni di genomi nucleari e mitocondriali è stato possibile provare che una mutazione somatica che avviene nel Dloop dell'aplogruppo asiatico B è determinata dalla interazione tra polimorfismi nucleari e mitocondriali (37).
I cibridi sembrano quindi il miglior modello per studiare il ruolo dei differenti aplotipi di mtDNA nella fisiopatologia delle cellule normali e trasformate, ed è nostra intenzione utilizzare questo modello per studiare l'influenza delle variazioni del mtDNA sulle attività nucleari e mitocondriali. <<<